Name: Preparación de la muestra Estrategias para Espectrometría de Masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a preparar cultivos celulares tridimensionales para espectrometría de masas de imágenes. Este protocolo detalla la construcción, inclusión en gelatina y seccionamiento criostático para detectar proteínas, lípidos y metabolitos sin etiquetado.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Walther contra el Cáncer bajo el programa Avanzando en la Investigación Básica del Cáncer del Instituto de Investigación del Cáncer Harper de la Universidad de Notre Dame (DARW) y la Beca Starter 2011 de la Sociedad de Químicos Analíticos de Pittsburgh (ABH). Gracias también al personal del Centro de Espectrometría de Masas y Proteómica por sus útiles debates.

1. 3D cultivo celular y preparación de la Imagen <ol><li> Cultura una línea celular apropiada, es decir, colon HCT116 línea celular de carcinoma, en dos dimensiones, cultivo en monocapa. </li><li> Crecer HCT 116 células en un matraz T-25 con los medios de McCoy 5A + suero bovino fetal al 10% en un incubador de CO2 al 5% hasta 50-70% de confluencia, que toma generalmente unos pocos días. </li><li> Células liberan con solución de tripsina-EDTA 0,25% y cuentan una parte de las células utilizando un hemocitómetro y tinción con azul de tripán para comprobar la densidad celular y viabilidad. </li><li> Después de conteo, diluir las células con medio completo para lograr una densidad de siembra apropiada de 6.000 células / pocillo, o 30.000 células / ml. </li></ol> 2. Preparar agarosa revestidos placas de 96 pocillos <ol><li> Añadir 0,19 g de agarosa a 10 ml de medios estándar en un tubo cónico de 50 ml (solución de agarosa al 1,5% en medios de comunicación) 10. Asegurar la incorporación por mezcla suave. Autoclave la agarosa en un baño de aguadurante 20 min. </li><li> Con una pipeta multicanal, aspirado 50 l de la mezcla de agarosa + medios de comunicación en los 60 pozos centrales de la placa de cultivo de placa de fondo 96 plana. Como los pozos en los bordes periféricos de la placa tienen ligeramente más altas tasas de evaporación, añadir 200 l de fosfato 1x solución salina tamponada (PBS) en lugar de la agarosa a estos bordes. </li><li> Una vez que la mezcla de agarosa se ha añadido a los pozos internos, ajuste el plato a un lado enfriar a ~ 37 ° C antes de la adición de las células. </li></ol> 3. Las semillas y cuidar el cultivo tridimensional NOTA: Más o menos células se pueden sembrar en función de los requisitos de la cultura involucrados, pero se ha determinado que estas condiciones resultan en estructuras de cultivo de células en 3D de aproximadamente 1 mm de diámetro después de 10-14 días de cultivo (datos no mostrados) . <ol><li> Añadir 200 l de la solución celular apropiado (diluido para contener ~ 6000 células) a la agarosa recubiertaPlaca de 96 pocillos. Cubrir la placa y poner en incubador humidificado con 5% de CO2 a 37 ° C para el crecimiento celular. </li><li> Cambie medio celular un mínimo de cada 48 horas, o cuando aparezca el medio que se va cambiando de color. <ol><li> Cambio de medio por aspiración cuidadosamente los viejos medios de todo el pequeño cultivo de células 3D (visible a simple vista por día 2) en la parte inferior de la agarosa. Añadir 200 l de medio fresco suavemente sobre el cultivo celular en 3D. </li><li> (Paso opcional) Durante estos cambios de medio, añadir quimioterapia u otros medicamentos para la prueba. Diluir el fármaco de elección a la concentración final con medio completo y añadir los necesarios 200 l a cada pocillo. </li><li> Monitor 3D de crecimiento de cultivo de células mediante microscopio óptico, hasta que los cultivos de células 3D son aproximadamente 1 mm de diámetro. </li></ol></li></ol> 4. Cosecha los Cultivos Celulares 3D <ol><li> Use un 2 ml pipeta serológica para eliminar suavemente el cultivo de células en 3D de la cama de agarosa. </li> &lt;li&gt; Lavar los cultivos de células en 3D con PBS pipeteando suavemente en aproximadamente 1 ml de PBS en una placa de espera de 24. </li><li> Transferencia cosecha cultivos de células en 3D a través de una pipeta serológica a tubos de centrífuga de proteína o metabolito de extracción, o incrustarlos en un medio de corte para ayudar a cortar para aplicaciones de imagen. </li></ol> 5. Integrar los cultivos celulares 3D en gelatina <ol><li> Preparar una solución de ~ 175 mg / ml de gelatina en agua de alta pureza (18 MΩ preferido). 22,23 Mezclar la gelatina con vigor. Observe la solución convertirse viscoso y difícil de manipular. Coloque el tubo cónico que contiene gelatina en un baño de agua a ~ 60 ° C y caliente hasta que la solución se vuelva clara y fácil de aspirado. NOTA: La solución de gelatina caliente se endurece rápidamente a medida que se enfría, por lo que realizar todos los pasos siguientes rápidamente antes de la congelación. </li><li> Después se calienta, tomar la gelatina de inmediato a la campana de cultivo celular. Mantenga el tubo con la gelatina en un beaker con agua precalentado a unos 60 ° C para evitar el endurecimiento de la solución de gelatina. </li><li> Utilizando una pipeta serológica de 2 ml, depositar 0,6 ml de la solución de gelatina caliente en el pocillo de una placa de fondo plano de 24. Este volumen es suficiente para cubrir el fondo en una capa delgada. Depositar suavemente los cultivos de células 3D inmediatamente en la parte superior de la capa de gelatina utilizando