Qué hacer y qué no hacer de crio-microscopía electrónica: Una introducción a la preparación de muestras y de alta calidad de recopilación de datos para la Reconstrucción de Macromoléculas 3D

El objetivo del siguiente experimento es poder obtener imágenes de macromoléculas en su estado hidratado congelado con el microscopio electrónico de transmisión. Esto se logra sumergiendo rápidamente la rejilla con la muestra en el criógeno para obtener una muestra delgada vitrificada. Como segundo paso, la muestra se expone al haz de electrones, que formará una imagen de proyección de las macromoléculas.

A continuación, las imágenes se procesan en el ordenador con el fin de obtener la reconstrucción 3D de la macromolécula. Los resultados muestran una estructura 3D muy detallada de la macromolécula, su confirmación y la ubicación 3D de sus socios moleculares. Hay una ventaja principal de esta técnica, de otros métodos de preparación de muestras para electromicroscopía.

En la crionucleosis, la imagen está formada directamente por los electrones dentro de la macromolécula. Esto refleja más fielmente, su estructura casi nativa. Una demostración visual de este método es fundamental.

La preparación de la rejilla criogénica y se transfiere al microscopio electrónico son difíciles de aprender debido a la complicación adicional cuando se trabaja a temperaturas criogénicas, el ciclo de calentamiento se utiliza al comienzo de la secuencia de bombeo y después de una sesión de crioelectromagnética. Para comenzar este procedimiento, inserte el soporte criogénico en uno de los puertos de bombeo de la estación de bombeo. Inicie la opción de ciclo de calentamiento.

En el controlador de etapa fría, abra la válvula de mariposa V dos, y cuando el vacío en la estación de bombeo turbo se estabilice y lea 10 hasta el recorrido menos tres, o mejor abra la válvula de mariposa V uno. Una vez que la temperatura en el soporte es estable por encima de la temperatura ambiente y el ciclo de calentamiento se ha completado. Baja V uno y detiene el ciclo.

A continuación, inicie la opción de ciclo de luz ze y seleccione el tiempo necesario para lograr un buen vacío en el rango de uno a dos veces 10 a menos cuatro tor. Cuando el vacío llega a 10 a menos tres para el rango, abra la válvula de evacuación de uranio empobrecido B tres y la válvula en el soporte criogénico. Cuando se complete el ciclo, subieron las válvulas en el orden opuesto al que se abrieron.

Con un par de pinzas, deje un trozo de MICA para exponer dos superficies nuevas. Coloque las nuevas superficies de mica expuestas boca arriba sobre una hoja de papel blanco en una placa de Petri. Después de colocar la placa de Petri en el frasco de un evaporador de carbón, realice la secuencia de bombeo hasta que el vacío esté por debajo de 10 a menos seis para cubrir la mica con una capa delgada de carbono.

A continuación, transfiera el carbono fino a la rejilla. Que un trozo de mica recubierta de 0,5 por un centímetro y haga flotar el carbono sobre la superficie plana de agua desionizada filtrada. Con las pinzas, ponga el lado sagrado de carbono de la rejilla en contacto con la superficie superior de la capa de carbono flotante y recójalo.

Coloque la rejilla con el lado de carbono hacia arriba en un portaobjetos de vidrio de 7,5 por 2,5 centímetros cubierto con una película eléctrica. Luego coloque el portaobjetos de vidrio en la cámara del equipo de descarga incandescente y cierre la cámara. Bombea la campana y brilla.

Descargue durante 20 segundos a 25 miliamperios y siete veces 10 a menos dos milibares. En este punto, encienda el aparato de congelación por inmersión. Tire del recipiente Ethan hacia abajo llenando el depósito con nitrógeno líquido.

Una vez que el nitrógeno líquido deje de hervir, coloque la punta del tubo que proviene del tanque Ethan en la cámara interior y abra la válvula muy lentamente. Licuar el etano en la cámara interior y llenarlo hasta un milímetro desde la parte superior. Enciende la humedad.

