Name: Ratón neumonectomía Modelo de Compensatoria crecimiento pulmonar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprende el modelo de neumonectomía en ratón para estudiar el crecimiento pulmonar compensatorio mediante toracotomía izquierda. Este método permite investigar los mecanismos de regeneración alveolar en biología del desarrollo.

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Los autores desean agradecer a la División de Servicios Veterinarios del Hospital Infantil de Cincinnati por su ayuda. Este manuscrito fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud K12 HD028827. La doctora Anna Perl enseñó a los autores este procedimiento quirúrgico.

Declaración de uso animal:: NOTA Todos los procedimientos de este estudio se llevaron a cabo con la aprobación y siguiendo las directrices de la Institutional Animal Uso y Comité de Cuidado (IACUC) en el Hospital de Niños de Cincinnati. C57BL / 6J macho de ocho semanas de edad se obtuvieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) y se dejaron aclimatar durante una semana antes de usar. Hasta la cirugía, los animales fueron alojados en un centro de barrera libre de patógenos y siempre pienso en autoclave y se filtra agua ad libdium. Cada jaula ratón se suministra con un aire dedicado y agua, y las habitaciones se mantuvieron en un ciclo día-noche de 12 horas. Después de la recuperación de la cirugía, los ratones fueron mantenidos en jaulas con las tapas filtrados, siempre autoclave comida ad libitum, y siempre que filtran el agua de una botella de agua. 1. Elaboración de Instrumentos <ol><li> Hacer 6 retractores de la piel utilizando clips y pines de papel. Giro enderezó clips de papel en los vástagos de los pines de papel, lalero de un alambre de acero recta 5 cm en un extremo y hacer un solo 0.5 cm &quot;U&quot; en forma de gancho en el extremo del cable. </li><li> Hacer un poco de 15 x 15 cm paños quirúrgicos cuadrados utilizando una envoltura de plástico. Prepare un aderezo por ratón. Ponga una torre de papel entre cada envoltura. </li><li> Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos junto con una pila de fichas de 12 x 12 pulgadas de corcho, gasas, y aplicadores de algodón. </li></ol> 2. Preparación del ratón <ol><li> Inducir la anestesia con isoflurano al 2%. Pesar animal. </li><li> En un área de preparación quirúrgica dedicada afeitarse tórax izquierdo y el cuello con la máquina de afeitar eléctrica. </li><li> Aplique una gota del ungüento de lágrimas artificiales para los ojos del ratón. </li><li> Descontaminar el cuello y el tórax izquierdo con clorhexidina y alcohol isopropílico. Repite dos veces más. </li></ol> 3. Ratón Oro-traqueal La intubación y ventilación mecánica <ol><li> Haga que un técnico quirúrgico lugar no estéril la supina ratón en el área quirúrgica pre-calentado.</li><li> Confirme la profundidad de la anestesia mediante la documentación de la falta de una respuesta a la pizca de la pata. </li><li> Después de lavarse las manos y ponerse el traje quirúrgico, máscara y sombrero, ponerse guantes quirúrgicos estériles. </li><li> Después de drapeado y utilizando una técnica aséptica, hacer una incisión vertical de 1 cm en el mediano anterior del cuello para exponer la laringe. Ligeramente retraer los músculos de la correa dentada, con curvas de 10 cm pinzas y exponer la laringe y la tráquea mediante la difusión de los músculos de la correa con la punta de unas tijeras rectas. </li><li> Por vía oral insertar un 22 G angiocatéter romo-punta en la mitad de la tráquea (Figura 1A) y confirmar visualmente la colocación (Figura 1B). Mantener la anestesia y ventilar utilizando 1-3% isoflurano a través del ventilador de roedores (225 l por golpe; 200 Stokes por minuto). Emplear un límite de presión de 15 cm H 2 O. </li></ol> 4. Ratón neumonectomía <ol><li> Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho con la espalda del ratón haciael operador (a la izquierda hacia arriba). Utilice una envoltura de plástico de cierre automático como un campo estéril. Corte a través de la cortina, utilice contundentes tijeras curvas de punta para hacer un 2 cm de largo corte paralelo a las costillas en el espacio intercostal 4 º y 5 º. Inserte las tijeras de punta curvada contundentes y diseccionar la piel lejos de las costillas subyacentes y los músculos intercostales. </li><li> Retraer la piel con cuatro retractores para exponer un cuadrado 1,5 x 1,5 cm de la ventana quirúrgica (Figura 2A). Asegure los retractores al tablero de corcho. </li><li> Diseccionar a costillas utilizando pinzas curvas, y utilizar una punta de las pinzas curvas para entrar en la cavidad torácica. </li><li> Usando la punta roma micro-tijeras, utilice la cuchilla inferior para entrar en la cavidad torácica. Hacer una incisión de 0,5 cm entre las costillas y la repetición en la dirección