una pipeta de 2 ml diferente para evitar la ruptura de la estructura 3D. NOTA: Se debe tener cuidado en esta etapa no colocar PBS en la gelatina. Si esto sucede, sin embargo, eliminar el PBS desde la parte superior de la gelatina utilizando una pipeta de 200 l. </li><li> Después de que los cultivos de células 3D se colocan en la superficie de la capa de gelatina, cuidadoso pipeteado otro 0,6 ml de la mezcla de gelatina caliente sobre los cultivos de células 3D, a fin de no perturbar la posición de las culturas. Después se coloca la segunda capa, la congelación de los cultivos de células 3D de gelatina embebido a -80 ° C. </li></ol> 6. Corta y Descongele Monte ªe Gelatina incrustado-Cultivos Celulares 3D para espectrometría de masas Imaging <ol><li> Retire la placa de 24 pocillos que contienen los cultivos de células en 3D desde el congelador. Calentar la parte inferior de la placa con el calor de la mano hasta una pinza o un bisturí se deslice suavemente hacia abajo el lado del pozo. </li><li> Suavemente deslice la pinza o un bisturí, liberando la gelatina sin descongelar el centro. Tome una gota de agua para el apoyo criostato y usar esto para adherir el disco de gelatina al soporte. <ol><li> Cultivos de células 3D incrustados en gelatina son más susceptibles de cortar a -30 ° C. Limpiar la cuchilla criostato y vidrio con etanol al 70% antes de su uso. Use una parte distinta de la hoja o una cuchilla nueva para cada disco cultura-gelatina celular 3D para evitar embotamiento de la hoja. </li></ol></li><li> Utilizando el criostato, cara suavemente el exceso de gelatina hasta que los cultivos de células 3D se hacen visibles. </li><li> En este punto lentamente cortar los cultivos de células en 3D con un movimiento suave de 12 a 16 micras secciones. NOTA: Los factores críticos a rebanar incluyen la distancia del vidrio a la hoja, el ángulo de la hoja, la temperatura del criostato, y el ángulo del disco sobre el soporte, por lo que todos ellos se debe comprobar para asegurar resultados consistentes. </li><li> Descongelar cuidadosamente las rebanadas y montarlos en óxido de titanio (ITO) portaobjetos de vidrio recubiertas de indio etiquetados adecuadamente y guárdelo en un desecador. Utilice las rodajas lo más rápido posible para obtener la máxima calidad. </li></ol> Aplicación 7. Matriz y Preparación de muestras para MALDI Imaging <ol><li> Antes de las imágenes MALDI, preparar las rebanadas con la matriz apropiada. <ol><li> Para análisis de moléculas pequeñas, generalmente se requiere ningún paso de lavado. Para la detección de la proteína intacta, lavar las rodajas en frío 100% de acetona, el fluido de Carnoy, o 70% / 95% de isopropanol para eliminar las pequeñas moléculas tales como lípidos que podría enmascarar la señal de 24 - 26. </li><li> Lave con cuidado para no más de 30 segundos a la vez. Nomolestar a algún segmento. </li></ol></li><li> Preparar la matriz en una solución de disolvente orgánico y agua, con 0,1% de TFA. Para la pequeña molécula tal como α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), utilizar 60% de ACN: 40% H 2 O: 0,1% de TFA (10 mg / ml). Para la detección de proteínas, tales como el ácido sinápico (30 mg / ml), utilizar la misma solución de disolvente. Para solubilidad óptima del ácido sinápico, disolver primero en acetonitrilo antes de la adición del TFA: H 2 O solución. Otras matrices se pueden utilizar según sea apropiado. NOTA: Matrix se puede aplicar con varios métodos diferentes, pero debe tenerse en cuenta se han encontrado algunas matrices de co-cristalizar con la gelatina, tal como ácido ferúlico, haciendo que la muestra inutilizable. Cristales más pequeños producen espectros de masas más consistente, lo que permite más especies moleculares para ser detectado y atribuido a diferencias biológicas en lugar de los efectos de matriz. </li><li> Aplicar la matriz por el método handspotting. <ol><li> Use una jeringa con punta fina para aplicar 0,5 l de la matrsolución ix en la rebanada de cultivo de células en 3D y permite la matriz a cristalizar. </li></ol></li><li> Como alternativa, utilice el método aerógrafo. Llene un aerógrafo de calidad comercial con la solución de matriz. <ol><li> Sostenga el pulverizador 8.12 pulgadas de distancia de la diapositiva, apuntar una pulverización fina en el segmento. En entre pasadas, permita que la matriz se seque durante 1 min para permitir la mejor formación de cristales. Hasta 10-20 pasadas del aerógrafo se requiere para producir una capa óptima de matriz 22. </li></ol></li><li> Como alternativa, utilice el método de sublimación detalla en otras partes. 25,27 </li><li> Diapositivas seca en un desecador durante al menos 30 min antes de MALDI-MSI, independientemente del método de aplicación de la matriz. 