El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

El objetivo general del siguiente experimento es aislar células musculares purificadas de biopsias musculares de pacientes humanos e inmortalizarlas para estudios posteriores. Esto se logra primero pesando, picando y digiriendo el tejido recolectado para disociar las células mononucleares. Como segundo paso, las células miogénicas se purifican a partir de células no miogénicas mediante hechos.

A continuación, las células miogénicas se infectan con CDK 4 y H turt para generar células inmortalizadas. Los resultados muestran que las células musculares vivas derivadas del paciente pueden expandirse por varios pasajes y diferenciarse en función de los ensayos de fusión celular, la presencia de tubos miométricos espasmódicos y la expresión de marcadores miogénicos. Las implicaciones de esta técnica se extienden más allá del diagnóstico de la enfermedad muscular, ya que potencialmente puede proporcionar un número ilimitado de células miogénicas para el cribado de fármacos u otras aplicaciones posteriores en las que se requiere un gran número de células.

Voy a demostrar el procedimiento junto con Jerome Robbin, un becario postdoctoral del laboratorio del Dr. Woody Wright en Dallas. Comience con la disociación de la biopsia muscular para purificar las células miogénicas. Primero en una campana de bioseguridad de cultivo de tejidos, registre la masa de la biopsia muscular.

A continuación, en un plato de 10 centímetros, utilice bisturíes estériles para picar el tejido en trozos finamente picados. Añade unas gotas de un X-H-B-S-S para que el tejido no se seque por gramo de tejido. Añadir 3,5 mililitros de pasta en disco dos y 3,5 mililitros de soluciones de colagenasa D.

A continuación, mezcle las células con una pipeta de 25 mililitros y transfiera la placa a una incubadora cada 15 minutos. Mezcle las células con una pipeta de cinco mililitros en 90 minutos. Debe haber una disociación completa del tejido.

Una vez que el tejido esté disociado, agregue dos volúmenes de medio de crecimiento y fíltrelo a través de un colador de 100 micras. Recoja el filtrado en un tubo de 50 mililitros. Granular las células del filtrado a 329 G durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, vuelva a suspender las células en HBSS con 0,5 % BS, A y cuéntelas. Ajuste el volumen para obtener 1 millón de células por cada 100 microlitros. Reserve una alícuota de 250.000 células como control sin tinción y reserve dos alícuotas similares para controles de tinción única.

Todos estos son necesarios para el análisis del fax. Ahora, tiñe las células con cinco microlitros de anticuerpo anti CD 56 por millón de células, e incuba todas las muestras en hielo durante media hora. A continuación, lave rápidamente las muestras con 10 mililitros de HBSS.

A continuación, granule las células como antes, pero a cuatro grados centígrados después de que las células hayan sido granuladas, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender la célula en una X-H-B-S-S a 5 millones de células por mililitro. A continuación, añada yoduro de propidio hasta una concentración final de un microgramo por mililitro. Ahora purifique las células miogénicas CD 56 positivas de las células no miogénicas utilizando los datos que siguen a la placa de purificación.

Las células miogénicas a 50, 000 por pocillo en placas de seis pocillos recubiertas con 0.1% de cultivo de gelatina, las células hasta que se unen, luego las infectan con virus para la línea celular inmortal. En el protocolo de texto, hay una revisión adicional de cómo purificar y cultivar fibroblastos dérmicos como se describe en el protocolo de texto. Prepare las células del trópico fénix después de incubar las células del trópico fénix durante la noche con la mezcla de plásmido PolyJet.

Alimente las células frescas, medianas, compuestas por cuatro partes de DME M1, parte de medio, 1 99 y 10% suero de ternera. Prepare también envases inotrópicos. PA tres 17 celdas en una placa de seis pocillos con alrededor de 400.000 PA tres 17 celdas por pocillo.

12 horas después, recoja el sobrenadante que contiene el virus sobre las células tropicales de Phoenix y páselo a través de un filtro de 0,45 micras. A continuación, utilice un mililitro del sobrenadante para infectar las 17 células PA y las cultive durante la noche. Al día siguiente, seleccione una línea celular productora de virus a partir de las tres células PA 17 aplicando antibióticos a 0,5 miligramos por mililitro en el medio cuando las células estén cerca de la fluidez, recoja el sobrenadante de las células tres veces en intervalos de 12 horas.

