Name: In vitro Caracterización funcional de ratón colorrectal aferente Endings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Aprende a caracterizar terminaciones nerviosas aferentes extrínsecas en colon rectal de ratón mediante grabaciones electrofisiológicas de fibra única in vitro. Este método permite clasificar respuestas mecánicas y químicas.

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Apoyado por el premio R01 de los NIH DK093525 (GFG). Apreciamos enormemente la revisión científica y la edición gramatical del manuscrito por la Dra. Amber Shaffer (Universidad de Pittsburgh) y agradecemos a Michael Burcham por su ayuda en la preparación de las figuras.

NOTA: Este protocolo fue revisado y aprobado por la Universidad de Pittsburgh Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. 1. Preparación de la solución de Krebs modificada y Prueba de la Droga alícuotas <ol><li> Hacer 6 L de solución de Krebs modificada que contiene (en mM): NaCl 117,9, KCl 4,7, 25 NaHCO 3, 1,3 NaH 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 2.5 CaCl 2, 11,1 D-glucosa, butirato de 2 de sodio, acetato de sodio 20 , 0.004 nifedipina (para bloquear las contracciones musculares espontáneas), y 0,003 de indometacina (para bloquear la síntesis de prostaglandinas endógenas). Utilice soluciones de Krebs hielo frío y caliente para la disección de tejidos y la grabación de una sola fibra, respectivamente. </li><li> Preparar las soluciones químicas (por ejemplo, IS, la capsaicina, ATP) en alícuotas a concentraciones deseadas. </li></ol> 2. La disección del nervio del tejido colorrectal- <ol><li> Anestesiar y eutanasia ratones machos (6-8 semanas de edad, 20 - 30 g) enuna cámara de CO 2 a un caudal que desplaza 10 a 30% de volumen de la cámara por minuto hasta que los ratones deje de respirar por completo como se indica por la ausencia de movimiento del pecho. </li><li> Inmediatamente después de la eutanasia, Exsanguinate cortando abierta la cámara torácica, perforando la aurícula derecha, y sumergir el cadáver del ratón en un amplio volumen (~ 500 ml) de helado de Krebs (4 ° C) solución burbujea con carbógeno (95% de O2 , 5% de CO 2). </li><li> Retire con cuidado todas las vísceras, pero los órganos de colon y de la pelvis. Transecto el ratón en un medio a través del segmento vertebral T12 ligeramente por encima del diafragma torácico y transferir la mitad caudal a una cámara de disección que contiene hielo frío, burbujear solución de Krebs. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico, retire la vejiga y los órganos reproductivos por transección en sus uniones a la uretra, y retire la descendente / aorta abdominal hasta que se bifurca en las arterias ilíacas comunes. Libertad para los PN o el LSN de su surrounding tejidos mediante disección roma y seguir el nervio desde fuera de la cresta ilíaca hasta su punto de entrada ventral en la L6 y S1 columna vertebral (por PN) o T13 y L1 columna vertebral (por LSN). </li><li> Cortar la sínfisis púbica y la derecha y articulaciones acetábulo izquierdo, y quitar el hueso ilíaco. Con cuidado, libre ya sea el PN o LSN de los músculos adheridos y tejido conectivo de cerca del colon y recto hasta donde el nervio entra en la columna vertebral. </li><li> Resecar con cuidado el hueso ilíaco para exponer el colon y recto distal. Diseccionar el colon y recto distal con el PN adjunto o LSN en continuo. </li><li> Transferir el colon y recto con el nervio unido al compartimento de baño de la cámara de tejido. Quitar el tejido conectivo excesivo por más de disección, y abrir el colon y recto longitudinalmente a lo largo de la frontera anti-mesentérica. </li><li> Con el lado de la mucosa hacia arriba, el pin del borde mesentérico del colon y recto junto al compartimento de registro en la base de silicona de la chamber y adjuntar la longitud del colon y recto antimesenteric a un rastrillo de ganchos conectados a un accionador de fuerza (ilustrado en la Figura 1 y se fotografió en la Figura 2A). </li><li> Extender el PN o LSN en el compartimento de la grabación, que está conectada al compartimiento de baño por un agujero del ratón y la puerta. Coloque suavemente el tronco nervioso a un pequeño espejo de cristal en el compartimiento de la grabación, lo que proporciona una superficie hidrófila para el nervio que adherirse. Superfuse el compartimiento de baño con agua caliente (30-32 ° C), solución de Krebs oxigenada y llenar el compartimento de grabación con aceite mineral. </li></ol> 3. sola fibra de grabación y localización del campo receptivo <ol><li> Retire con cuidado la espalda epineurio (vaina nerviosa) de la PN o LSN bajo el microscopio estereoscópico a gran aumento (50 - 60X). Con unas pinzas finas, se burlan del tronco nervioso en 5-8 haces nerviosos de ~ 100 micras de espesor. </li><li> Coloque la referencia de platino-iridioelectrodo en contacto con la solución de Krebs en la cámara de tejido. Colocar secuencialmente los haces de nervios individuales en el electrodo de registro hecha del mismo material. </li><li> Utilice un pincel suave para evocar APs de los aferentes colorrectales por acariciar suavemente hacia arriba y abajo de la superficie colorrectal. Busque el paquete (s) de nervios que inervan el colon a través de AP detectable (potencial de acción) grabaciones. NOTA: La PN y LSN también inervan la vejiga urinaria y otros órganos