opuesta. </li><li> Usando los dos retractores restantes, abrir el tórax en el eje antero-posterior y el seguro de los retractores de la placa de corcho (Figura 2B). </li> &lt;li&gt; Con unas pinzas de punta roma curvas en la mano izquierda, sujete el pulmón izquierdo y desplazar a la parte superior del pulmón izquierdo lateral e inferior a través de la toracotomía hasta la arteria pulmonar izquierda y bronquios están expuestos (Figura 3A, B). </li><li> Sosteniendo el titanio microclip vascular aplicador cargado en la mano derecha con el cuerpo del aplicador en la palma y punta curva en dirección opuesta a la palma de la mano (Figura 3C), deslice la punta del aplicador en el tórax a lo largo de la curvatura de la cara posterior de la izquierda pulmón y el clip del bronquio izquierdo y la arteria pulmonar (Figura 3D). </li><li> Retire el aplicador pero mantener el pulmón izquierdo retraída. Sujete las puntas micro-tijeras de punta roma con la mano derecha y cortar el bronquio y distal de la arteria pulmonar para el clip y retire pulmón izquierdo (Figura 3E). </li><li> Retire los retractores costales. </li><li> Utilice las pinzas contundentes curvas pellizcar hasta 1 cm de piel de calidad inferior a la incisien pero por encima del nivel del diafragma e insertar un angiocatéter 24 G a través de la piel y en la cavidad torácica izquierda (Figura 4A, B). </li><li> Utilice 5-0 prolene sutura colocar dos puntos separados alrededor de la 4 ª y 5 ª costillas para cerrar la cavidad torácica. </li><li> Retire los retractores de la piel. Utilice dos conjuntos de pinzas para aproximar la piel a lo largo de la longitud de la incisión y pegar la piel cerrada. </li><li> Conecte una jeringa luer-lock 3 ml al angiocatéter y eliminar el aire residual aplicando succión suave y retirar el angiocatéter. </li><li> Pegue la incisión en el cuello cerrado usando dos juegos de pinzas como antes. </li></ol> 5. Ratón Sham neumonectomía <ol><li> Exponer el pulmón izquierdo como se señala en el protocolo &quot;Ratón Neumonectomía&quot;. Levante la caja torácica con unas pinzas romas curvas para permitir que el aire en la cavidad torácica izquierda (Figura 5 A, B). </li><li> Coloque una G angiocatéter 24 en el tho izquierdacavidad Racic que arriba con cuidado de no dañar el pulmón izquierdo. </li><li> Utilizando 5-0 prolene sutura y teniendo cuidado de no perforar el pulmón (Figura 5C), colocar dos trozos de material de sutura en la 3ª / 4ª y 5ª / 6 espacios intermedios ª costilla (Figura 5D). Coloque las dos longitudes de material de sutura antes de atar a disminuir los riesgos de hernia pulmón izquierdo. Ate el material de sutura para hacer dos puntos separados (Figura 5E). </li><li> Pegue la piel sobre la incisión torácica, eliminar el aire residual con el angiocatéter y pegar la incisión en el cuello que el anterior. </li></ol> 6. Reanimación, Analgesia y Recuperación <ol><li> Apague el isoflurano, y administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina y 0,5 ml de solución salina normal por vía subcutánea. </li><li> Cuando la respiración espontánea se reanuden, retire el tubo endotraqueal. </li><li> Observe ratón hasta que esté de nuevo ambulatorio. Caminar normalmente Resumit varios minutos después de la extracción del tubo endotraqueal. </li><li> Coloca el ratón en un 27 ° C incubadora (, 25% de oxígeno humidificado) para recuperar O / N. NOTA: Nos colocamos varias bolitas de comida humedecida con agua en el suelo de la jaula por primera 24 horas después de la cirugía. </li><li> Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina por inyección intraperitoneal dos veces al día durante tres días después de la cirugía. Tenga cuidado de no abrir el sitio quirúrgico al manipular animales. </li></ol> 7. Monitoreo Ratón <ol><li> Pesar ratones a 1, 3, 5, y 7 días después de la cirugía. </li></ol>

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<li>Mortola, J. P., Magnante, D., Saetta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expiratory+pattern+of+newborn+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Expiratory pattern of newborn mammals.</a> Journal of applied physiology. 58, 528-533 (1985).</li>
<li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of applied physiology. 106, 984-987 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos proporcionado la descripción más detallada de los procedimientos PNX PNX ratón y ratón del impostor reportados hasta la fecha. Hemos hecho el lector consciente de varios de los errores comunes que los investigadores están aprendiendo el procedimiento comúnmente se enfrentan, y que hemos descrito varias técnicas desarrolladas por nuestro laboratorio para mitigar estos riesgos. Otros laboratorios que utilizan este modelo pueden haber desarrollado otras modificaciones en la técnica o utilizar diferentes instrumentos....

