Name: El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprende a aislar e inmortalizar células musculares de biopsias de pacientes mediante digestión tisular, FACS e infección viral con CDK4 y hTERT. Este método permite obtener líneas celulares ilimitadas para estudios de enfermedades musculares y cribado de fármacos.

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Esta publicación está financiada a través de Cure CMD, una beca de la Asociación Contre Les Myopathies (AFM) (proyecto 16297), y por los Institutos Nacionales de Salud (números de subvención K08 AR059750, L40 AR057721 y 2R01NS047727).

NOTA: Los protocolos para la recolección de tejido humano deben ser revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional IRB. Colección de descartados, el tejido humano de-identificado ha sido aprobado por los Comités IRB Hospital Brigham y Hospital de la Mujer y la Infancia de Boston. Los métodos descritos a continuación se han aplicado para el aislamiento de células miogénicas de desidentificados, descartado tejido. Los métodos descritos son aplicables a tejido recogido a partir de material paciente consentido. Aislamiento 1. celular <ol><li> La disociación de la biopsia muscular y la purificación de células miogénicas <ol><li> Pre-pesar una placa de cultivo tisular de 10 cm en una campana de bioseguridad de cultivo de tejidos, y luego volver a pesar el plato que contiene la biopsia muscular para calcular la cantidad de tejido que se ha disociado. </li><li> Utilizando escalpelos estériles, tejido muscular mince finamente y añadir unas gotas de estéril 1x HBSS para evitar que el tejido se seque. </li><li> Añadir 3,5 ml cada una de dispase II y colagenasa D por gramo de tejido muscular para ser digeridos. Pipetear la solución de enzima de tejidos y picada a través de una pipeta de 25 ml estéril unas cuantas veces. Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C con 5% de CO2 durante 15 min y digerir el tejido hasta que la suspensión pasa fácilmente a través de una pipeta estéril ml 5. NOTA: la disociación del tejido se consigue normalmente por digestión enzimática dentro de 45 a 90 min. Por favor, consulte la sección &quot;Los resultados representativos &#39;para obtener más detalles. </li><li> Añadir 2 volúmenes de medio de crecimiento estéril al tejido disociado, filtro a través de un filtro de 100 micras celular más de un 50 ml de pellets de células tubulares y cónicos durante 10 min a 329 xg (~ 1100 rpm), la temperatura ambiente. Por favor consulte la Tabla de Materiales para la composición de los medios de comunicación. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 volumen de medio de crecimiento estéril y añadir 7 volúmenes de solución de lisis de glóbulos rojos. Filtrar la solución a través de un filtro de células de 40 micras, entonces sedimentar tél las células durante 10 min a 329 xg, a temperatura ambiente. </li><li> Contar las células en un hemocitómetro y resuspender las células en 1x HBSS 0,5% de BSA a una concentración de 1 x 10 6 células / 100 mL. Aparte ~ 250.000 células en un único tubo que se utilizarán como control negativo (sin teñir). Conjunto de tubos de lado adicionales de un solo color manchados de control para yoduro de propidio y para CD56, que son necesarios para la selección adecuada de las células CD56 positivas por FACS clasificación. Por favor refiérase a los teléfonos manuales de clasificación o consultar con clasificación FACS expertos instalaciones fundamental de asegurar controles adecuados se incluyen. </li><li> Teñir las células para ser ordenados con 5μl / 10 6 células de anticuerpo anti CD56. Incubar todas las muestras (incluyendo los controles) en hielo durante 30 min. </li><li> Lávese las muestras en 10 ml 1x HBSS y células de pellets durante 10 minutos a 329 xg (~ 1100 rpm) en una centrífuga refrigerada, 4 ° C de temperatura. </li><li> Añadir yoduro de propidio a una concentración final de 1μg / ml de la muestra a ser sorted para la exclusión de las células muertas. Purificar células positivas CD56 a partir de células miogénicas no miogénicas utilizando el clasificador de células activadas por fluorescencia. </li></ol></li><li> La disociación