pélvicos. </li><li> Use un par de 30 puntas de las agujas G para dividir aún más el conjunto de nervios en filamentos finos fascículos de ~ 10 micras de espesor y colocar un filamento individual sobre el electrodo de registro. </li><li> Coloque el electrodo concéntrico de punta redonda perpendicular a la superficie de la mucosa para excitar eléctricamente terminaciones aferentes en la intensidad del estímulo por encima del umbral (10 mA magnitud, 0,5 mseg de duración @ 0,3 Hz), que produce un radio ~ 2 mm de propagación actual. Mueva el electrodo de forma sistemática (~ 1,5 mm pasos) A lo largo de la longitud y la anchura del colon y recto aplanado para localizar terminaciones receptivas. </li><li> Cuando se excita un final aferente, ajuste la posición del electrodo para localizar el sitio de activación (campo receptivo, RF) que requiere la intensidad del estímulo mínimo (umbral de estímulo). Deseche terminaciones con un umbral de estímulo&gt; 3 mA 19. </li><li> Calcular la velocidad de conducción (CV) a partir de 1) la distancia entre el electrodo de estimulación en el campo receptivo (RF) y el sitio de grabación y 2) el retraso de la conducción (por ejemplo, la Figura 2B) entre el artefacto del estímulo y el inicio del potencial de acción . CV (m / seg) = distancia (mm) / retraso de la conducción (ms). </li></ol> 4. Clasificación Funcional de mechanosensitive colorrectales Aferentes <ol><li> Después de localizar una RF mediante la estimulación eléctrica, aplique los tres estímulos mecánicos siguientes a la RF: <ol><li> Llevar a cabo el estímulo sondeo presionando la punta de una calibraciónmonofilamento ted von Frey-como el nylon (0,4 y 1 g fuerza) perpendicularmente hacia la RF en el colon y recto aplanada. </li><li> Llevar a cabo el estímulo acariciando por acariciar suavemente la mucosa colorrectal con un filamento de nylon fino (10 mg fuerza) para generar una pequeña tensión de corte superficial en la RF. </li><li> Realizar el tramo circunferencial utilizando una fuerza de accionamiento controlado por ordenador, que proporciona una fuerza de estiramiento en rampa (0-170 MN en 5 mN / seg) en dirección circunferencial a lo largo del borde anti-mesentérico del colon y recto a través de la comisión de ganchos que se describen en el paso 2.8 . </li></ol></li><li> Clasificar los aferentes como serosa (responder sólo a despuntar sondeo), la mucosa (responder a la mucosa acariciando y embotar sondeo), muscular (responder a tramo circunferencial y embotar sondeo) musculoso / mucosa (responder a tramo circunferencial, acariciando la mucosa y embotar sondeo), o MIA (no sensible a cualquiera de los tres estímulos mecánicos). </li><li> Para aferentes mesentéricas (sólo enla inervación LSN) que son difíciles de activar selectivamente mediante estimulación eléctrica, localizar sus terminaciones receptivas por caricias mecánica / sondeo del mesenterio. </li><li> Para aferentes sensibles al estiramiento (muscular y músculo-mucosas), determinar el umbral de respuesta, que se define como la fuerza que evoca la primera AP durante tramo en rampa. </li><li> Para los aferentes serosas, grabar sus respuestas a ascendiendo niveles de puntiforme de sondeo del campo receptivo impulsado por la fuerza del actuador controlado por ordenador. </li></ol> 5. Aplicación Química / Modulación de Endings Receptivo <ol><li> Grabar una respuesta de línea de base a un estímulo mecánico (es decir, la respuesta al tramo en rampa, punteada de sondeo, o acariciando la mucosa). </li><li> Escudo del borde inferior de un trozo de tubo (latón o acero inoxidable, 10 mm de alto y 4 x 4 mm 2 plaza o 4-5 mm de diámetro) con vaselina y colóquelo sobre el campo receptivo en el colon y recto. </li><li> Quitarla solución de Krebs dentro de la tubería, y exponer el final receptivo durante 3 - 5 min a 170 l de la solución que contiene la sustancia química (s) a ensayar. </li><li> Monitorear la respuesta de la aferente durante la aplicación química (algunas aferentes son quimiosensible). </li><li> Retire la solución química y la tubería para finalizar la operación de la sustancia química. Dentro de 4 - 6 min, probar la respuesta aferente al mismo estímulo mecánico como en la respuesta de línea base. </li><li> Volver a aplicar el estímulo mecánico de nuevo después de un período suficiente de wash-out (&gt; 15 min). </li></ol> 6. picos de grabación y Discriminar AP <ol><li> Digitalizar las señales eléctricas registradas de axones a 20 kHz y guardar los datos en una computadora. Monitorizar la señal en línea por un monitor de audio. </li><li> Analizar los picos de AP fuera de línea y discriminar unidades individuales basados ​​en el análisis de componentes principales de las formas de onda de pico individuales 25. NOTA: Un registro no debe contener más ésimoun dos unidades activas fácilmente discernibles. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El vitro preparación colon y recto-nervio en descrito aquí ha demostrado ser un poderoso enfoque para estudiar las funciones de codificación neural de aferentes colorrectales individuales, que complementa muy bien con otros métodos no funcionales (por ejemplo, estudios celulares, moleculares e histológicos) sobre las neuronas sensoriales viscerales ( ver el comentario 27 para más detalles). Mecanismos neuronales que contribuyen a la nocicepción y la hipersensibilidad colorrectal a l...