25 </li></ol> 8. MALDI-MSI Análisis Utilizando un sistema MALDI-TOF (es decir, AUTOFLEX III) NOTA: Esta sección contiene instrucciones y consejos para establecer los parámetros para un experimento de imágenes MALDI-TOF. Dependiendo de las insfabricante y el software utilizado instru-, el proceso puede variar. <ol><li> Colocar los portaobjetos en un adaptador hecho para sostener con seguridad 75 mm diapositivas x 25 mm a la imagen las rodajas de cultivo de células en 3D adjuntado a las diapositivas recubiertos de ITO. Cargue el adaptador de diapositivas en el instrumento. </li><li> Prepare el instrumento para MALDI-MSI, puede seleccionar un estándar de calibración adecuado para el rango de masas en cuestión. Para interrogatorio de pequeñas moléculas, las señales detectadas que corresponden a la matriz utilizada, α-CHCA, son un grupo común de calibradores. Para el análisis de las proteínas, se seleccionan patrones de proteína conocida (es decir, la ubiquitina, tripsinógeno) en el rango de masas de interés y manchado adyacente a los cultivos celulares 3D como calibradores. Calibre el instrumento antes de continuar con el desarrollo del método. </li><li> Antes de las imágenes, el desarrollo de métodos de adquisición de datos para el rango de masas de elección mediante el software proporcionado por el fabricante del instrumento. Ver las figuras 1 y 2 parapequeña molécula y de formación de imágenes de proteínas. Para imágenes molécula pequeña, utilice reflectrón modo para la más alta resolución de masas. <ol><li> Ajuste el rango de masas para la adquisición de datos de moléculas pequeñas entre 100-1.000 m / z y de proteínas entre 8,000 25,000 m / z. Ajuste el rango de masas para abarcar la región de elección mientras que proporciona la resolución más alta masa posible con el instrumento. </li><li> Ajuste la potencia del láser, la frecuencia, el número de disparos de láser y tamaño de punto que utilizan la solución de calibración y un cercano rebanada cultivo celular 3D &#39;sacrificio&#39;. Observar estos ajustes en el software de control principal instrumento. Utilice la siguiente configuración como punto de partida recomendado: 60% de potencia, 400 disparos de láser, ultra-pequeño tamaño del punto. Estos ajustes variarán de instrumentos y métodos, de modo de optimizar los parámetros del instrumento para dar a los espectros de alta calidad para cada instrumento específico. Otros parámetros que se pueden ajustar incluyen la ganancia del detector, frecuencia de muestreo, y la ganancia electrónica. Save este método para su uso en el software de imagen (es decir., Método autoexecute que FlexImaging aprovechará). NOTA: iones Suprimir debajo de la gama de masa de interés (de nuevo encontraron en el control de instrumentos) a fin de no interferir con la detección. </li><li> Desarrollar métodos de adquisición de datos de proteínas para el rango de masas de elección. Siga los mismos pasos descritos anteriormente, pero para los rangos de masa-medias y altas, por encima de aproximadamente 3 kDa, utilice el modo lineal. NOTA: los ajustes difieren de los utilizados para los métodos de moléculas pequeñas. </li></ol></li><li> Parámetros de los instrumentos de configuración específicos de EM utilizando el software de imagen proporcionada por el fabricante del instrumento, como FlexImaging para sistemas de Bruker MALDI-TOF. <ol><li> Crear un nuevo archivo de imágenes y la carpeta, usando los métodos desarrollados previamente y guardado. Seleccione los parámetros del instrumento tales como tamaño de punto de trama (el cambio desde el valor predeterminado 200 micras a 50 micras), podrá establecer el método de control de instrumentos (instalación del paso 8.3.2 o 8.3.3), y posición donde para escanear el cultivo de células en 3D. </li><li> Seleccione tres puntos enseñar apropiadas en la muestra, se mueve el láser para cada uno de ellos. Obtenga la fotografía óptica desde el software de control del láser MALDI-TOF utilizando &#39;Imprimir pantalla&#39;. NOTA: Muchos programas de software de formación de imágenes requieren una fotografía óptica de la muestra de &quot;enseñar&quot; el software donde se encuentra el láser, que se puede obtener con un escáner o una cámara a menudo el instrumento. </li></ol></li><li> A continuación, iniciar el proceso de formación de imágenes del software de imagen (no el control de instrumentos) y adquirir los espectros de masas de cada rebanada. Observe mayoría de las masas de todo el cultivo de células en 3D y otras localizadas en áreas particulares. </li></ol> 9. Métodos de análisis de datos opcionales <ol><li> Para el análisis objetivo, ejecutar el análisis manual de los espectros haciendo clic en una masa en el espectro medio, o permitir que el software de imágenes para recoger automáticamente masas por encima de un umbral determinado (por ejemplo., Picos above el umbral superior al 20%). Para el control de calidad, examinar la distribución de los picos de la matriz o el espectro media. </li><li> Realizar análisis estadísticos con datos extraídos de software matemático como R o Matlab. <ol><li> Exportación espectros solo en formato ASCII, un archivo de texto legible, para cargar en el software de su elección. </li><li> Convertir los espectros individuales a ASCII, mzXML, de formato mzML para la lectura de varios programas de software diferentes, 28 -. 31 o exportar los datos como un Analizar (.img) archivo de formato, un formato común utilizado para otras aplicaciones de imagen como la resonancia magnética 32 Dos opciones de código abierto para el análisis son MSiReader y BioMap 32,33. </li><li> Una vez que los archivos se exportan en un formato legible por el software, cargar el conjunto de datos a través de las instrucciones del software respectivo. Después de la carga, un tratamiento posterior a la adquisición, tales como la eliminación de línea de base y la normalización. </li><li> Con este conjunto de datos, realice Statitratamientos stical tales como el análisis de componentes principales de la agrupación jerárquica ya sea utilizando scripts o construidas en los algoritmos de software como Matlab 18 personalizados. </li></ol></li></ol>