de biopsia de piel NOTA: Dérmica fibroblastos se pueden aislar de un punzón de piel de pacientes cuando las biopsias musculares no están disponibles. Fibroblastos dérmicos se pueden utilizar como biomaterial para muchos estudios, incluyendo la transducción con MyoD para generar células miogénicas. Además, los fibroblastos dérmicos se pueden utilizar para generar células iPS, que pueden diferenciarse en diversos tipos de células para el estudio adicional. <ol><li> Transporte la biopsia de piel para el laboratorio en un medio de transporte. Una vez que se recibe la muestra, realice el cultivo primario tan pronto como sea posible. Si el cultivo primario no se puede establecer en el mismo día, almacenar la muestra a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Transferir la biopsia de piel para un 35 mm placa de Petri estéril en la campana de flujo laminar. </li><li> Enjuague la biopsia de la piel en una placa de Petri estéril con 1x PBS para eliminar la sangre y los residuos. Retire el tejido adiposo con un bisturí estéril. </li><li> Añadir solución de colagenasa 2 ml y picar el tejido con el escalpelo, se incuba a 37 ° C durante 45 min a 1 hr, dependiendo del tamaño del tejido. </li><li> Transferir el tejido digerido a un tubo cónico de 15 ml, lavar la placa de Petri con 2 ml de medio de cultivo de fibroblastos dos veces, y recoger el medio en el mismo tubo. </li><li> Sedimentar las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 3 ml de medio de fibroblastos para eliminar la colagenasa, a continuación, las células de pellets de nuevo. Por favor consulte la Tabla de Materiales para la composición de los medios de comunicación. </li><li> Repita el paso 1.2.7 una vez más. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento en las células de fibroblastos y medianas placa 5 ml en un matraz de cultivo de tejido T25 estéril. Incubar el matraz a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Evaluar la cultura de unión de los fibroblastos y el crecimiento en los próximos 1-3 días. &lt;br /&gt; Nota: Algunas piezas de tejido pequeños también podrán unir a la placa y los fibroblastos migran fuera de estas piezas de tejido. </li><li> Mantener el cultivo bajo las mismas condiciones hasta que los fibroblastos se cultivan a aproximadamente 80% de confluencia. </li><li> Recoge los fibroblastos por tripsinización y transferir a frascos de cultivo frescos para la expansión adicional. Realizar tripsinización por lavado de las culturas 3 veces en 1x PBS libre de Ca ++ y Mg ++. Añadir Tripsina-EDTA (ver Materiales Tabla) a las células (2 ml del matraz / T25) durante 2 min a 37 ° C. </li><li> Dividir células desprendidas en frascos adicionales. Si algunas piezas de tejido de permanecer unidos a los matraces T25 originales, añadir 5 ml de medio de cultivo fresco a este frasco y más fibroblastos migran a cabo continuamente. NOTA: El cultivo de fibroblastos expandido se puede congelar abajo como P1 y se almacena en nitrógeno líquido para futuros experimentos. </li></ol></li></ol> 2. La inmortalización de células miogénicas <ol><li&gt; células de la placa de 5 millones de Phoenix Ecotropic de embalaje (PE) durante la noche en una placa de cultivo tisular de 10 cm en DMEM estéril y Medio 199 en una proporción de 4: 1, suplementado con suero de ternera al 10%. </li><li> Células de alimentación 30 min antes de la transfección con 5 ml de medio fresco suplementado con 10 mM de cafeína. </li><li> Homogeneizar una mezcla de 2 g de ADN plasmídico a partir de una preparación midi (CDK4 o hTERT plásmido) y polyjet e incubar a temperatura ambiente durante 15 min, según lo recomendado por el fabricante. </li><li> Añadir la mezcla de plásmido / polyjet a las células PE durante la noche. </li><li> Células de alimentación con medio fresco (DMEM y medio 199 en una proporción de 4: 1, suplementado con suero de ternera al 10%). Doce horas más tarde, recoger el sobrenadante que contiene el virus y filtrar a través de un filtro de tamaño de poro 0,45 micras. </li><li> Usar 1 ml de sobrenadante recogido durante la noche para infectar la línea celular de empaquetamiento PA317 anfotrópicas 5 y obtener una línea celular productora de virus