El dolor y la hipersensibilidad son las quejas predominantes de pacientes que sufren de trastornos gastrointestinales funcionales, incluyendo el síndrome del intestino irritable (IBS), que existen en la ausencia de causa patobiológico aparente o daño tisular. Por ejemplo, los pacientes con SII presentan hipersensibilidad, incluyendo las respuestas aumentadas a la distensión rectal globo y aumento de la sensibilidad durante la función normal del intestino, así como hipersensibilidad de referencia somáticas (es decir, sensibilidad a la palpación de la zona abdominal) 1. Debido a la orientación aferentes colorrectal ha demostrado ser eficaz en el alivio de dolor e hipersensibilidad en los pacientes con SII (por ejemplo, la instilación intra-rectal de los anestésicos locales 2,3; ingestión oral de la guanilato ciclasa C agonista linaclotide 4-6), la mejora de la comprensión de la inervación aferente del colon y recto es importante. Aferentes viscerales aferentes, incluyendo colorrectal, Son capaces de responder a las modalidades químicas / en nutrientes y térmicos (por ejemplo, 7-9). Sin embargo, los aferentes viscerales que responden a estímulos mecánicos (es decir, aferentes mechanosensitive) han sido el más estudiado, porque los estímulos mecánicos (por ejemplo, distensión luminal, estrías) son los que generalmente dan lugar a sensaciones conscientes, incluyendo malestar y dolor 10-16. Además, las vísceras también están inervadas por fibras aferentes mecánicamente insensibles (MIAs), comúnmente denominadas nociceptores silenciosos o para dormir 17. En condiciones fisiológicas normales, MIAs no responden a la estimulación mecánica o tienen muy alta respuesta umbrales de 18, pero pueden llegar a ser activa y adquirir mechanosensitivity en condiciones fisiopatológicas y contribuir a la hipersensibilidad. Uso de la preparación in vitro y el protocolo descrito aquí, hemos desarrollado y empleamos una estrategia de estímulo eléctrico al mar<html> RCH para terminaciones receptivo, que permitan identificar imparcial de ambas terminaciones mechanosensitive y MIA en el colon y recto 19. La inervación colorrectal se deriva de esplácnico lumbar (LSN) y el nervio pélvico (PN) itinerarios, e incluye los aferentes colorrectal que se pueden clasificar en cinco clases mechanosensitive (serosa, mucosa, muscular, músculo-mucoso, mesentéricos) y una clase MIA 20. Usando esta preparación in vitro, se encontró que MIAs colorrectales mechanosensitivity adquirida (sensibilizar) siguiente breve exposición de sus campos receptivos a una sopa inflamatoria (IS), que sensibiliza 71% de MIAs en la vía de PN y 23% de MIAs en la vía LSN 19. También documentamos sensibilización a largo plazo (hasta 28 días) de los desaparecidos en acción en el contexto de larga duración hipersensibilidad visceral comportamiento (es decir, en los ratones que recibieron tratamientos intracolónicas con zymosan 21 o ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS) 22) . jove_content &quot;&gt; Entre los aferentes mechanosensitive, aferentes musculares y músculo-mucosas son las únicas clases que tónicamente codifican tramo circunferencial del colon y recto (es decir, son sensibles al estiramiento) y estar al servicio de la codificación de la distensión colorrectal nociva 23,24. El uso de un controlado por ordenador la fuerza del actuador, se aplicó un estándar, homogéneo, y el estiramiento en rampa reproducible en la dirección circunferencial del tejido colorrectal aplanada y clasifican además aferentes sensibles al estiramiento como de bajo umbral y de alto umbral 23. Además, el curso temporal de la sensibilización de estiramiento aferentes -sensibles después zimosan intracolónica 21 o 22 TNBS tratamiento corresponde a la aparición, persistencia y / o recuperación de la hipersensibilidad visceral de comportamiento, lo que sugiere un papel de los aferentes colorrectales sensibles al estiramiento en el dolor visceral e hipersensibilidad.

