In vitro Caracterización funcional de ratón colorrectal aferente Endings

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar funcionalmente las terminaciones nerviosas aferentes extrínsecas en el recto del ratón in vitro. Esto se logra mediante la recolección del nervio colorrectal y el nervio pélvico o lumbar adjunto del cuello Splunk en continuo y colocando el tejido en una cámara de registro in vitro. Como segundo paso, el tronco nervioso del cuello Splunk pélvico o lumbar se divide en filamentos finos para que se puedan realizar registros electrofisiológicos de una sola fibra con axones nerviosos individuales. A continuación, las terminaciones nerviosas colorrectales individuales se identifican mediante estimulación eléctrica imparcial de los campos receptivos y se clasifican funcionalmente en función de los perfiles de respuesta a tres estímulos mecánicos distintos.

Además, las respuestas a los productos químicos aplicados a las terminaciones nerviosas se pueden probar aislando el campo receptivo con un trozo de tubo de latón y reemplazando la solución con la solución que contiene el producto químico o la mezcla de productos químicos. Los resultados muestran que el colorrectal de ratón está inervado por cinco clases diferentes de ens sensibles a los mecanos. Además, alrededor del 25% de los pacientes colorrectales son nociceptores mecánicamente insensibles o silenciosos.

Este método es utilizado por nosotros y otros para estudiar la inervación sensorial del colorrectal. Estamos interesados en utilizar este enfoque de investigación porque muchos trastornos gastrointestinales se asocian con la sensibilización o un cambio en la excitabilidad de la inervación sensorial. Nuestro interés en comprender los mecanismos de sensibilización se relaciona con nuestro deseo de ayudar a desarrollar estrategias terapéuticas que luego puedan ser útiles para modular el dolor y las molestias que suelen asociarse con estos trastornos gastrointestinales, como el síndrome del intestino irritable.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de disección de tejidos y división de nervios son muy difíciles de dominar. Los nervios innovando. El colorrectal distal puede dañarse fácilmente durante la disección.

Por lo tanto, una disección cuidadosa y los pasos de división son realmente críticos para aquellos que quieren replicar este experimento. Inmediatamente después de sacrificar a un ratón, exangunarlo, abrir la cámara torácica, perforar la aurícula derecha y sumergir el cadáver del ratón, y aproximadamente medio litro de solución de Creb helada. A continuación, retire con cuidado todas las vísceras excepto el colon y los órganos pélvicos.

A continuación, seccione el cuerpo del ratón aproximadamente a T 12, ligeramente por encima del diafragma torácico, y transfiera la mitad del cuerpo a una cámara de disección que contenga una solución de crebs de burbujas heladas. Bajo un estereoscopio, se extirpa la vejiga y los órganos reproductores mediante un transecto en sus uniones con la uretra. Además, extirpe la aorta descendente hasta que se bifurque en las arterias ilíacas comunes.

Ahora, libere los nervios pélvicos o del cuello lumbar de los tejidos circundantes. Siga los nervios desde el exterior de la cresta ilíaca hasta su punto de entrada en la columna vertebral. Los nervios pélvicos entran en la columna vertebral L 6 y S y los nervios lumbares entran en T 13 y L uno.

Aquí está la disección de los nervios pélvicos izquierdo y derecho. A continuación, corte la síntesis púbica y corte las articulaciones acetabulares derecha e izquierda. A continuación, retire el hueso ilíaco Después de extirpar el ilíaco, diseccione el colorrectal distal con el nervio adjunto libre.

El nervio unido del músculo circundante y el tejido conectivo. El nervio es susceptible a daños mecánicos. Estamos liberados de su tejido circundante, por lo que hay que tener especial cuidado para evitar tirar o pellizcar el nervio.

A continuación, transfiera el tejido colorrectal con el nervio adherido a la cámara de tejido. Abra el colorrectal longitudinalmente a lo largo del borde antimesentérico y coloque la mucosa colorrectal hacia arriba. A continuación, extienda el nervio hasta el compartimento de grabación, que está conectado al compartimento de la bañera mediante un orificio para el ratón y una puerta.

Coloque el tronco nervioso sobre un pequeño espejo de vidrio. El espejo es hidrófilo y el nervio se adherirá a él. Ahora, junto al compartimento de grabación, sujete el borde mesentérico del colorrectal.

Ahora superfusiona un compartimento de baño con una solución de Creb oxigenada tibia y llena el compartimento de grabación con aceite mineral para completar la configuración. Fije la longitud antimesentérica del colorrectal a un rastrillo de ganchos conectados a un actuador de fuerza bajo el microscopio estereoscópico a gran aumento. Retire con cuidado la vaina nerviosa del nervio aislado del cuello de la pélvica o la plancación lumbar con pinzas finas.

Divide el tronco nervioso en cinco a ocho haces nerviosos de aproximadamente 100 micras de grosor cada uno. Ahora coloque el electrodo de referencia en contacto con la solución de Krebs en la cámara de tejido. A continuación, coloque secuencialmente los haces de nervios individuales en el electrodo de registro para evocar los potenciales de acción del enss colorrectal.

Frote suavemente la superficie colorrectal con un pincel suave. Por lo tanto, identifique el haz o haces nerviosos que inervan el colon. Ahora, utilizando un par de puntas de aguja de calibre 30, divida aún más el haz nervioso en filamentos de 10 micras de grosor y coloque uno de los filamentos en el electrodo de registro.