estables después de la selección, ya sea con 0.5 mg / ml de neomicina (G418) para CDK4 o 0,5 mg / ml de higromicina para hTERT. </li><li> Preparar trabajo sobrenadantes virales por el crecimiento de las células de empaquetamiento estables hasta casi confluencia, luego, la cosecha el sobrenadante cada mañana, la tarde y la mañana para tres cosechas. </li><li> Filtra los sobrenadantes virales y, o bien utilizar directamente o dividirlos en alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 ° C para su uso posterior. Tenga en cuenta que sobrenadante viral pierde 50% de eficiencia de la infección con cada uno de congelación-descongelación. Recuerde que debe blanquear lavado antes de desechar todo lo que ha tocado las partículas virales. NOTA: La línea celular PA317 productoras de virus estable puede ser congelado y se mantiene a -150 ° C para el almacenamiento permanente (medio de congelación es del 10% DMSO; 90% de suero). </li><li> Plate FACS purificado células miogénicas (descrito en los pasos 1.1 a 1.9) a una densidad de 5 x 10 4 células / pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina al 0,1%. Asegúrese de que las células se unen a la placa antes de proceder con la infección viral. </li><li> Añadir 400 l filtrada, freshly producido sobrenadante viral o alícuotas congeladas a cada placa de seis pocillos durante la noche (mantener 2 pozos como controles). </li><li> Cambio de medio por la alimentación de las células con 2,5 ml / pocillo de medio fresco muscular (4: 1 medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y medio 199 suplementado con suero bovino fetal al 15%; 0,02 M tampón HEPES; 1,4 mg / L de vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L de dexametasona, factor de crecimiento de hepatocitos / l 2,5 g y / L el factor de crecimiento de fibroblastos básico 10 g). Deseche los medios de comunicación y pipetas que contienen las partículas virales en un contenedor de lejía. Deja células en el mismo medio durante 3 días para recuperarse de la infección, entonces tratan de selección utilizando 400 mg / ml de neomicina (infección CDK4) o 300 mg / ml de higromicina (infección hTERT). </li><li> Mantener células en la selección de medicamentos hasta que las células en la matriz placa control (1-2 semanas). </li><li> Células de paso antes de que se hacen confluentes (60-80% de confluencia, utilizando 0,05% de tripsina EDTA), incluso durante la SELECTIel período. Células Replate en múltiples 10cm platos con medio fresco de mioblastos (como se describe en 2.11), complementado con la droga selección. Mantener células seleccionadas inmortalizadas como una población heterogénea o clonar para obtener un fondo genético completamente homogénea (el mismo de inserción del transgén en cada célula). </li><li> Realice la selección clonal utilizando los siguientes pasos: <ol><li> Sembrar las células a baja densidad (por ejemplo, de 300 a 500 células en placas de 10 cm) y mantenerlas durante aproximadamente dos semanas, hasta pequeñas colonias se forman células (10-20). </li><li> Eliminar la mayor parte del medio en este punto, dejando sólo una película fina para evitar que las células se sequen. </li><li> Coloque un anillo de clonación (con un extremo sumergido en grasa de vacío de silicona) sobre cada clon deseado y añadir unas gotas de tripsina / EDTA. </li><li> Las células de la cosecha una vez que se redondean aspirando cuidadosamente las células utilizando una punta de 1 ml o una pipeta Pasteur y su transferencia a la más pequeña pla multiwell disponiblete (96 o 48, 24 o 12 pocillos). </li><li> Expandir clones según sea necesario para evitar la confluencia local. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las células como un recurso útil El aislamiento y el cultivo de poblaciones de células miogénicas es extremadamente útil cuando se establece fenotipos de la enfermedad o en modelos in vitro de la enfermedad. El procedimiento de aislamiento de células myogenic aquí descrito permite el aislamiento de los mioblastos y fibroblastos a partir de muestras de músculo esquelético, que luego pueden ser propagados, diferenciada, o inmediatamente analizadas. La estructura y función de ...