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Este artículo es parte de un número especial sobre imágenes preclínicas multimodales, patrocinado por Bruker Biospin. El sistema MALDI-TOF utilizado para obtener los resultados representativos es un Bruker AutoFlex III.

Utilizando los métodos descritos anteriormente, los cultivos celulares pueden cultivarse en 3D y se analizaron con MALDI-MSI. Muchas líneas celulares inmortalizadas formarán estructuras 3D cuando se cultivan adecuadamente 9,10. Se debe tener cuidado para cultivar células que no se han pasado demasiadas veces, es decir, tener bajos números de paso. En general, las células con un número de paso de diez e inferior son óptimas para el crecimiento de los cultivos de células en 3D. Crecimiento de los cultivos de células en 3D en un soporte de agarosa tradicional proporciona una manera rentable para los grupos de investigación interesados ​​en el cultivo de células en 3D para probar este sistema. Este método utiliza algunos componentes no ya en la mayoría de los laboratorios de cultivo de células de mamíferos. Es necesario prestar cuidadosa atención a la preparación de las placas de agarosa para el crecimiento de manera que los cultivos celulares 3D son compatibles en tamaño y forma; algunos aspectos que requieren una cuidadosa atención incluyen la comprobación de que no hay burbujas de aire quedan atrapadas a la mezcla y que un menisco adecuado se forma en la parte inferior de cada well. Si el menisco no se forma correctamente, las células pueden crecer en formas no esferoide o en pequeños grupos. Además, debe tener cuidado de no colocar PBS en la gelatina con los esferoides cuidado. Si esto ocurre, retire el PBS desde la parte superior de la gelatina con una pipeta 200 microlitros. Si el coste no es un factor, placas de fondo redondo de unión ultra-bajas son comercialmente disponibles y ofrecen simplificación de estos pasos. Mientras que otros métodos de incrustación de tejidos también pueden ser compatibles espectrometría costoso y no masa, gelatina-incrustación se ha demostrado que ser barato y versátil. Estrategias de preparación antes mencionados han sido optimizados para cultivos de células en 3D para obtener los datos de la más alta calidad. Si bien la gelatina-incrustación se ha demostrado que ser compatible con el análisis de espectrometría de masas, este proceso hace disminuir las matrices disponibles debido a la co-cristalización. Una vez congelados, los cultivos celulares 3D son estables durante meses, siempre y cuando no se descongelan por congelación. La gelatina se vuelve opaca cuando se congela, y la célula 3Dculturas son de un color similar, por lo que es aconsejable antes de la congelación para documentar la colocación de cultivo de células en 3D para ayudar en la corte. En la preparación de diapositivas, la matriz se puede aplicar con varios métodos diferentes, pero debe tenerse en cuenta que se han encontrado algunas matrices de co-cristalizar con la gelatina, tal como ácido ferúlico, haciendo que la muestra inutilizable. Cristales de la matriz pequeños producen espectros de masa más consistente. Mientras handspotting es el método más simple de aplicación de la matriz, el volumen de disolvente más grande puede dar lugar a tamaños de los cristales más grandes y la migración analito significativo. En el espectrómetro de masas, los avances en las tecnologías de MALDI-MSI han reducido los conocimientos especializados necesarios para los análisis de inicio. Adquisición y análisis de datos es sencillo en la mayoría de los sistemas, lo que permite que incluso un novato para obtener información de alta calidad a partir de diapositivas recubiertos de ITO. La selección cuidadosa de los parámetros del instrumento, optimizado en la cercana sin imagen cultur celular digno 3Des, es fundamental para la obtención de datos de alta calidad. Por ejemplo, el aumento de la potencia del láser puede aumentar la intensidad del pico, pero la disminución de la potencia del láser puede mejorar la resolución y dar formas de los picos más simétricas. Cultivos de células en 3D deben utilizarse rápidamente después de rebanar para garantizar la calidad de la muestra óptima. Degradación de la señal de proteína puede ser visto en menos de una semana sin almacenamiento adecuada (desecador / -80 ° C congelador), en particular en la región de masas de alta (por encima de 20 kDa). Debido a la creciente demanda, muchos programas de software de visualización diferentes han sido desarrollados y son gratis para el público de investigación. La mayoría de los espectrómetros de masas de imagen han instalado el software necesario para visualizar masas individuales con los formatos propietarios usados ​​en cada instrumento. Estos programas de software pueden ser utilizados para obtener imágenes de una sola masa y exportar los datos. La mayoría del software también permitirá la superposición de dos o más masas de interés. Además, muchos de los espectadores diferentes para los datos de MSI son de descarga gratuita, como un MSiReaderd BioMap 32,33 Los datos de espectrometría de masas obtenidos también pueden ser procesados ​​después de la adquisición con facilidad, con lo que la información más útil a la vanguardia.. De farmacéuticos a los lípidos a las proteínas, el sistema descrito anteriormente permite la adquisición rápida de datos para evaluar la distribución de moléculas de interés a través de una estructura de cultivo celular en 3D. Las secciones seriadas se pueden tomar a la imagen de toda la estructura en 3D mediante la construcción de cada imagen 2D de una rebanada del cultivo celular 3D. Las técnicas y las notas en el protocolo serán de utilidad para los investigadores que desean empezar un cultivo celular tridimensional como un puente entre la cultura monocapa y modelos animales. Una vez dominado, estas técnicas se pueden aplicar a varios tipos de 3D culturas celulares, tejidos y cultivos celulares, permitiendo a los investigadores a la imagen lo que muestras que eligen.