A continuación, cargue una rejilla en unas pinzas y cargue de tres a cinco microlitros de muestra en la superficie de carbono de la rejilla sagrada. Después de esperar a que la muestra se absorba en la rejilla, realice el secado Para lograr un rubor de capa líquida fina, congele la rejilla sumergiéndola en el etano líquido. Retire con cuidado el conjunto de rejilla de las pinzas del etano líquido y transfiéralo a la cámara exterior que contiene nitrógeno líquido.

Luego transfiera la rejilla a una pequeña caja de rejilla sumergida en el nitrógeno líquido. En este punto, inserte el soporte criogénico en la estación de trabajo de transferencia criogénica. Llene el hacedor del soporte criogénico y el recipiente de la estación de trabajo con nitrógeno líquido.

Transfiera rápidamente la caja de rejilla criogénica que contiene la rejilla hidratada congelada al nitrógeno líquido en la estación de trabajo. Después de abrir la caja de rejilla criogénica, tome la rejilla hidratada congelada y colóquela en la ranura del soporte de muestras. A continuación, coloque el anillo de clip en la parte superior de la rejilla y presiónelo suavemente con el extremo romo de la herramienta de anillo de clip y hasta que esté firmemente asentado en su lugar.

A continuación, cierre el obturador criogénico. Rellene el anticontaminante TEM con nitrógeno líquido. Vuelva a inclinar la platina del microscopio a menos 60 grados.

Después de esto, comience el ciclo de esclusa de aire PrepU en el microscopio. Una vez finalizada la secuencia de la esclusa de aire de la bomba, inserte el soporte del coro en la esclusa y conecte el cable de control de la etapa fría al soporte para controlar la temperatura. Después de que se apague la luz roja, gire el soporte a la posición de cero grados para su inserción en la columna de alto vacío del T EM.

Retraiga el obturador criogénico y abra las válvulas de la columna. Active el programa de dosis baja en el modo de búsqueda. Centre el escenario y establezca la altura central usando el alpha wobbler para balancear el escenario más o menos 15 grados, seleccione un orificio adecuado y colóquelo en el centro del campo con el controlador de escenario XY.

Cambie al modo de enfoque y enfoque la imagen. A continuación, se enfoca la imagen entre 0,5 y 4,5 micras. Cambia al modo de exposición y graba la imagen.

Finalmente, regrese al modo de búsqueda para seleccionar el siguiente hoyo y repita la secuencia. Aquí se comparan las imágenes microscópicas obtenidas por los métodos de tinción negativa y crioEM para cuatro especímenes representativos con diferentes características estructurales: las cápsides de virus adenoasociados teñidas negativamente revelan partículas similares a virus y la crioEM muestra que están vacías. Las imágenes del virus del mosaico del tabaco muestran bastones helicoidales con el canal central lleno de tinción en la tinción negativa y vacío en las imágenes crioelectromagnéticas.

KLH se ensambla en barriles característicos que muestran seis estrías tanto en la tinción negativa como en las imágenes criogénicas. Las vistas laterales rectangulares y las vistas circulares y sobre revelan un vacío en una estructura por crioEM en el receptor de odo. Las características intrincadas de la superficie, como una cruz central y una depresión central, se manifiestan como acumulación de manchas por tinción negativa y como regiones de menor densidad por crioem.

Ejemplos típicos de artefactos crioelectromagnéticos son el hielo cristalino, la contaminación por hielo, el astigmatismo y las estructuras en forma de telaraña. El análisis de una sola partícula y la reconstrucción en 3D del receptor uno de ine hidratado congelado revelan su estructura simétrica cuádruple. El dominio citoplasmático forma un prisma cuadrado y contiene varios dominios gulares reproducibles que forman una estructura similar a un andamio.

Con una resolución de 10 angstrom, es posible visualizar alfa HELOCs 3D. El mapeo de diferencias puede revelar la posición de ligandos importantes. Los cambios confirmatorios proporcionan una visión dinámica de la macromolécula.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar muestras criogénicas EM de alta calidad. La criomielitemia, combinada con el procesamiento de imágenes, ha permitido a los investigadores explorar la estructura, la organización de las subunidades y la dinámica conformacional de las máquinas macromoleculares.