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Stacy C. Cossette
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Stacy A. Cossette

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Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

El diagnóstico molecular ha evolucionado drásticamente en los últimos 20 años. El ADN genómico ahora se aísla rutinariamente del esputo o del hisopo de la mejilla, mientras que en el pasado requería una extracción de sangre. Con el rápido tiempo de respuesta actual y la facilidad de secuenciación de genes, muchas mutaciones de enfermedades se identifican de forma rutinaria sin necesidad de pruebas adicionales. En el caso del diagnóstico de enfermedades musculares, la identificación de docenas de nuevos genes en la última década responsables de la distrofia muscular o la miopatía ha cambiado drásticamente la forma en que se diagnostican estas enfermedades 1,2. Actualmente, hay docenas de genes que se han identificado como causas de la distrofia muscular y la miopatía congénita, aunque los mecanismos por los cuales muchos de estos genes producen la enfermedad siguen sin estar claros. En particular, las enfermedades raras constituyen un desafío debido al pequeño tamaño de las poblaciones de pacientes. Para estos casos, así como para enfermedades más comunes, es muy deseable la generación de herramientas estables que faciliten los estudios sobre el mecanismo de patogenia y el cribado de fármacos terapéuticos. 
A pesar del progreso dramático en el diagnóstico de ADN, las biopsias musculares todavía se realizan para establecer el diagnóstico primario en muchos pacientes en los que se sospecha una enfermedad metabólica o muscular primaria. Cuando es necesaria una biopsia muscular, ofrece la oportunidad de realizar una recolección adicional de tejido de diagnóstico e investigación con un riesgo mínimo de morbilidad adicional para el paciente. Dado que hay una serie de usos para cada muestra de tejido, es muy deseable establecer técnicas para el cultivo celular primario utilizando tejido quirúrgico que sean sencillas, eficientes y que requieran cantidades mínimas de tejido. Se requiere un triaje adecuado de las biopsias de músculo o piel para maximizar el aislamiento de las células primarias del tejido y el almacenamiento a largo plazo de material vivo. Además, la investigación con células madre y el cribado de fármacos son muy prometedores para el desarrollo de terapias para muchas enfermedades mediante ensayos basados en células 3,4.
Describimos aquí métodos para el aislamiento primario de células a partir de biopsias de músculo o piel humanas. Además, incluimos un protocolo para la inmortalización de células miogénicas, que es útil para generar grandes cantidades de células a partir de un individuo. Estas células se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, como los cribados de fármacos personalizados, que de otro modo serían inalcanzables con el bajo número general de células obtenidas del tejido primario.