Las imágenes de espectrometría de masas (MSI) son una técnica poderosa para examinar la distribución de especies moleculares en muestras de interés. Los investigadores han obtenido imágenes de muestras biológicas desde animales enteros hasta células individuales con esta técnica. 1–4 Con el uso de MSI, se pueden obtener imágenes de cientos de analitos a la vez, en lugar de técnicas de un solo sustrato que requieren el desarrollo de fluoróforos adicionales para la microscopía confocal tradicional o la tinción para la histología. 5–7 Además, el MSI puede utilizarse de forma específica o basada en el descubrimiento, lo que lo convierte en un enfoque atractivo para observar la superposición entre la distribución de las especies químicas. A continuación se presentan métodos para el crecimiento, la preparación y la obtención de imágenes de ionización/desorción por láser asistida por matriz (MALDI) de muestras pequeñas (~1 mm de diámetro) de cultivos celulares multicelulares tridimensionales. De 8 a 11 años
Los cultivos celulares 3D son de particular interés para la comunidad biológica como intermediarios entre el cultivo tradicional de monocapa y los tumores in vivo. Como su nombre lo indica, los cultivos celulares 3D son agregados celulares heterogéneos que contienen muchos de los gradientes químicos en el microambiente observados en pequeños nódulos tumorales avasculares, lo que los convierte en un sistema modelo más realista para el entorno tumoral nativo que el cultivo monocapa. 10 Muchas líneas celulares humanas se pueden cultivar como cultivos en 3D, incluidas las líneas celulares derivadas de tejidos de colon, mama, ovario, próstata, riñón y pulmón. 10 Existen desafíos inherentes en la obtención de imágenes de cultivos celulares tridimensionales, ya que son más pequeños que muchas muestras comúnmente utilizadas para la obtención de imágenes de espectrometría de masas y, por lo tanto, requieren una preparación cuidadosa de la muestra. 7 Sin embargo, las ventajas de estos sistemas de modelos manejables incluyen un menor costo y un crecimiento y tiempo de análisis más rápidos en comparación con los modelos animales. Como resultado, los estudios que involucran cultivos celulares tridimensionales pueden tener un mayor rendimiento que los estudios tradicionales con animales. De 12 a 14 años
Todas estas ventajas han resultado en una creciente popularidad de los cultivos celulares tridimensionales en la investigación biológica; existe la correspondiente necesidad de desarrollar nuevas estrategias analíticas para explorar tanto la composición como la distribución espacial de las moléculas en estos sistemas. 12,15–21 El objetivo de este manuscrito es describir la adaptación de los métodos de imagen de espectrometría de masas y la preparación de muestras a cultivos celulares tridimensionales.