La función principal del pulmón es proporcionar para el oxígeno y el dióxido de carbono de intercambio entre un organismo y el ambiente. En los seres humanos, una serie de condiciones congénitas y adquiridas conducen a la reducción de la superficie pulmonar que se traduce en la función pulmonar. Aunque una serie de terapias tales como los corticosteroides inhalados, broncodilatadores, oxígeno suplementario, y la ventilación mecánica crónica se utilizan para mitigar las consecuencias de la función pulmonar 1-3, la terapia ideal para estas condiciones sería promover el recrecimiento del tejido pulmonar funcional - es decir, de pulmón regeneración. La regeneración de tejidos de mamíferos ha sido bien documentado. El Ratón espinoso africano puede regenerar grandes zonas de piel sin la formación de cicatrices 4. La falange distal en los seres humanos puede regenerarse después de una lesión o amputación 5-7. Siguiendo neumonectomía (PNX), el crecimiento pulmonar compensatorio se produce en ratones 8, 9 ratas, hacergs 10, y los seres humanos 11. Por definición, el crecimiento pulmonar compensatorio implica no sólo la expansión de los espacios aéreos existentes, pero volver a la tabicación de estos espacios aéreos ampliados con la expansión de la microcirculación 12 asociado. La expresión de genes ha demostrado que este modelo recapitula muchos de los eventos de señalización de desarrollo pulmonar 13. Cuatro semanas después de ratón PNX, área de la superficie alveolar es equivalente a la de animales operados simulados 14. En este manuscrito, se describe la PNX ratón y procedimientos simulados PNX.

<table><tbody><tr><td>Aplicador de clip vascular de 6 pulgadas</td><td>Teleflex Medical (WECK)</td><td>137062</td><td></td></tr><tr><td>Horizon pequeño clip rojo titanio</td><td>Teleflex Medical (WECK)</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curva de 12 cm de patrón estrecho</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Graefe dentada curva de 10 cm</td><td>Pinza Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td> <td>CastroviejoFine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras rectas de 9 cm para el estrabismo (punta roma)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras rectas endurecidas de 8,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de muelle Cohan-Vannas rectas y de punta roma</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento para la piel</td><td>Gluture</td><td>32046</td><td></td></tr><tr><td>22 g Angiocatéter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 G Angiocatéter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 ml Jeringa</td><td></td><td></td><td></td>Luer lock</tr><tr><td>4 Retractores cortos</td> 2 Retractores <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>largos</tr><tr><td>5-0 Prolene en aguja de corte curva</td><td>Ethicon</td><td>8698G</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Jeringa en aguja</td><td></td><td></td><td></td> de 27 G</tr><tr><td>Solución salina</td><td></td><td></td><td></td>normal</tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envoltura Press-n-Seal</td><td>Glad Products Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 x 12 pulgadas Pila de tableros de corcho</td><td>Office Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de ratón</td><td>Hugo Sachs Elektronnik</td><td>Minivent Tipo 845</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>OHMEDA</td><td>Excel 210 SE</td><td></td></tr><tr><td>Pomada de lágrimas artificiales</td><td>Puralube</td><td>NDC: 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

ratón neumonectomía modelo de compensatoria crecimiento pulmonar

Mouse Pneumonectomy Model of Compensatory Lung Growth

En los seres humanos, la reparación y remodelación interrumpida del pulmón lesionado contribuye a una serie de trastornos pulmonares agudos y crónicos que, en última instancia, pueden conducir a la discapacidad o la muerte. Los modelos animales de reparación y regeneración pulmonar basados en lesiones están limitados por las respuestas específicas de la lesión, lo que dificulta diferenciar los cambios relacionados con la respuesta a la lesión y la resolución de la lesión de los cambios relacionados con la reparación y la regeneración pulmonar. Sin embargo, el uso de modelos animales para identificar estas vías de señalización de reparación y regeneración es fundamental para el desarrollo de nuevas terapias destinadas a mejorar la función pulmonar después de una lesión pulmonar. El modelo de neumonectomía en ratón utiliza el crecimiento pulmonar compensatorio para aislar esas señales de reparación y regeneración con el fin de definir más claramente los mecanismos de reseptación alveolar. Aquí, describimos nuestra técnica para realizar la neumonectomía en ratón y la neumonectomía simulada. Esta técnica se puede utilizar junto con el rastreo de linaje u otros modelos de ratones transgénicos para definir el mecanismo molecular y celular de la reparación y regeneración pulmonar.