<table><tbody><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue&nbsp; campana de bioseguridad para cultivo</td><td>Baker Company, Inc.</td><td>Centrífuga de sobremesa con campana</td><td></td>SterilGuard</tr><tr><td>, como el modelo Beckman&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Modelo Allegra 6R</td><td>Si se realiza la clasificación de células, se prefiere una centrífuga con refrigeración</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>Modelo Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo de tejidos, conectada a una fuente de CO2 Forma</td><td>Scientific&nbsp;</td><td>Serie II</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS)</td><td>Becton Dickinson</td><td>Model Aria</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos para el aislamiento de mioblastos primarios de tejido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Roche Applied Science</td><td>#04942078001</td><td>Prepare una solución de calcetín de 2,4 U/ml en</td></tr><tr><td>DMEM Colagenasa D&nbsp;</td><td>Roche Applied Science</td><td>#088882001</td><td>Prepare una solución madre de 10 mg/ml</td></tr><tr><td>1x Sterile Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS), libre de calcio y magnesio</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>#14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, fracción V</td><td>Sigma</td><td>#05470</td><td>Prepare una solución estéril de 1X HBSS 0.5% BSA para la clasificación FACS</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento estéril para mioblastos: Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM) con glucosa alta (4,5 g) suplementado con un 30% de suero fetal bovino</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Contiene L-glutamina</td></tr><tr><td>Solución de lisis RBC</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio stock 10mg/ml</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Prepare la solución madre diluyendo el polvo en agua destilada estéril</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD56 humano para citometría de flujo</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td>Anticuerpo conjugado con APC, se pueden utilizar otras etiquetas</td></tr><tr><td>Reactivos para la inmortalización de mioblastos primarios</td><td></td><td></td><td></td>Línea celular de</tr><tr><td>empaquetamiento Ecotropic</td><td>PE Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de empaquetamiento anfotrópico PA3174</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel de cerdo</td><td>Sigma</td><td>G1890-500g</td><td>Prepare una solución madre de gelatina al 0,1% en agua. Cubra el plato con la solución a 37 grados; C durante una hora. Retire la solución y agregue el medio.</td></tr><tr><td>PolyJet&nbsp;</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>345812</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td> EMD Los plásmidos <td>de Biosciences</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>pBabe que contienen mCDK4 y hTERT</td><td>no están disponibles</td><td></td> comercialmente <td>Stadler et al, 2013</td></tr><tr><td>Qiagen plasmid midiprep kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>Medio 199 (31150022)</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>DMEM (11965-092)</td><td>Mix 4:1 DMEM:199</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de mioblastos: 4:1 Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM) y Medium 199 suplementado con 15% de suero fetal bovino; Búfer HEPES de 0,02 M; 1,4 mg/L de vitamina B12; 0,03 mg/L de ZnSO4, 0,055 mg/L de dexametasona, 2,5 &mu; g/L de factor de crecimiento de hepatocitos y 10 &mu; g/L de factor de crecimiento de fibroblastos beta.</td><td>Tecnología de la vida (DMEM, F199); Biológico de Atlanta (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (Sulfato de zinc); Sigma (Vit.B12, dexametasona); Chemicon Internacional (HGF); Biopionero (betaFGF)&nbsp;</td><td>#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).&nbsp;</td><td>Prepare el medio y la solución madre Vit. B12 (20 mg/ml); Sulfato de zinc (60&micro; g/ml); Dex (55&micro; g/&micro; l) por separado para facilitar su uso. Solución madre de HGF (5&micro; g/ml) y FGF (20&micro; g/ml) deben añadirse frescamente cada semana a la concentración final de trabajo.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de cadena pesada de miosina para inmunotinción</td><td>Banco de hibridomas del desarrollo</td><td>Clon MF20 MF20</td><td></td></tr><tr><td>Desmin Anticuerpo para inmunotinción</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-376-S0</td><td>Clon D33</td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos para el aislamiento primario de fibroblastos cutáneos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio de transporte: RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 0,2% de penicilina/estreptomicina</td><td>Medio RPMI 1640: GIBCO Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo de fibroblastos primarios humanos: RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina</td><td>Suero fetal bovino: Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Solución de colagenasa: Colagenasa tipo 2 (100 mg) resuspendida en 12,5 ml de medio de cultivo de fibroblastos y esterilizada con filtro</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato estéril 1X solución salina (PBS) sin calcio ni magnesio</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Materiales para el aislamiento de mioblastos primarios</td> Tubos cónicos estériles <td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>50 ml y 15 ml</td><td>GeneMate/Bioexpress</td><td>C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))Bisturíes</td><td></td></tr> <tr><td>estériles</td><td>Aspen Surgical</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas estériles de 5, 10 y 25 ml Bellco</td><td>glass</td><td>1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)</td>Las <td>pipetas reutilizables se lavan, se taponan con algodón y se esterilizan en autoclave antes de su uso</td></tr><tr><td>Platos de plástico estériles tratados con cultivo de tejidos (10 cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Coladores de células de nailon estériles (100 &micro; m y 40 y micro; tamaño m)</td><td>BD Falcon</td><td>352340 (40&micro; m); 352360 (100&micro; m)</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Materiales para la inmortalización de</td><td></td><td></td><td></td>mioblastos</tr><tr><td>Estéril 0,45 y micro; m filtros</td><td>Millipore</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Anillos de clonación</td><td>Corning</td><td>#3166-8</td><td>Para limpiar y esterilizar en autoclave antes y después de su uso</td></tr><tr><td>Materiales para líneas celulares de fibroblastos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de plástico estériles de 35 mm tratadas con cultivo de tejidos</td><td>Greiner bio-one</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes estériles</td><td>DeRoyal</td><td>D4510A</td><td></td></tr><tr><td>Matraces estériles para cultivo de tejidos T25</td><td>Techno Plastic Product, TPP</td><td>90026</td><td>vendido en los EE. UU. por MIDSCI</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para modelado de enfermedades

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

La generación de líneas celulares específicas del paciente representa una herramienta inestimable para la investigación diagnóstica o traslacional, y estas células pueden recogerse a partir del tejido de la biopsia de piel o músculo disponible durante el estudio diagnóstico del paciente. En este protocolo, describimos una técnica para el aislamiento de células vivas a partir de pequeñas cantidades de músculo o tejido cutáneo para el cultivo primario de células. Además, proporcionamos una técnica para la inmortalización de líneas celulares miogénicas y líneas celulares de fibroblastos a partir de células primarias. Una vez que las líneas celulares se inmortalizan, se puede lograr una expansión sustancial de las células derivadas del paciente. Las células inmortalizadas son susceptibles de muchas aplicaciones posteriores, como el cribado de fármacos y la corrección in vitro de la mutación genética. En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.