<table><tbody><tr><td>HCT116 Línea celular</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-247</td><td>Peligro potencial, manéjelo con cuidado</td></tr><tr><td>Medios 5A de McCoy</td><td>Gibco</td><td>16600-108</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA al 0,25%</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Gelatina</td> de <td>10010049</td><td></td><td>Gibco</td> de solución salina tamponada</tr><tr>, <td>Knox</td><td></td><td>sin sabor</td><td>Disponible en la mayoría de las tiendas de comestibles en</td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO</td> de un solo paquete <td>Delta Technologies, Limited</td><td>CG-90IN-S115</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Ácido ciano-4-hidroxicinámico (CHCA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Sinápico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85429</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mm Alimentación por gravedad Aerógrafo de doble acción Juego de pistola de pintura</td><td>RoyalMax Aerógrafo</td><td></td><td>Muchas opciones disponibles en sitios como Amazon.com</td></tr></tbody></table>

preparación de la muestra estrategias para espectrometría de masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3d

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Los cultivos celulares tridimensionales son modelos atractivos para la investigación biológica. Combinan la flexibilidad y la rentabilidad del cultivo celular con parte de la complejidad espacial y molecular del tejido. Por ejemplo, muchas líneas celulares forman estructuras 3D dadas las condiciones in vitro adecuadas. Las líneas celulares de cáncer de colon forman esferoides de cultivo celular en 3D, imitadores in vitro de nódulos tumorales avasculares. Mientras que la inmunohistoquímica y otros métodos clásicos de diagnóstico por imágenes son populares para controlar la distribución de analitos específicos, la espectrometría de masas examina la distribución de clases de moléculas de forma imparcial. Si bien las imágenes de espectrometría de masas MALDI se desarrollaron originalmente para interrogar muestras obtenidas de humanos o modelos animales, este informe describe el análisis de cultivos celulares tridimensionales in vitro, incluidas las mejoras en las estrategias de preparación de muestras. En este trabajo se describen los métodos para el crecimiento, la recolección, la sección, el lavado y el análisis de cultivos celulares en 3D mediante imágenes de espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS). Utilizando cultivos celulares 3D de carcinoma de colon como sistema modelo, este protocolo demuestra la capacidad de monitorizar analitos de forma imparcial en todo el sistema de cultivo celular 3D con MALDI-MSI.

Formación de imágenes MSI tiene el potencial para revelar muchos distribución molecular diferente en cultivos de células 3D. Utilizando el método descrito anteriormente, las especies de moléculas pequeñas (Figura 1) a las proteínas grandes (Figura 2) pueden ser rastreados a través de la cultura. Estos resultados muestran la visualización de un solo ion con la herramienta gratuita MSiReader. 32 Los resultados pueden ser analizados para los iones individuales de interés a través del cultivo de células 3D con software de visualización, ya sea en una región de interés o la totalidad de la región escaneada. Además la mayoría de software visualizará automáticamente iones por encima de un determinado umbral fijado por el usuario, lo que puede ayudar a los esfuerzos de descubrimiento. Una vez que se obtienen mapas individuales de iones, la mayoría del software incluye la capacidad de superponer las imágenes para ver la colocalización de iones. Ya sea en enfoques basados ​​en el descubrimiento o de una manera específica, de formación de imágenes espectrometría de masas es una herramienta poderosa para analizar cultivos de células 3D. Figura 1. Los resultados representativos de crecimiento del cultivo celular 3D y seccionamiento. Izquierda) Imagen óptica de una estructura de cultivo de células intactas HCT-116 3D colorrectal como se ve en el día 14 antes de la cosecha. Derecha) Imagen Óptico de una rodaja de aproximadamente ecuatorial de un colorrectal deshielo cultivo celular 3D montada sobre un portaobjetos recubiertos de ITO para la imagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> Figura 2. Los resultados representativos de molécula pequeña MALDI-MSI de una sección ecuatorial de un cultivo de células 3D. Top) los espectros de masa media alcanzada con α-CHCA en la gama baja de masas (pequeña molécula). Bottom) Imágenes representativas deuna sola masa: 327,8 m / z localiza principalmente en el interior del cultivo celular en 3D y 429,7 m / z localizada principalmente en el borde del cultivo celular en 3D. La línea de puntos indica el borde aproximada del esferoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> Figura 3. Los resultados representativos de formación de imágenes de proteínas por MALDI-MSI de una sección ecuatorial de un cultivo de células 3D. Top) los espectros de masa media alcanzada con ácido sinápico en el (rango de proteína) de masa superior. Bottom) Imágenes representativas de una sola masa: 10.871 m / z localizada principalmente en el borde del esferoide, y 12.184 m / z localizada más hacia el interior del esferoide. La línea de puntos indica el borde aproximada del esferoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Líneas celulares de cáncer inmortalizadas pueden ser cultivadas como cultivos de células en 3D, un modelo valioso para la investigación biológica. Este protocolo describe imágenes espectrometría de masas de cultivos de células en 3D, incluyendo mejoras en la plataforma de preparación de la muestra. El objetivo de este protocolo es instruir a los usuarios preparar cultivos de células en 3D para el análisis de imágenes de espectrometría de masas.