. Una parcela de PNX y operación simulada pesos de los ratones se proporciona en la figura 6 En nuestras manos, la supervivencia es consistentemente 95-100% tanto para PNX y farsa neumonectomía. Para obtener una descripción de cómo el pulmón derecho re-crece en este modelo y la evolución en el tiempo previsto, nos remite al lector a los manuscritos de Gibney et al. 15 y Wang et al. 14 Varios errores comunes se deben evitar para realiza...

La neumonectomía en ratón es un modelo comúnmente empleado de crecimiento pulmonar compensatorio. Este procedimiento se puede utilizar junto con el rastreo de linaje o modelos de ratones transgénicos para dilucidar los mecanismos subyacentes.

Ratón neumonectomía Modelo de Compensatoria crecimiento pulmonar

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to ...

El objetivo de este procedimiento es realizar una neumonectomía izquierda para inducir el crecimiento compensatorio del pulmón derecho. Esto se logra primero realizando una toracotomía izquierda y exponiendo el hilio izquierdo. El segundo paso del procedimiento consiste en ligar el hilio izquierdo y la arteria pulmonar izquierda.El tercer paso consiste en retirar el pulmón izquierdo. El paso final es cerrar la toracotomía. El modelo de neumonectomía en ratón para el crecimiento pulmonar compensatorio puede utilizarse en conjunto con otras técnicas biométricas o bioquímicas para elucidar los mecanismos del crecimiento y la regeneración alveolar.Este método puede responder algunas preguntas clave en el campo del desarrollo y la regeneración pulmonar, como cuáles son los procesos celulares fundamentales implicados en la septación y cuáles son los procesos moleculares celulares críticos necesarios para reiniciar la septación. Por lo general, los investigadores nuevos en esta técnica tendrán dificultades con uno de varios pasos clave. Podrían tener problemas con la cannulación traqueal.Pueden tener dificultades para crear una ventana quirúrgica adecuada. Pueden tener dificultades para identificar el hilio y colocarle una pinza, y también pueden tener dificultades para evitar lesiones en el pulmón izquierdo durante la toracotomía simulada. Esta técnica será demostrada por Shang Lu, asistente principal de laboratorio de mi laboratorio. Para comenzar, tras inducir anestesia en el ratón con un 2% de isoflurano, afeite el área torácica izquierda y el cuello con una afeitadora eléctrica, aplique una pomada de lágrimas artificiales en los ojos del ratón y descontamine el área pasando un hisopo con clorhexidina tres veces, seguido de alcohol isopropílico tres veces y luego nuevamente con clorhexidina.Tres veces. Confirme la profundidad de la anestesia documentando la ausencia de respuesta a un pellizco fuerte tras realizar una incisión vertical de un centímetro sobre la línea media anterior del cuello para exponer la laringe; use pinzas dentadas de 10 centímetros para retraer ligeramente los músculos infrahioides. Luego, use las puntas de una tijera recta para separar los músculos infrahioides.A continuación, inserte oralmente una cánula angiocatódica de punta roma calibre 22 en la tráquea media y confirme visualmente su colocación a través de la incisión. Coloque al ratón en un ventilador para roedores y mantenga la anestesia con 2% de isoflurano, con un límite de presión de 15 centímetros de agua. Coloque al ratón aún anestesiado en posición decúbito lateral derecho, con el lado dorsal izquierdo orientado hacia el operador.Coloque una envoltura de plástico autoadherente sobre el cuerpo del ratón como un campo estéril. Utilice tijeras curvas con punta roma para hacer un corte de dos centímetros de largo paralelo a las costillas en el espacio intercostal cuarto y quinto. Luego, inserte las puntas de las tijeras y separe la piel de las costillas y los músculos intercostales subyacentes.Coloque cuatro retenedores en la piel para formar una ventana quirúrgica de 1,5 por 1,5 centímetros. Sujete cada retenedor a la tabla de corcho. Utilice pinzas curvas para diseccionar hasta llegar a las costillas y luego realice una disección roma del espacio intercostal.Para exponer las costillas cuarta y quinta, utilice una punta de una pinza curva para hacer un orificio e ingresar a la cavidad torácica. Ahora use la hoja inferior de un par de tijeras microcirúrgicas de punta roma para presionar a lo largo de la incisión hasta que la hoja inferior entre en la cavidad torácica. Realice una incisión de 0,5 centímetros entre las costillas y luego repita en la dirección opuesta.Luego, abra el tórax a lo largo del eje anterior-posterior insertando dos retractores