La Figura 1 ilustra algunos de los pasos clave que participan en la disociación tejido primario: la cantidad exacta de tejido se pesa en una placa de cultivo tisular de Petri estéril (Figura 1A, B). El tejido se pica finamente utilizando escalpelos estériles, hasta que se obtuvo una suspensión de tejido (Figura 1C, D). Después de la adición de las enzimas de digestión, músculo primario de disociación del tejido se consigue normalmente mediante digestión enzimática dentr...

Este protocolo describe técnicas para el aislamiento de células vivas y el cultivo primario de líneas celulares miogénicas y fibroblastas a partir de tejido muscular o cutáneo. También se describe una técnica para la inmortalización de estas líneas celulares. En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

El objetivo general del siguiente experimento es aislar células musculares purificadas a partir de biopsias musculares de pacientes humanos e inmortalizarlas para estudios posteriores. Esto se logra primero pesando, moliendo y digiriendo el tejido recolectado para disociar las células mononucleares. Como segundo paso, las células miogénicas se purifican a partir de células no miogénicas mediante FACs.A continuación, las células miogénicas se infectan con CDK4 y H turt para generar células inmortalizadas. Los resultados muestran que las células musculares vivas derivadas de pacientes pueden amplificarse durante varios pases y diferenciarse según ensayos de fusión celular, la presencia de túbulos miocíticos contráctiles y la expresión de marcadores miogénicos. Las implicaciones de esta técnica van más allá del diagnóstico de enfermedades musculares, ya que podrían proporcionar un número ilimitado de células miogénicas para cribados farmacológicos u otras aplicaciones posteriores que requieran un gran número de células.Voy a demostrar el procedimiento junto con Jerome Robbin, un investigador posdoctoral del laboratorio del Dr. Woody Wright en Dallas. Comience disociando la biopsia muscular para purificar las células miogénicas. Primero, en una campana de seguridad biológica de cultivo celular, registre la masa de la biopsia muscular.A continuación, en una placa de 10 centímetros, use escalpelos estériles para picar el tejido en trozos finamente cortados. Añada unas gotas de X-H-B-S-S al 1× para que el tejido no se seque por cada gramo de tejido. Añada 3,5 mililitros de la solución de disco pastilla 2 y 3,5 mililitros de la solución de colagenasa D.Luego mezcle las células con una pipeta de 25 mililitros y transfiera la placa a un incubador cada 15 minutos. Mezcle las células con una pipeta de cinco mililitros dentro de los 90 minutos. Debe haber una disociación completa del tejido.Una vez que el tejido esté disociado, agregue dos volúmenes de medio de crecimiento y filtre a través de un tamiz de 100 micrones. Recoja el filtrado en un tubo de 50 mililitros. Pelote las células del filtrado a 329 G durante 10 minutos a temperatura ambiente.Luego, resuspenda las células en HBSS con 0,5 % de BSA y cuéntelas. Ajuste el volumen para obtener 1 millón de células por 100 microlitros. Separe una alícuota de 250.000 células como control sin teñir y reserve dos alícuotas similares para controles de tinción simple.Estos son todos necesarios para el análisis de fax. A continuación, tiña las células con cinco microlitros de anticuerpo anti CD 56 por millón de células, e incube todas las muestras en hielo durante media hora. Luego, lave rápidamente las muestras con 10 mililitros de HBSS.Luego, centrifugue las células como antes, pero a cuatro grados Celsius; después de que las células hayan sido centrifugadas, deseche el sobrenadante y resuspenda el botón celular en X-H-B-S-S al 1× a una concentración de cinco millones de células por mililitro. A continuación, añada yoduro de propidio hasta alcanzar una concentración final de un microgramo por mililitro. Ahora, purifique las células miogénicas positivas para CD56 a partir de las células no miogénicas utilizando el equipo de separación celular mediante citometría de flujo (FACS), siguiendo la placa de purificación.Las células miogénicas a 50.000 por pocillo en placas de seis pocillos recubiertas con gelatina al 0,1 %, incubar las células hasta que se adhieran, luego infectarlas con el virus para la inmortalización de la línea celular. En el protocolo descrito en el texto, hay una revisión adicional sobre cómo purificar y cultivar fibroblastos dérmicos, tal como se describe en el protocolo escrito. Preparar las células phoenix tropic después de incubarlas durante la noche con la mezcla de plásmido PolyJet.Alimente las células con medio fresco, compuesto por cuatro partes de DME M1, una parte de medio 199 y 10 % de suero de ternera. También prepare el empaque inotrópico. Siembre 400 000 células PA317 en una placa de seis pocillos, con aproximadamente 400 000 células PA317 por pocillo.Doce horas después, recolecte el sobrenadante que contiene el virus de