<table><tbody><tr><td>Microscopio estereoscópico Leica MZ16</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara Leica IC D</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>World Precision instruments, Inc.</td><td>SYS-DAM80</td><td>Amplificador diferencial de bajo ruido</td></tr><tr><td>Cámara de tejido de dos compartimentos</td><td>Hecho a</td><td></td><td></td>medida</tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>Adquisición de datos, entrada/salida de señal analógica</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>Paquete de software que funciona con el monitor de audio Power1401</td></tr><tr><td></td><td>Natus</td><td>Am </td><td></td>8</tr><tr><td>Estimulador de impulsos cuadrado</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>Para administrar estímulos eléctricos</td></tr><tr><td>Unidad de aislamiento fotoeléctrico</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>Aislamiento de estímulos para reducir el ruido</td></tr><tr><td>Microelectrodo bipolar concéntrico</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>Para entregar estímulos eléctricos</td></tr><tr><td>Sistema de palanca de modo dual</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Serie 300C</td><td>Para administrar estímulos mecánicos</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Pinzas con puntas finas</td></tr></tbody></table>

in vitro caracterización funcional de ratón colorrectal aferente endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

Este video muestra en detalle una fibra única protocolo de registro electrofisiológico in vitro usando una preparación ratón colon y recto-nervio. El enfoque imparcial permite la identificación y caracterización funcional de los aferentes colorrectales individuales. Grabaciones extracelulares de los potenciales de acción se propagan (AP) que se originan en uno o unos pocos aferente (es decir, de una sola fibra) campos receptivos (FR) en el colon y recto están hechos de fascículos de fibras nerviosas burlado. El colon y recto se retira, ya sea con la pelvis (PN) o esplácnico lumbar (LSN) nervio conectado y abierto longitudinalmente. El tejido se coloca en una cámara de registro, clavado plana y perfundidos con solución de Krebs oxigenada. Estimulación eléctrica focal se utiliza para localizar las terminaciones aferentes colorrectales, que son probados además por tres estímulos mecánicos distintos (embotar sondeo, acariciando la mucosa y estiramiento circunferencial) para clasificar funcionalmente los aferentes en cinco mechanosensiclases tivas. Endings responden a ninguno de estos estímulos mecánicos se clasifican como aferentes mecánicamente insensibles (MIAs). Tanto mechanosensitive y MIAs pueden ser evaluados para la sensibilización (es decir, la respuesta mejorada, umbral reducido, y / o adquisición de mechanosensitivity) por la exposición localizada de RFs a los productos químicos (por ejemplo, sopa inflamatoria (IS), la capsaicina, el trifosfato de adenosina (ATP)). Describimos el equipo y preparación de grabación de colon y recto-nervio, la cosecha de colon y recto con PN adjunto o LSN, la identificación de los FR en el colon y recto, la grabación de una sola fibra de los fascículos nerviosos, y la aplicación localizada de productos químicos para la RF. Además, también se discuten los retos de la preparación y la aplicación de la estimulación mecánica estandarizada.