Este paso exige un alto nivel de coordinación ojo-mano y destreza. Luego, para excitar eléctricamente las terminaciones nerviosas aferentes, coloque el electrodo concéntrico de punta redonda perpendicular a la superficie mucosa y estimule a una intensidad supraumbral. Esto produce una dispersión de corriente en un radio de dos milímetros.

Para encontrar las terminaciones receptivas, mueva el electrodo sistemáticamente en pasos de 1,5 milímetros a lo largo y ancho del co recto aplanado. Cuando se excita una terminación aferente, ajuste la posición del electrodo y la intensidad del estímulo para identificar el campo receptivo que requiere la menor intensidad de estímulo para responder. Si el umbral del estímulo es superior a tres miliamperios, descarta esa terminación nerviosa y pasa a estudiar otro filamento nervioso.

Ahora calcule la velocidad de conducción a partir de la distancia entre el electrodo estimulador en el campo receptivo y el sitio de registro, y a partir del retraso de conducción entre el artefacto del estímulo y los inicios del potencial de acción. Después de localizar un campo receptivo por estímulo eléctrico, aplique tres estímulos mecánicos. En primer lugar, aplique un estímulo de sondeo presionando la punta de un von fray calibrado, como un monofilamento de nylon, perpendicularmente hacia el campo receptivo en el colorrectal aplanado.

Utilice monofilamentos que produzcan una fuerza de 0,4 gramos y un gramo. En segundo lugar, produzca un estímulo de caricia acariciando suavemente la mucosa colorrectal con una fina hebra de filamento de nailon que produce una fuerza de 10 miligramos para generar una pequeña tensión de cizallamiento superficial en el campo receptivo. En tercer lugar, realice el estiramiento circunferencial utilizando un actuador de fuerza controlado por computadora.

Haga que entregue una fuerza estirada en rampa en una dirección circunferencial a lo largo del borde antimesentérico del colorrectal. Ahora clasifique el SNE como seroso, mucoso, muscular, muscular, mucoso, o MIAA, mecánicamente insensible, aferente. Basado en los resultados de las tres pruebas.

Comience registrando una respuesta de referencia a un estímulo mecánico como en la sección anterior mediante un sondeo mecánico circunferencial en rampa, de estiramiento o perpendicular para probar la sensibilidad química. Primero cubra el borde inferior de un trozo de tubo de latón o acero inoxidable con petróleo y colóquelo sobre el campo receptivo en el colorrectal. Ahora aspire la solución Krebs desde el interior del tubo y reemplace la solución con 170 microlitros de solución de prueba.

Deje el tubo en su posición durante tres a cinco minutos mientras monitorea las respuestas en el aferente. Inmediatamente después de retirar el tubo, dentro de cuatro a seis minutos, pruebe la respuesta aferente al mismo estímulo mecánico que en la respuesta basal. Después de 15 minutos o más, los reactivos se pueden considerar lavados.

A continuación, se vuelve a aplicar el estímulo mecánico. Para comparar con las hormigas de referencia, se estimuló un nervio disecado para encontrar un campo receptivo. El campo receptivo se identificó mediante una respuesta de potencial de acción utilizando el retardo de conducción del potencial de acción.

La velocidad de conducción calculada fue de 43 metros por segundo, que está en el rango de una fibra C no mielinizada. Después de identificar el campo receptivo, se sondeó perpendicularmente con monofilamentos de von fray de mano, y también se acarició suavemente con un filamento de nailon fino de mano. Las respuestas de AFR al sondeo también se evaluaron mediante un actuador de fuerza controlado por computadora que suministra en el mismo sitio en el colorrectal, una serie de fuerzas mecánicas reproducibles y sincronizadas con precisión.

De manera similar, el estiramiento circunferencial del colorrectal se produjo mediante el mismo esfuerzo del actuador. Las respuestas se pueden distinguir en función de las respuestas al sondeo, las caricias y las respuestas de estiramiento de una aferente sensible al estiramiento fueron evocadas por tres tramos circunferenciales consecutivos separados por cinco minutos. Los números de los picos se fijaron uniformemente y se mostraron como funciones de respuesta al estímulo, lo que reveló una alta reproducibilidad y tanto la magnitud de la respuesta como el umbral de respuesta.

A continuación, se aplicaron los productos químicos. La activación directa de ens ocurrió después de una aplicación de una solución hipertónica ácida después de la aplicación de una sopa inflamatoria a una aferente mecánicamente insensible. No se produjo ninguna activación de la terminación, pero la adquisición de la sensibilidad meno fue evidente.

Un aferente sensible al estiramiento y sensible al meno también se sensibilizó al estiramiento mecánico del campo receptivo después de la aplicación de una sopa inflamatoria Una vez dominado, generalmente se necesitan de tres a cuatro horas para completar la disección del tejido y lograr el registro de una sola fibra. Un experimento típico dura un día entero de principio a fin. Después de haber visto este video, debe comprender cómo extirpar y extraer quirúrgicamente el colorrectal con los nervios unidos.

A continuación, ser capaz de registrar a partir de fibras individuales de Ahern en el nervio pélvico o en el nervio lumbar plank, inervando el colon utilizando una estrategia de búsqueda eléctrica imparcial. A continuación, debería ser capaz de identificar las terminaciones receptivas en el co recto y probarlas para determinar la sensibilidad a los mecános, así como la sensibilidad a la quimioterapia, mediante la aplicación de productos químicos directamente a las terminaciones receptivas. Esta preparación es una preparación poderosa que le permite estudiar los mecanismos fisiopatológicos, así como cuestiones fisiológicas básicas en el colorrectal.