las células Phoenix trópicas y páselo a través de un filtro de 0,45 micrones. Luego, use un mililitro del sobrenadante para infectar las células PA three 17 y cultívelas durante la noche. Al día siguiente, seleccione una línea celular productora de virus a partir de las células PA three 17 aplicando antibióticos a 0,5 miligramos por mililitro al medio cuando las células estén casi confluentes, y recolecte el sobrenadante de las células tres veces a intervalos de 12 horas.Filtre las recolecciones después de cada cosecha. El filtrado es el sobrenadante vírico de trabajo. Divídalo en alícuotas de un mililitro.Reserve algunos alícuotas para uso inmediato. Las alícuotas adicionales pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius, pero perderán el 50 % de eficiencia con cada ciclo de congelación y descongelación. Tenga en cuenta que durante todo el proceso, el equipo que haya estado en contacto con las partículas virales debe lavarse con lejía antes de desecharlo en el recipiente de desechos.Para almacenar permanentemente la línea celular estable productora del virus PA tres 17, congele las células en 10 % DMSO 90 % suero y almacénelas a menos 150 grados Celsius en cada pocillo de células purificadas por fax. En una placa de seis pocillos, agregue 400 microlitros de sobrenadante viral recién producido. Deje dos pocillos sin virus como controles.Incube la placa durante la noche y al día siguiente cambie el medio de cada pocillo a 2,5 mililitros de medio muscular fresco. Asegúrese de desechar los medios y las pipetas que contengan partículas virales en el recipiente con lejía. Deje que las células se incuben en el medio muscular fresco durante tres días.Luego, seleccione las células con resistencia al antibiótico utilizando 400 microgramos de neomicina por mililitro para la infección por CDK4, o 300 microgramos de higromicina por mililitro para la telomerasa humana. Incube con la infección por transcriptasa inversa durante una o dos semanas. Mantenga las células bajo condiciones selectivas hasta que las células y los pocillos de control estén completamente muertos.Siempre pase las células antes de que se vuelvan confluentes, incluso durante la selección, cuando alcancen entre el 60 y el 80 % de confluencia, utilice una solución de tripsina-EDTA al 0,05 % para recolectar y pasar las células. Pase las células a placas de 10 centímetros con medio fresco para mioblastos que contenga antibióticos. Siembre inicialmente las células a una densidad muy baja, entre tres y 500 por placa de 10 centímetros.Mantenga las células en estas placas durante aproximadamente dos semanas hasta que se formen colonias pequeñas de 10 a 20 células, momento en el cual las colonias pequeñas sean evidentes. Retire la mayor parte del medio, dejando solo una película delgada para evitar que las células se sequen. A continuación, sumerja un lado de un anillo de clonación en grasa de vacío de silicona y coloque el anillo sobre un clon deseado.Ponga un anillo diferente alrededor de cada clon deseado en cada anillo. Agregue unas gotas de solución de tripsina-EDTA. Cuando las células se redondeen, utilice un microscopio para aspirar cuidadosamente cada grupo de células en una punta de pipeta de 200 microlitros.Transfiera las bolas celulares a los pocillos de la placa multipozo más pequeña disponible. Luego amplíe cada clon según sea necesario para evitar la confluencia. Utilizando el protocolo descrito, se aislaron células miogénicas junto con fibroblastos, células adipogénicas y posiblemente células inmunitarias, y luego se purificaron mediante facts.A continuación, las células se inmortalizaron según se describió, utilizando virus que expresan la quinasa dependiente de ciclina cuatro, CDK4, y la telomerasa reversa humana hTERT. Fue crucial mantener las placas por debajo de la confluencia en cada paso, ya que podrían entrar en el programa de diferenciación y formar túbulos miotubulares. Comparando la formación y contracción de los túbulos miotubulares en células de control no inmortalizadas y en células inmortalizadas, no se observaron diferencias.La inmortalización de la línea celular se confirmó mediante la medición de la longitud de los telómeros y la actividad telomérica. La inmortalización también fue evidente a partir de las curvas de crecimiento celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo disociar células musculares primarias a partir de una biopsia del paciente.Inmortalice el mioblasto primario y aísle y seleccione clones miogénicos inmortalizados. No olvide que el trabajo con virus requiere el uso de una campana de cultivo celular específica y un sistema de ventilación seguro. Además, todo lo relacionado con la manipulación del virus, como pipetas, puntas, placas, jeringas y filtros, debe tratarse con lejía para evitar cualquier contaminación no deseada.Las partículas virales pueden ser peligrosas y siempre se deben tomar precauciones mientras se realiza este procedimiento.

