Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar la inmunohistoquímica para visualizar proteínas de interés. En este ejemplo, IBA uno para microglía y pan neuronal para neuronas. Esto se logra primero colocando secciones preparadas en una solución bloqueadora para prevenir la unión no específica.

Como segundo paso, se colocan sobre las secciones anticuerpos que reconocen las dos proteínas de interés diferentes durante la noche. A continuación, las secciones se lavan e incubarán con anticuerpos secundarios para añadir marcadores fluorescentes a los anticuerpos primarios. Los resultados de la doble marcación pueden indicar tinciones de microglía dentro de campos de neuronas.

Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades al principio porque existen muchas variables que ajustar. Hazel May, una estudiante universitaria en nuestro laboratorio, demostrará esta técnica hoy. Para comenzar, fije y seccione cuidadosamente cerebros de roedores como se describe en el protocolo de texto adjunto, y luego almacénelos cuidadosamente a menos 80 grados Celsius hasta que sean necesarios.

Cuando esté listo para continuar con el protocolo, retire los portaobjetos del congelador y déjelos descongelar a temperatura ambiente. Una vez descongelados, coloque los portaobjetos en una gradilla y lávelos tres veces en PBS durante cinco minutos cada vez. A partir de este momento, evite que los cortes se sequen.

Seque los bordes de las laminillas y haga un borde repelente al líquido alrededor del borde de la laminilla con un rotulador de cera para garantizar una cobertura uniforme del líquido y reducir los efectos de borde. A continuación, bloquee las secciones añadiendo 300 microlitros de suero en PBS a cada laminilla. El suero debe ser de la misma especie en la que se generó el anticuerpo secundario.

En este caso, se utilizó suero de asno. Asegúrese de que la solución bloqueadora llegue hasta el borde del portaobjetos y cubra completamente el tejido. Para evitar una tinción desigual, coloque los portaobjetos en una cámara de humedad e incúbelos a temperatura ambiente durante una hora.

Durante la incubación, prepare los anticuerpos primarios diluyendo el anticuerpo IBA uno a 1:5.000 y el anticuerpo pan-neuronal a 1:500 en una mezcla de suero de asno al 1 %. En PBS, elimine la solución bloqueante y agregue 300 microlitros de la solución de anticuerpos, que contiene ambos anticuerpos de interés. Además, prepare tres portaobjetos de control.

Añada 300 microlitros del IVA, una dilución sola en un portaobjetos, 300 microlitros de la dilución del anticuerpo panneuronal sola en un segundo portaobjetos y 300 microlitros de suero de asno al 1 % en PBS. En un tercer portaobjetos, coloque todos los portaobjetos en una cámara de humedad e incúbelos durante la noche a cuatro grados Celsius; a la mañana siguiente, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos cada vez.

Prepare la mezcla de anticuerpos secundarios fluorescentes diluyendo ambos uno a 250 en suero de asno al 1 % en PBS. Añada 300 microlitros de la mezcla sobre cada portaobjetos y coloque los portaobjetos en una cámara de humedad opaca a la luz durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez y, finalmente, enjuáguelos con agua doblemente destilada.

Proteja las laminillas de la luz durante el lavado. En PBS, agregue unas gotas de un medio de montaje acuoso que ayude a preservar la intensidad de la señal fluorescente a cada laminilla. Luego, cúbrala, coloque la cubreobjetos y elimine las burbujas de aire restantes utilizando un aplicador de algodón para sellar el medio de montaje sobre las laminillas y evitar que los cortes se sequen.

Cubra los bordes con esmalte de uñas. Se dejan secar las portaobjetos horizontalmente durante una hora en una caja protegida de la luz antes de almacenarlas en un recipiente hermético a la luz, envueltas en papel de aluminio, a cuatro grados centígrados. Una vez que el esmalte de uñas se ha secado, lleve las portaobjetos al cuarto del microscopio para su obtención de imágenes.

Prepare la habitación apagando las luces del techo y bloqueando cualquier otra fuente de luz externa. Encienda el microscopio, la fuente de luz fluorescente y la computadora de imagen. Luego coloque un portaobjetos en la platina del microscopio y enfoque la muestra.

Utilizando el software adjunto, ajuste la exposición para cada longitud de onda por separado. Evite exponer en exceso la muestra a la luz durante períodos prolongados para prevenir el fotoblancamiento de la muestra. A continuación, adquiera imágenes en cada canal sin mover la sección ni ajustar el enfoque.

Combine las imágenes utilizando el software de imagen y guárdelas para un análisis posterior. Mediante el protocolo de tinción recién descrito, se pueden obtener fácilmente imágenes fluorescentes como las mostradas aquí: en el canal rojo, las microglías positivas para IBA aparecen claramente, y en el canal verde, las neuronas positivas pan-neuronales sobresalen sobre el fondo. Aparecen también las imágenes de control para ambas tinciones con anticuerpos.

La doble marcación oscura con IBA1 y un marcador pan-neuronal mostrada aquí demuestra principalmente microglía ramificada con largas proyecciones neuronales finas evidentes a través de las capas corticales. Resultados de tinción como los mostrados aquí también son posibles si la calidad del tejido es deficiente. La mala calidad del tejido se evidencia por la ausencia de cuerpos celulares bien definidos y procesos microgliales y neuronales fragmentados.

Existe una falta de nitidez en la tinción de microglía y una ausencia completa de tinción neuronal, lo que hace que la imagen superpuesta no sea significativa al intentar esta técnica. Es importante cubrir uniformemente las secciones y recordar no dejarlas secar entre los pasos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de las técnicas introductorias de inmunohistoquímica.