La configuración se ilustra en la Figura 1. Incluye una cámara de tejido a medida que alberga el colon y recto en un baño de silicona compartimento forrado y el nervio adjunto en un compartimento lleno de aceite mineral contigua. La cámara de dos compartimentos fue a máquina de un bloque sólido de plástico acrílico por una máquina de CNC; la parte inferior de ambos compartimentos fue posteriormente revestido con silicona firme para permitir una fácil pin abajo del tejido colorrectal. AP extracelulares d...

Este video demuestra un protocolo para realizar registros electrofisiológicos de una sola fibra en una preparación in vitro del nervio colorrectal de ratón.

In vitro Caracterización funcional de ratón colorrectal aferente Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar funcionalmente las terminaciones nerviosas aferentes extrínsecas en el recto del ratón in vitro. Esto se logra extrayendo el colon-recto junto con el nervio pélvico o lumbar de la cadena ganglionar en continuidad y colocando el tejido en una cámara de registro in vitro. Como segundo paso, el tronco del nervio pélvico o lumbar de la cadena ganglionar se divide en finos filamentos para poder realizar grabaciones electrofisiológicas de fibra individual en axones nerviosos aislados. A continuación, se identifican terminaciones nerviosas individuales en el colon-recto mediante estimulación eléctrica imparcial de los campos receptivos y se clasifican funcionalmente según los perfiles de respuesta a tres estímulos mecánicos distintos.Además, se pueden probar las respuestas a productos químicos aplicados en las terminaciones nerviosas mediante el aislamiento del campo receptor con un trozo de tubo de latón y la sustitución de la solución por otra que contenga el producto químico o mezcla de productos químicos. Los resultados muestran que el colon y recto del ratón están inervados por cinco clases diferentes de EN mecanosensitivos. Además, aproximadamente el 25 % de los EN colorectales son nociceptores insensibles mecánicamente o silenciosos.Este método es utilizado por nosotros y otros investigadores para estudiar la inervación sensorial del colon y el recto. Estamos interesados en emplear este enfoque de investigación porque muchos trastornos gastrointestinales están asociados con la sensibilización o un cambio en la excitabilidad de la inervación sensorial. Nuestro interés en comprender los mecanismos de la sensibilización se relaciona con nuestro deseo de contribuir al desarrollo de estrategias terapéuticas que podrían ser útiles para modular el dolor y la molestia que generalmente se asocian con estos trastornos gastrointestinales, como el síndrome del intestino irritable.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección del tejido y los pasos de división del nervio son muy difíciles de dominar. Los nervios que inervan el colon y el recto distales pueden dañarse fácilmente durante la disección.Por lo tanto, una disección cuidadosa y los pasos de separación son realmente cruciales para quienes deseen replicar este experimento. Inmediatamente después de sacrificar al ratón, exángruelo, abra la cavidad torácica, perfore el atrio derecho e introduzca el cadáver del ratón en aproximadamente medio litro de solución Creb fría con hielo. A continuación, retire cuidadosamente todas las vísceras, excepto el colon y los órganos pélvicos.Luego, seccione el cuerpo del ratón aproximadamente en T12, ligeramente por encima del diafragma torácico, y transfiera la mitad inferior del cuerpo a una cámara de disección que contenga solución de Krebs burbujeada y fría. Bajo un estereoscopio, retire la vejiga y los órganos reproductivos seccionando en sus uniones con la uretra. Asimismo, retire la aorta descendente hasta donde se bifurca en las arterias ilíacas comunes.Ahora, libere los nervios sacroplánquicos pélvicos o lumbares del tejido circundante. Siga los nervios desde fuera de la cresta ilíaca hasta su punto de entrada en la columna vertebral. Los nervios pélvicos entran en las vértebras L6 y S1, y los nervios sacroplánquicos lumbares entran en T13 y L1, como se muestra.Aquí se muestra la disección de los nervios pélvicos izquierdo y derecho. A continuación, corte la sínfisis púbica y seccione las articulaciones acetabulares derecha e izquierda. Luego retire el hueso ilíaco. Tras la eliminación del ilíaco, diseque el colon y recto distales junto con el nervio adherido libremente.El nervio está unido al músculo circundante y al tejido conectivo. El nervio es susceptible al daño mecánico. Se libera de su tejido circundante, por