Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar la inmunohistoquímica para visualizar las proteínas de interés. Para este ejemplo, IBA uno para microglial y panneuronal para neuronas. Esto se logra colocando primero las secciones preparadas en una solución de bloqueo para evitar la unión inespecífica.

Como segundo paso, los anticuerpos, que reconocen las dos proteínas diferentes de interés, se colocan en las secciones durante la noche. Las siguientes secciones se lavan y se incuban en anticuerpos secundarios para añadir marcadores fluorescentes a los anticuerpos primarios. Los resultados del doble marcaje pueden señalar tinciones microgliales dentro de los campos de las neuronas.

Por lo general, las personas que son nuevas en esta técnica tendrán dificultades al principio porque hay muchas variables que ajustar. La demostración de esta técnica estará hoy a cargo de Hazel May, estudiante de nuestro laboratorio. Para comenzar, fije y seccione cuidadosamente los cerebros de los roedores como se describe en el protocolo de texto adjunto, y luego guárdelos cuidadosamente a menos 80 grados Celsius hasta que los necesite.

Cuando esté listo para continuar con el protocolo, retire los portaobjetos del congelador y descongélelos a temperatura ambiente. Una vez descongelados, coloque los portaobjetos en una rejilla y lávelos tres veces en PBS durante cinco minutos cada uno. A partir de este punto, no dejes que las secciones se sequen.

Seque los bordes de los portaobjetos y haga un borde repelente a los líquidos alrededor del borde del portaobjetos con un bolígrafo para garantizar una cobertura uniforme del líquido y reducir los efectos de los bordes. A continuación, bloquee las secciones añadiendo 300 microlitros de suero en PBS a cada portaobjetos. El suero debe ser de la especie en la que se cría el anticuerpo secundario.

En este caso, se utilizó suero de burro. Asegúrese de que la solución de bloqueo se extienda hasta el borde del portaobjetos y cubra completamente el tejido. Para evitar manchas desiguales, coloque los portaobjetos en una cámara de humedad para incubar a temperatura ambiente durante una hora.

Durante la incubación, prepare los anticuerpos primarios, diluya el anticuerpo IBA uno a 5.000 y el anticuerpo panneuronal uno a 500 en una mezcla de suero de burro al 1%. En PBS, retire la solución de bloqueo y agregue 300 microlitros de la solución de anticuerpos, que contiene ambos anticuerpos de interés. Además, prepare tres portaobjetos de control.

Agregue 300 microlitros de IVA, una dilución sola a un portaobjetos, 300 microlitros de dilución de anticuerpos panneuronales solo a un segundo portaobjetos y 300 microlitros de suero de burro al 1% en PBS. En un tercer portaobjetos, coloque todos los portaobjetos en una cámara de humedad e incubelos durante la noche a cuatro grados centígrados a la mañana siguiente. Lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos cada uno.

Prepare la mezcla de anticuerpos secundarios fluorescentes diluyendo ambos de uno a 250 en suero de burro al 1% en PBS. Agregue 300 microlitros de la mezcla en cada portaobjetos y colóquelos en una cámara de humedad hermética y ligera durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos cada uno y, por último, enjuáguelos con agua destilada doble.

Proteja los portaobjetos de la luz durante el lavado. En PBS, agregue unas gotas de un medio de montaje acuoso que ayude a preservar la intensidad de la señal fluorescente en cada portaobjetos. A continuación, cubra, deslice la corredera y elimine las burbujas de aire restantes con un aplicador con punta de algodón para sellar el medio de montaje en las correderas y evitar que las secciones se sequen.

Cubre los bordes con esmalte de uñas. Los portaobjetos se dejan secar durante una hora en una caja protegida contra la luz antes de almacenarlos en un recipiente hermético ligero envuelto en papel de aluminio a cuatro grados centígrados. Una vez que el esmalte de uñas se haya secado, lleve los portaobjetos a la sala del microscopio para obtener imágenes.

Prepare la habitación apagando las luces del techo y bloqueando cualquier otra fuente de luz exterior. Encienda el microscopio, la fuente de luz fluorescente y la computadora de imágenes. A continuación, coloque un portaobjetos en la platina del microscopio y enfóquelo.

Con el software adjunto, ajuste la exposición para cada longitud de onda por separado. Evite sobreexponer el astuto a la luz durante largos períodos de tiempo para evitar el fotoblanqueo de la muestra. A continuación, adquiera imágenes en cada canal sin mover la sección ni ajustar el enfoque.

Combine las imágenes con el software de imágenes y guárdelas para su posterior análisis de imágenes. Utilizando el protocolo de tinción que acabamos de describir, se pueden obtener fácilmente imágenes fluorescentes como las que se muestran aquí: en el canal rojo aparece claramente una microglía IBA positiva, y en el canal verde, las neuronas panneuronales positivas destacan por encima del fondo. Aparecen las imágenes de control de ambas tinciones de anticuerpos.

El marcaje doble oscuro con IBA uno y el marcador panneuronal que se muestra aquí demuestra una microglía mayoritariamente ramificada con proyecciones neuronales largas y finas evidentes a través de las capas corticales. Los resultados de tinción como los que se muestran aquí también son posibles si la calidad del tejido es mala. La mala calidad de los tejidos se evidencia por la falta de cuerpos celulares claramente definidos y los procesos microgliales y neuronales fragmentados.

Hay una falta de claridad de la tinción microglial y una ausencia completa de tinción neuronal, lo que hace que la imagen superpuesta no tenga sentido al intentar esta técnica. Es importante cubrir uniformemente las secciones y recuerda que no debes dejar que se sequen entre los escalones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de las técnicas inmunohistoquímicas introductorias.