y fijándolos en la caja de corcho. Ahora cargue el aplicador de microclips. A continuación, utilizando fórceps curvos de punta roma sostenidos con la mano no dominante, sujete el pulmón izquierdo y desplace la porción superior lateral e inferiormente a través de la toracotomía hasta exponer la arteria pulmonar izquierda y el bronquio.Luego, sostenga el replicador cargado de clip microvascular de titanio en la mano dominante, con el cuerpo del aplicador en la palma y la punta curva orientada lejos de la palma. Deslice la punta del aplicador dentro del tórax siguiendo la curvatura de la cara posterior del pulmón izquierdo, y coloque un clip en el bronquio izquierdo y en la arteria pulmonar. Retire el aplicador pero mantenga el pulmón izquierdo retraído.Sujete con la mano derecha las tijeras microquirúrgicas de punta roma y corte el bronquio y la arteria pulmonar distales al clip, y retire el pulmón izquierdo. Tras la extracción del pulmón, retire los separadores de costillas. Luego, utilice la pinza curva de punta roma para elevar un centímetro de piel por debajo de la incisión y por encima del nivel del diafragma, e inserte un catéter angiocath de calibre 24 a través de la piel y dentro de la cavidad torácica izquierda.A continuación, coloque dos suturas de prolina 5-0 interrumpidas alrededor de las cuarta y quinta costillas. Para cerrar la cavidad torácica, retire los retractores de piel y use dos juegos de pinzas para aproximar la piel a lo largo de la longitud de la incisión, y utilice adhesivo tisular para pegar la piel y cerrarla. Finalmente, conecte una jeringa de 3 mL con conexión luer lock al catéter angio y elimine el aire residual aplicando succión suave y retirando el catéter angio.Finalizado mediante la fijación del cuello, con la incisión cerrada utilizando dos pares de fórceps, tal como se hizo para el cierre de la incisión torácica. Después de exponer el pulmón izquierdo del ratón anestesiado como se mostró previamente, utilice fórceps curvos romos para levantar la caja torácica y permitir la entrada de aire en la cavidad torácica izquierda. Introduzca un catéter angiocavital láser de calibre 24 en la cavidad torácica izquierda como se indicó anteriormente, teniendo cuidado de no lesionar el pulmón izquierdo. Utilice sutura de prolina 5-0 y tenga cuidado de no perforar el pulmón.Coloque dos tramos de material de sutura en los espacios entre el tercer y cuarto, y el quinto y sexto arco costal. Coloque ambos tramos de material de sutura antes de anudar para reducir los riesgos de herniación del pulmón izquierdo. Anude el material de sutura para realizar dos puntos simples separados.Coloque pegamento sobre la piel cubriendo la incisión torácica. Elimine el aire residual con el catéter angio y coloque pegamento sobre la incisión del cuello como se mostró previamente. Apague el isoflurano y administre 0,1 miligramos por kilogramo de buprenorfina y 0,5 mililitros de solución salina normal por vía subcutánea.Cuando la respiración espontánea se reanude, retire el tubo endotraqueal. Observe al ratón hasta que pueda caminar. Normalmente, la capacidad de caminar se recupera varios minutos después de la retirada del tubo endotraqueal.Administre 0.1 miligramos por kilogramo de buprenorfina mediante inyección intraperitoneal dos veces al día durante tres días después de la cirugía. Monitoree cuidadosamente al animal durante estos tres días y tenga cuidado de no abrir el sitio quirúrgico al manipular a los animales. Esta imagen muestra la pérdida de peso después de la cirugía.24 horas después de la cirugía, los ratones sometidos a neumonectomía perderán en promedio 1,5 gramos y los ratones del grupo control perderán en promedio 1,1 gramos. Ambos grupos recuperan su peso previo a la cirugía para el tercer día posoperatorio. Esta imagen fluorescente muestra la tinción por inmunofluorescencia de tropoelastina en el lóbulo accesorio bajo condiciones control.Aquí, se muestra la inmunofluorescencia de tropoelastina del lóbulo accesorio 72 horas después de la neumotomía; los espacios aéreos existentes están aumentados. Esta imagen final de inmunofluorescencia de TRO Elastina muestra el lóbulo accesorio cuatro semanas después de la neumotomía. Observe el crecimiento del Loba y la reacción.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el modelo de neumonectomía en ratón para estudiar el crecimiento pulmonar compensatorio y cómo realizar la toracotomía simulada, que se utiliza como control para este procedimiento.

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

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