lo que se debe tener especial cuidado para evitar tirar o pellizcar el nervio.Luego, transfiera el colon rectal con el nervio adherido a la cámara de tejido. Abra el colon rectal longitudinalmente a lo largo del borde anti-mesentérico y coloque la cara mucosa del colon rectal hacia arriba. A continuación, extienda el nervio hacia el compartimento de registro, que está conectado al compartimento del baño mediante un orificio y una compuerta para ratón.Coloque el tronco nervioso sobre un pequeño espejo de vidrio. El espejo es hidrofílico y el nervio se adherirá a él. Ahora, junto al compartimento de registro, sujete con alfileres el borde mesentérico del colon-recto.Ahora, suplemente un compartimento de baño con solución Creb tibia y oxigenada y llene el compartimento de registro con aceite mineral para completar el montaje. Fije la longitud anti-mesentérica del colon-recto a un rastrillo de ganchos conectado a un actuador de fuerza bajo el microscopio estereoscópico con alta ampliación. Retire cuidadosamente la vaina nerviosa del nervio pélvico o lumbar aislado usando pinzas finas.Separar el tronco nervioso en cinco a ocho haces nerviosos, cada uno de aproximadamente 100 micrones de grosor. Ahora coloque el electrodo de referencia en contacto con la solución de Krebs en la cámara de tejidos. Luego, coloque secuencialmente cada haz nervioso sobre el electrodo de registro para provocar potenciales de acción del plexo intrínseco colorrectal.Acarikee suavemente la superficie colorrectal utilizando un pincel suave. De este modo, identifique el haz o los haces nerviosos que inervan el colon. Ahora, utilizando las puntas de una aguja de calibre 30, divida aún más el haz nervioso en filamentos de 10 micrones de grosor y coloque uno de los filamentos sobre el electrodo de registro.Este paso exige un alto nivel de coordinación ojo-mano y destreza. Luego, para excitar eléctricamente las terminaciones nerviosas aferentes, coloque el electrodo concéntrico de punta redondeada perpendicularmente a la superficie mucosa y estimule con una intensidad supraliminar. Esto produce una dispersión de corriente en un radio de dos milímetros.Para encontrar terminaciones receptivas, mueva el electrodo sistemáticamente en pasos de 1,5 milímetros a lo largo de la longitud y el ancho del recto aplanado. Cuando se excite una terminación aferente, ajuste la posición del electrodo y la intensidad del estímulo para localizar con precisión el campo receptor que requiera la menor intensidad de estímulo para responder. Si el umbral del estímulo es mayor de tres miliamperios, deseche esa terminación nerviosa y continúe con el estudio de otro filamento nervioso.Ahora calcule la velocidad de conducción a partir de la distancia entre el electrodo estimulante en el campo receptivo y el sitio de registro, y del retardo de conducción entre el artefacto del estímulo y los inicios del potencial de acción. Después de localizar un campo receptivo mediante estímulo eléctrico, aplique tres estímulos mecánicos. Primero, aplique un estímulo exploratorio presionando perpendicularmente la punta de un monofilamento de von Frey calibrado, como nylon, hacia el campo receptivo sobre el colon-recto aplanado.Utilice monofilamentos que produzcan una fuerza de 0,4 gramos y una fuerza de un gramo. En segundo lugar, produzca un estímulo de acariciado acariciando suavemente la mucosa colorrectal con un filamento fino de nailon que genere una fuerza de 10 miligramos para crear un pequeño esfuerzo cortante superficial en el campo receptor. En tercer lugar, realice el estiramiento circunferencial utilizando un actuador de fuerza controlado por computadora.Haga que entregue una fuerza de tracción escalonada en dirección circunferencial a lo largo del borde antimesentérico del colon y recto. Ahora clasifique el SNE como aferente insensible mecánicamente seromucoso muscular, muscular mucoso o MIAA, según los resultados de las tres pruebas.Comience registrando una respuesta basal a un estímulo mecánico como en la sección anterior, mediante una estimulación mecánica rampante, circunferencial, de estiramiento o perpendicular para evaluar la sensibilidad química. Primero, cubra el borde inferior de un trozo de tubo de latón o acero inoxidable con vaselina y colóquelo sobre el campo receptivo del colon rectal. Ahora aspire la solución de Krebs desde el interior del tubo y reemplace la solución con 170 microlitros de la solución de prueba.Deje el tubo en posición durante tres a cinco minutos mientras monitorea las respuestas en la aferente. Inmediatamente después