Preparación de la muestra Estrategias para Espectrometría de Masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3D

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar cultivos celulares tridimensionales y analizarlos mediante imágenes por espectrometría de masas. Esto se logra primero construyendo cultivos celulares tridimensionales y permitiendo que crezcan hasta el tamaño deseado. El segundo paso consiste en recolectar e incrustar los cultivos celulares tridimensionales en gelatina.A continuación, los cultivos celulares tridimensionales se seccionan a menos 30 grados Celsius utilizando un microtomo criostático y se montan sobre portaobjetos conductivos. El paso final consiste en analizar los cortes mediante un instrumento de IMS MALDI y realizar el análisis de las moléculas detectadas. En última instancia, la imagen por espectrometría de masas se utiliza para mostrar los cambios en la distribución de analitos de muchas clases diferentes de biomoléculas a través del cultivo celular tridimensional.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía de masas o la auto radiografía es que la imagen por espectrometría de masas permite la detección y localización de múltiples analitos, como proteínas, lípidos, fármacos y metabolitos, en un solo experimento sin necesidad de etiquetado con anticuerpos. El procedimiento será demostrado por Dorothy Alf Wheatcraft, yo mismo, un posdoctorado, y Shin Li, una estudiante de posgrado del laboratorio de Hamman. Antes de comenzar este procedimiento, cultive una línea celular adecuada, como la línea celular de carcinoma de colon HCT116, en un cultivo de monocapa bidimensional. A continuación, añada 0,19 gramos de aros a 10 mililitros de medio estándar en un tubo cónico de 50 mililitros.Asegúrese de la incorporación mediante mezcla suave, luego autoclave los agros en un baño de agua durante 20 minutos utilizando un aspirado multicanilla. Añada 50 microlitros de la mezcla de medio Agros en los 60 pozos centrales de una placa de cultivo de 96 pozos con fondo plano. Como los pozos en los bordes periféricos de la placa tienen tasas de evaporación ligeramente más altas, agregue 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato 1x en lugar de aros a estos bordes.Una vez que se haya agregado la mezcla de aros a los pozos internos, coloque la placa a un lado para que se enfríe hasta aproximadamente 37 grados Celsius antes de añadir las células. En este punto, agregue 200 microlitros de la solución celular adecuada a la placa de 96 pozos recubierta con aros, cubra la placa y colóquela en un incubador humedecido con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius para el crecimiento celular. Tras la incubación, cambie el medio aspirando cuidadosamente el medio antiguo del entorno del cultivo celular tridimensional pequeño en el fondo de los aros.Luego agregue 200 microlitros de medio fresco suavemente sobre el cultivo celular tridimensional. Prepare una solución de aproximadamente 175 miligramos por mililitro de gelatina en agua de alta pureza. Mezcle la gelatina vigorosamente después de que la solución se haya vuelto viscosa y difícil de manipular.Coloque el tubo en un baño de agua a aproximadamente 60 grados Celsius y caliente hasta que la solución se vuelva clara y fácil de aspirar. Utilizando una pipeta serológica de dos mililitros, agregue 0,6 mililitros de la solución tibia de gelatina en los pocillos de una placa de fondo plano de 24 pocillos. Coloque inmediatamente las culturas celulares tridimensionales lavadas directamente encima de la capa de gelatina usando una pipeta de dos mililitros diferente para evitar romper la estructura tridimensional.Después de colocar los cultivos celulares sobre la superficie de la capa de gelatina, pipetee cuidadosamente otros 0.6 mililitros de la mezcla tibia de gelatina sobre ellos para no alterar su posición. A continuación, congele. Los cultivos celulares tridimensionales embebidos en gelatina a menos 80 grados Celsius.Una vez que la placa de 24 pocillos que contiene los cultivos celulares haya sido retirada del congelador, caliente la base de la placa con la mano hasta que las pinzas puedan deslizarse suavemente por el lateral del pocillo. A continuación, deslice suavemente las pinzas alrededor del disco, liberando la gelatina sin descongelar el centro.Agregue una gota de agua al soporte del criostato y adhiera el disco de gelatina al soporte. Luego, colóquelo en el criostato para congelarlo. Después de recortar el exceso de gelatina para exponer los cultivos celulares tridimensionales, córtelos lentamente con un movimiento suave en secciones de 12 a 16 micrómetros.Una vez que los cortes se hayan descongelado, móntelos sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con óxido de indio y titanio. Después de etiquetar los portaobjetos, almacénelos en un desecador para la detección de proteínas intactas. Lave los cortes con acetona fría para eliminar moléculas pequeñas, como lípidos, que podrían enmascarar la señal.Prepare la matriz en una solución de disolvente orgánico y agua con ácido tricloroacético al 0,1 %. Utilice una jeringa de punta fina para aplicar 0,5 microlitros de la solución de matriz sobre el corte de cultivo celular tridimensional. Después de permitir que la matriz cristalice, seque las laminillas en un desecador durante al menos 30 minutos antes de la MSI por Maldi.En este punto del análisis, coloque las laminillas en un adaptador diseñado para sostener firmemente laminillas de 75 milímetros por 25 milímetros, con el fin de obtener imágenes de cortes tridimensionales de cultivos celulares. Luego, cargue el adaptador con las laminillas en el instrumento. Tras desarrollar los métodos adecuados de adquisición de datos, ajuste el rango de masas para la adquisición de datos de moléculas pequeñas entre 101,000 relación masa/carga y para proteínas entre 8,020 y 5,000 relación masa/carga.A continuación, ajuste la frecuencia de potencia del láser, el número de disparos del láser y el tamaño del punto utilizando la solución de calibración y una rebanada cercana de cultivo celular tridimensional sacrificable. Guarde este método para su uso en el software de imagen proporcionado por el fabricante del instrumento. Desarrolle métodos de adquisición de datos de proteínas para el rango de masas elegido tal como se describió previamente.Luego, configure los parámetros específicos del instrumento de MS utilizando el software de imagen. Después de seleccionar los parámetros del instrumento y establecer la posición del método de control del instrumento, determine dónde escanear la cultura celular tridimensional. A continuación, seleccione tres puntos de enseñanza adecuados sobre la muestra, moviendo el láser a cada uno de ellos.A su vez, obtenga la fotografía óptica desde el software de control láser del MALDI TOF utilizando la función de captura de pantalla. Luego inicie el proceso de obtención de imágenes desde el software de imagen y adquiera espectros de masas de cada corte para análisis dirigido. Realice el análisis manual de los espectros haciendo clic en una masa en el espectro promedio.Finalmente, realice un análisis estadístico con los conjuntos de datos extraídos en software matemático. La imagen de espectrometría de masas tiene el potencial de revelar muchas distribuciones moleculares diferentes en cultivos celulares tridimensionales. Mediante el método descrito previamente, se pueden rastrear especies desde pequeñas moléculas hasta proteínas grandes a través del cultivo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar, seccionar y analizar cultivos celulares tridimensionales mediante imágenes por espectrometría de masas.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Aquí, presentamos protocolos para realizar tanto imágenes de espectrometría de masas ambiental (MSI) de tejidos como análisis in situ de MS de células individuales vivas (SCMS) utilizando la sonda única, que es un dispositivo multifuncional miniaturizado para el análisis de MS.