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Investigación

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Medicine

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El micro-disección técnica de explantes es un método robusto y fiable para el aislamiento de proliferación células del músculo esquelético de los músculos menores, adultas o embrionarias como fuente de células madre de músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células han sido derivadas por clonación para producir músculo esquelético líneas de células madre utilizadas en el trasplante de vivo.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Aislamiento y cultivo de fibras musculares es el estándar de...

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Este protocolo utiliza la electroporación para introducir y expresar proteínas marcadas con fluorescencia en fibras musculares de ratón. Después de la recuperación después de la electroporación, las fibras se aíslan. A continuación, se obtienen imágenes de las fibras individuales mediante microscopía confocal de alta resolución para visualizar la estructura muscular.

ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras

Aquí, describimos una metodología para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de tejido muscular adulto. Estas células se utilizan para estudiar la diferenciación in vitro del músculo esquelético y, en particular, para estudiar las proteínas implicadas en la señalización del Ca 2+ .

Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

Presentamos técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar las células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) obtenidas del tejido de biopsia muscular esquelética.  los hMPC obtenidos y caracterizados a través de estos métodos se pueden utilizar para abordar posteriormente cuestiones de investigación relacionadas con la miogénesis humana y la regeneración muscular esquelética.

Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética

Los mióblastos están proliferando en células precursoras que se diferencian para formar miotubos polinucleados y, finalmente, miofibers musculares esqueléticos. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento eficiente y el cultivo de mioblastos primarios de los músculos esqueléticos adultos jóvenes. El método permite estudios moleculares, genéticos y metabólicos de las células musculares en el cultivo.

Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón

Aquí, proponemos un método para obtener eficientemente fibras musculares individuales en etapas de desarrollo postnatal tempranas a partir del modelo de ratón lamin 8-11 mutante homocigoto, un modelo muy severo para la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD).

Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Este protocolo describe el aislamiento de células madre musculares y progenitores fibroadipogénicos de músculos esqueléticos individuales en ratones. El protocolo incluye la disección de un solo músculo, el aislamiento de células madre mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, la evaluación de la pureza mediante tinción de inmunofluorescencia y la medición cuantitativa de la entrada en fase S mediante un ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales

Este protocolo proporciona un método estandarizado para aislar y enriquecer mioblastos primarios del músculo óseo de ratón adulto y neonatal mediante disociación tisular, filtración secuencial, pre-placado y condiciones definidas de cultivo, permitiendo el establecimiento y mantenimiento de cultivos de mioblastos derivados de células satélite para aplicaciones experimentales posteriores.

Aislamiento de células satélite del músculo esquelético para estudios in vitro de miogénesis

Aprende a aislar e inmortalizar células musculares de biopsias de pacientes mediante digestión tisular, FACS e infección viral con CDK4 y hTERT. Este método permite obtener líneas celulares ilimitadas para estudios de enfermedades musculares y cribado de fármacos.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades (Video) | JoVE Journal

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

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