de retirar el tubo, dentro de los cuatro a seis minutos, pruebe la respuesta aferente al mismo estímulo mecánico que en la respuesta basal. Después de 15 minutos o más, se puede considerar que los reactivos han sido eliminados por lavado.Luego, el estímulo mecánico se aplica nuevamente. Para comparar con las hormigas de línea base, se estimuló un nervio diseccionado para encontrar un campo receptivo. El campo receptivo se identificó mediante una respuesta de potencial de acción utilizando el retardo de conducción del potencial de acción.La velocidad de conducción calculada fue de 0,43 metros por segundo, lo cual se encuentra bien dentro del rango de una fibra C no mielinizada. Después de identificar el campo receptivo, se exploró perpendicularmente mediante monofilamentos tipo von Frey manuales y también se acarició suavemente con un filamento fino de nailon manual. Las respuestas de las FRA a la exploración también se evaluaron mediante un actuador de fuerza controlado por ordenador que aplica en el mismo sitio del colon y recto una serie de fuerzas mecánicas precisamente temporizadas y reproducibles.De manera similar, se aplicó un estiramiento circunferencial al colon-recto mediante el mismo esfuerzo del actuador. Las respuestas pueden distinguirse según las respuestas a la exploración, al acariciar y al estiramiento; las respuestas de una aferencia sensible al estiramiento fueron evocadas mediante tres estiramientos circunferenciales consecutivos separados por cinco minutos. El número de potenciales de acción se fijó uniformemente y se mostró como funciones de respuesta al estímulo, revelando una alta reproducibilidad, tanto en la magnitud de la respuesta como en el umbral de respuesta.A continuación, se aplicaron los siguientes productos químicos. La activación directa de ens se produjo tras la aplicación de una solución hipertónica ácida, después de aplicar una mezcla inflamatoria a una aferente mecánicamente insensible. No se observó activación del terminal, pero fue evidente la adquisición de sensibilidad al meno.Un aferente sensible al estiramiento y menos sensible al meneo también se sensibilizó al estiramiento mecánico del campo receptor tras la aplicación de un caldo inflamatorio. Una vez dominada la técnica, normalmente se tardan entre tres y cuatro horas en completar la disección del tejido y lograr el registro de una fibra individual. Un experimento típico requiere un día completo desde el inicio hasta el final. Tras ver este video, debería comprender cómo extirpar quirúrgicamente y obtener el colon y el recto con los nervios adheridos.Luego, será posible realizar registros de fibras Ahern individuales en el nervio pélvico o en el nervio esplácnico lumbar, que inervan el colon, mediante una estrategia eléctrica de búsqueda imparcial. A continuación, deberá identificar terminaciones receptoras en el recto y probar su sensibilidad mecanoceptiva, así como su sensibilidad química, mediante la aplicación directa de sustancias químicas sobre las terminaciones receptoras. Este preparado constituye un modelo potente que permite estudiar mecanismos fisiopatológicos, así como cuestiones fisiológicas básicas, en el colon y el recto.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

En este video, describimos un procedimiento quirúrgico para generar un bucle de colon proximal de ratón o un segmento pcLoop seguido de una inyección intraluminal de marcadores fluorescentes en el segmento para estudiar la permeabilidad epitelial intestinal.

Generación de un modelo de asa de colon proximal en ratón: un procedimiento quirúrgico para generar asa de colon proximal y medir la permeabilidad intestinal mediante la detección de marcadores fluorescentes en suero después de la inyección intraluminal

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Este video muestra el proceso de registro de señales eléctricas de nervios aferentes mesentéricos en un segmento yeyuno de ratón disecado para estudiar los efectos de la presión tisular y los cambios de movimiento en la actividad de los nervios aferentes.

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In Vitro de grabación de la actividad nerviosa aferente mesentérica en ratón yeyunal y segmentos del colon

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In Vitro Caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las fibras aferentes colónicas en ratas

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In vitro Caracterización funcional de ratón colorrectal aferente Endings

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