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Este protocolo describe un método reproducible y confiable para la preparación a base de la sublimación de formalina fijada destinado para el spectrometry total de la proyección de imagen del tejido.

Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo

Un novedoso método de preparación de la muestra fue desarrollado para acomodar el cocultivo de células y tejidos para detectar cambio de molécula pequeña usando spectrometry total de la proyección de imagen.

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Una plataforma de manipulación de células integrada se desarrolla para su uso en conjunto con una configuración de espectrometría de masas de una sola sonda para el análisis en línea de células de suspensión individuales en condiciones ambientales.

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Aquí, proporcionamos protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar imágenes de tinción y resolución subcelular de modelos de cultivo celular tridimensionales fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros, lo que permite la visualización de su morfología, composición de tipo celular e interacciones.

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Presentamos un protocolo para el cultivo de esferoides de alta reproducibilidad y su caracterización fenotípica mediante captura de imágenes y proteómica.

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Aquí, presentamos un protocolo para producir cocultivos bioimpresos en 3D de neuronas y astrocitos derivados de iPSC. Este modelo de cocultivo, generado dentro de un andamio de hidrogel en formatos de 96 o 384 pocillos, demuestra una alta viabilidad post-impresión y crecimiento de neuritas en 7 días y muestra la expresión de marcadores de madurez para ambos tipos de células.

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Este protocolo tiene como objetivo preservar los metabolitos celulares para la espectrometría de masas unicelular (SCMS) mediante la combinación de lavado con solución salina volátil, enfriamiento rápido de nitrógeno líquido, liofilización y almacenamiento a -8 °C. Demuestra que el enfriamiento con nitrógeno líquido es esencial para mantener los perfiles de metabolitos, mientras que el almacenamiento prolongado en frío debe minimizarse para evitar alteraciones metabólicas.

Preparación de muestras para espectrometría de masas unicelular Estudios metabolómicos: lavado, enfriamiento, secado y almacenamiento combinados de células

Este protocolo describe la imagen por espectrometría de masas de célula única de células OVCAR-8 utilizando ionización por electropulverización por desorción acoplada a espectrómetros de masas Orbitrap para análisis metabolómico de alta resolución espacial.

Imagen por espectrometría de masas de célula única usando ionización por electrospray por desorción acoplada a espectrómetros de masas Orbitrap

Aprenda a preparar cultivos celulares tridimensionales para espectrometría de masas de imágenes. Este protocolo detalla la construcción, inclusión en gelatina y seccionamiento criostático para detectar proteínas, lípidos y metabolitos sin etiquetado.

Preparación de la muestra Estrategias para Espectrometría de Masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3D

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