Infrarrojo Cercano (NIR) Luz aumenta la expresión de un marcador de la función mitocondrial en el ratón vestibular sensorial Epitelio

El objetivo general del siguiente experimento es investigar el posible impacto neuroprotector de la luz infrarroja cercana en el epitelio sensorial vestibular del ratón. Esto se logra mediante una aplicación transcraneal simple y a corto plazo de luz infrarroja cercana a los ratones en varias etapas de desarrollo. Como segundo paso, se diseccionan los laberintos óseos de los animales tratados, lo que permite aislar el epitelio sensorial vestibular.

A continuación, se mide la expresión del gen antioxidante de interés mediante R-T-P-C-R para evaluar el impacto del tratamiento en el rendimiento mitocondrial. Finalmente, se realiza una densitometría para evaluar el efecto de un breve tratamiento con luz infrarroja cercana en la expresión de genes antioxidantes específicos en ratones. La principal ventaja de esta técnica de tratamiento de infrarrojo cercano es que es sencilla y no invasiva, lo que permite un análisis fisiológico, molecular y conductual posterior al tratamiento.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la potencial neuroprotección del sistema vestibular periférico durante el envejecimiento normal, o hacia la mejora del rendimiento equilibrado después de una enfermedad o déficit vestibular. Dos o tres días antes de comenzar el experimento, afeitar el pelaje de las regiones de la cabeza y el cuello de cada ratón lo más cerca posible para evitar que vuelva a crecer el pelo del animal antes de completar el régimen de tratamiento. Para mantener el estado libre de patógenos de los animales, limpie los instrumentos con etanol al 70% entre cada afeitado.

Luego, el día del tratamiento para cada animal interno, levante al ratón en el extremo proximal de la cola y permita que se relaje en la palma de una mano para minimizar el estrés para los animales tratados con infrarrojo cercano. Para cada animal, sostenga un dispositivo LED de 670 nanómetros, a uno o dos centímetros de distancia del área afeitada, y encienda el dispositivo durante 90 segundos. Para el grupo simulado, repita el procedimiento de tratamiento de la misma manera, pero con el dispositivo apagado para el grupo bloqueado por infrarrojo cercano, trate a los animales de la misma manera que el grupo tratado con infrarrojo cercano, pero con el dispositivo cubierto con papel de aluminio.

Después de repetir los tratamientos para cada grupo a intervalos de 24 horas durante cinco días consecutivos, congele el líquido cefalorraquídeo artificial a base de glicerol recién preparado, o un líquido cefalorraquídeo en un congelador a menos 80 grados centígrados durante 45 minutos hasta que se forme una suspensión de hielo. Próximo. Para cada ratón, use una hoja de afeitar redondeada con el número 22 para hacer una incisión a lo largo de la piel sagital del cráneo, manteniendo el cerebro de la bóveda craneal y el aparato vestibular subyacente lo más fresco posible con aplicaciones regulares de LCR A helado sobre el tejido. A continuación, utiliza el brazo puntiagudo de unas tijeras de patrón estándar para hacer una pequeña incisión en el cráneo en Lambda y corta a lo largo de la sutura sagital.

A continuación, deslice suavemente un brazo de un URS poco profundo por debajo del hueso parietal, y luego asegure y tire del hueso parietal lateralmente y del hueso occipital posteriormente hasta que el cerebro quede expuesto. Luego, use una pequeña espátula de acero inoxidable para levantar el cerebro lejos de la fosa craneal anterior y media. Para exponer el nervio vestibular coclear, transecte el nervio para evitar tensiones innecesarias en los axones aferentes primarios que inervan directamente las células ciliadas vestibulares.

A continuación, extraiga el cerebro in toto y observe el laberinto óseo que contiene la cóclea y los órganos vestibulares periféricos en la fosa craneal media. Ahora haga dos pequeñas incisiones al lado de cada laberinto óseo y sostenga y tire del canal semicircular anterior lateralmente para extirpar toda la estructura. A continuación, sumerja inmediatamente el laberinto extirpado en un plato de disección que contenga la solución de líquido cefalorraquídeo A helada mientras se perfunde continuamente con carbógeno.

La parte más complicada de este procedimiento es obtener cantidades consistentes de tejido viable para cada animal; recomendamos practicar una observación cuidadosa e iluminación específica del tejido. A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, sujete el laberinto por la cóclea y utilice unas pinzas para fijar el tejido al fondo de la placa con unas pinzas finas y rectas. Rasque una pequeña abertura en el hueso por encima del canal semicircular anterior.

A continuación, extiende la mano inmediatamente por debajo del hueso y desplázala hacia afuera, alejándola del ULA para agrandar suavemente la abertura. Continúe de esta manera hasta que el utrículo y el pulso anterior y lateral estén expuestos. A continuación, utilice unas pinzas finas para levantar suavemente el utrículo y alejarlo del laberinto óseo hasta que se desprenda por completo.

Finalmente, agarre firmemente los órganos vestibulares entre la punta de las pinzas y colóquelos en lisis recién preparada. Tampón en un microtubo con tapa de rosca, gire suavemente las pinzas en el tampón para separar los órganos vestibulares. Luego, después de confirmar que las pinzas están libres de tejido bajo el microscopio estereoscópico, enrosque la tapa del microtúbulo e inmediatamente congele la muestra en nitrógeno líquido para comparar el impacto del tratamiento con infrarrojo cercano entre ratones jóvenes y mayores.

El ARN mensajero se invirtió y se transcribió en ADN complementario, luego se analizó la expresión de superóxido dismutasa antioxidante uno o SOD uno medido por densitometría, se observó un aumento significativo en la expresión de SOD uno normalizada por actina beta de más del doble en animales jóvenes, tratados con infrarrojo cercano en comparación con animales jóvenes tratados con simulacro y animales jóvenes bloqueados con infrarrojo cercano. Los animales más viejos tratados con el infrarrojo cercano también mostraron una regulación superior de más del doble de la sod uno en comparación con los animales más viejos bloqueados por el infrarrojo cercano. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar experimentos conductuales, moleculares o fisiológicos para responder preguntas adicionales como, ¿la luz infrarroja cercana aumenta la expresión de otros genes o proteínas en el epitelio sensorial vestibular?

¿O la luz infrarroja cercana mejora el rendimiento general del equilibrio de los ratones tratados?