Filtra las colecciones después de cada cosecha. El filtrado es el sobrenadante viral de trabajo. Divídelo en un mililitro. Alícuotas.

Reserve algunas alícuotas para uso inmediato. Las alícuotas adicionales se pueden almacenar a menos 80 grados centígrados, pero perderán un 50% de eficiencia con cada ciclo de congelación y descongelación. Tenga en cuenta que durante todo el proceso, los equipos que hayan tocado las partículas virales deben lavarse con lejía antes de desecharlos en el contenedor de basura.

Para almacenar permanentemente la línea celular estable productora de virus PA 3 17, congele las células en suero al 10% DMSO 90% y almacénelas a menos 150 grados Celsius en cada pocillo de células purificadas por fax. En un plato de seis pocillos, agregue 400 microlitros de sobrenadante viral recién producido. Dejar dos pocillos sin virus como controles.

Incubar la placa durante la noche y al día siguiente cambiar el medio de cada pocillo a 2,5 mililitros de medio muscular fresco. Asegúrese de desechar los medios y las pipetas que contengan partículas virales en el recipiente de lejía. Deje que las células se incuben en el medio muscular fresco durante tres días.

A continuación, seleccione las células resistentes a los antibióticos utilizando 400 microgramos de neomicina por mililitro para la infección por CDK cuatro, o 300 microgramos de higromicina por mililitro para la telomerasa humana. Infección por transcriptasa inversa durante una o dos semanas. Mantenga las celdas en condiciones selectivas hasta que las celdas y los pozos de control estén muertos.

Siempre pase las células antes de que se vuelvan confluentes, incluso durante la selección cuando alcancen el 60 al 80% de fluidez, use una solución de 0.05% de EDTA para recolectar y pasar las células. Pasar las células a platos de 10 centímetros con mioblasto fresco, medio con antibióticos. Primero siembre las células a una densidad muy baja de tres a 500 por plato de 10 centímetros.

Mantenga las celdas en estos platos durante aproximadamente dos semanas hasta que se formen pequeñas colonias de 10 a 20 celdas, cuando las pequeñas colonias sean evidentes. Retire la mayor parte del medio, dejando solo una película delgada de medio para evitar que las células se sequen. Ahora, sumerja un lado de un anillo de clonación en grasa de vacío de silicona y el anillo sobre el clon deseado.

Coloque un anillo diferente alrededor de cada clon deseado en cada anillo. Añade unas gotas de solución de tripsina EDTA. Cuando las células se redondeen, use un microscopio para aspirar cuidadosamente cada bola de células en una punta de pipeta de 200 microlitros.

Transfiera las bolas de celda a los pocillos de la placa de pocillos múltiples más pequeña disponible. A continuación, expanda cada clon según sea necesario para evitar la cofluidez. Utilizando el protocolo descrito, se aislaron células miogénicas junto con fibroblastos, células adipogénicas y, posiblemente, células inmunitarias, y luego se purificaron mediante hechos.

A continuación, las células se inmortalizaron tal y como se describía utilizando virus que expresaban la quinasa dependiente de ciclina cuatro, la CDK cuatro y la transcriptasa inversa de la telomerasa humana h turt. Era crucial mantener las placas por debajo de la fluidez en cada paso, ya que podían entrar en el programa de diferenciación y formar miotubos comparando la formación y contracción de miotubos en las células de control no inmortalizadas y las células inmortalizadas. No se observaron diferencias.

La inmortalidad de la línea celular se confirmó midiendo la longitud de los telómeros y la actividad de los telómeros. La inmortalidad también era evidente en las curvas de crecimiento celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo disociar las células musculares primarias de la biopsia del paciente.

Inmortalizar el mioblasto primario y aislar y seleccionar inmortalizar clones miogénicos. No hay que olvidar que trabajar con virus requiere el uso de un cultivo de tejidos específico y un sistema de ventilación seguro. Además, todo lo relacionado con la manipulación del virus, como pipetas, puntas, platos, jeringas y filtros, debe blanquearse para evitar cualquier contaminación no deseada.

Las partículas virales pueden ser peligrosas y, por favor, siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.