Name: Calibrado Pinzas Modelo de Lesión Medular Compresión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprende a generar lesiones reproducibles de compresión medular en ratones usando pinzas calibradas mediante laminectomía y técnicas histoquímicas. Este método permite estudiar daño tisular y neurociencia.

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El financiamiento para este trabajo fue proporcionado por los Hospitales Shriners y las becas del CIRM a AMC y AM. También nos gustaría reconocer a Plemel et al.7 por diseñar y publicar por primera vez el modelo de pinzas calibradas.

Todos los animales procedimientos y métodos de cuidado de los animales deben ser aprobados por el animal de Atención Institucional y Uso Comité de la institución (IACUC). 1. Preparación quirúrgica <ol><li> Ensamblar todas las herramientas quirúrgicas necesarias y reactivos: pinzas, tijeras vana, roungeurs, retractores, escalpelos, tijeras, suturas, grapas de piel, Q-tips, solución salina estéril, esponjas quirúrgicas y isoflurano. Preparar y esterilizar en autoclave un paquete completo de herramientas quirúrgicas antes de la cirugía. Si la realización de cirugías en más de un ratón, preparar y autoclave de un paquete de herramientas por animal, o autoclave de un paquete de instrumentos quirúrgicos y esterilizar con un esterilizador de herramienta entre cirugías. Generalmente, un paquete de herramientas esterilizadas se puede utilizar en un máximo de 5 ratones Si una herramienta terilizer de perlas de vidrio se utiliza para limpiar las herramientas en el medio cirugías (después de 5 animales las herramientas se deben volver a limpiar y esterilizar antes de su uso). Por favor, consulte con su administrador local IACUC para institutisobre las directrices específicas. </li><li> Esterilizar el campo quirúrgico con el 70% toallitas con alcohol isopropílico. Configurar campos quirúrgicos para asegurar un campo estéril se mantiene durante la cirugía. </li><li> Pesar cada ratón antes de la cirugía. Administrar una dosis de 0,05 mg / kg de peso corporal de buprenorfina, por vía subcutánea. </li><li> Anestesiar al animal mediante la administración de isoflurano a una dosis de 4% en la cámara de inducción de la máquina de isoflurano. </li><li> Una vez que el animal está anestesiado, aplique una pomada para los ojos para evitar la deshidratación, establezca el animal sobre una almohadilla térmica a 37 ° C, y asegurarse de que la cabeza del ratón se sitúa correctamente en el cono de la anestesia. (Nota: Utilice una fuente de calor que no causará quemaduras térmicas; es decir, una manta de agua circulante, bolsa de agua caliente, o equivalente..) En este punto administrar una dosis de 2% de isoflurano al animal. </li><li> Afeitarse la superficie dorsal del ratón, aproximadamente 1 cm alrededor de la localización de la incisión prevista. </li><li> Desinfectar la incisión site por lavado con 70% toallitas con alcohol isopropílico, luego con una solución de yodo (10% de povidona-yodo, 1% de yodo disponible). Repetir 3 veces. </li></ol> 2. Dorsal laminectomía <ol><li> Antes de hacer una incisión, asegúrese de que el animal está anestesiado correctamente mediante la comprobación de los reflejos utilizando el método pizca dedo del pie o de la cola. </li><li> Hacer una incisión a lo largo de la espina dorsal con bisturí y la hoja, y luego comprobar los reflejos de nuevo. Arquear la espalda para ayudar a visualizar correctamente hitos, tales como los límites entre las vértebras. </li><li> Corte a través de la piel. Inserte retractor para mantener la piel y fascia de vuelta de la médula espinal. Borrar el tejido a ambos lados de la médula espinal para exponer los músculos que cubren la columna vertebral. NOTA: El cirujano debe estar familiarizado con los puntos anatómicos. Por ejemplo, el ángulo inferior de la escápula se corresponde con T7. La parte superior de la curva natural de la columna vertebral del ratón es T12 y puede ser utilizado como un punto de referencia. </li><li> Con piluminación Roper, determinar el espacio entre las vértebras. Encuentra el extremo posterior del T10 y cortar los músculos y fascia perpendicular al espacio de disco intervertebral. Cortar sólo lo suficiente para exponer el proceso y posterior lámina espinosa de T10. </li><li> Con un par de punta fina Dumont # 5 pinzas, eliminar parte del tejido de la lámina y apófisis espinosa para exponer una pequeña porción de la médula espinal. Cuando sea necesario, el uso de fórceps del tejido para estabilizar la columna vertebral. </li><li> Realice la laminectomía mediante la inserción de un lado de un par de tijeras pequeñas vana a lo largo de la parte dorsolateral de la vértebra y justo debajo de la lámina. <ol><li> Hacer pequeñas tijeras, cuidado de cortar a través de la cara lateral de la lámina vertebral. Asegúrese de que no se aplica presión a la médula espinal. </li><li> Repita en el otro lado. </li><li> Aplique una leve presión para detener el sangrado en caso necesario con un Q-tip o esponja quirúrgica, teniendo cuidado de no aplicar presión sobre la médula espinal. NOTA: Preparar espuma de gelempapada en solución salina estéril en el caso de que las necesidades de sangrado a controlar. </li><li> Una vez realizadas las incisiones, levante la cara dorsal de la vértebra y borrar suavemente los archivos adjuntos de los tejidos. Use los medios adecuados para controlar el sangrado si es necesario. </li></ol></li></ol> 3. La compresión de la médula espinal <ol><li> Usando roungeurs o fórceps laminectomía, asegúrese de que los lados laterales de la médula espinal están libres de hueso vertebral para que las pinzas calibradas para la lesión por compresión pueden situar en cualquier lado de la médula espinal. Los brazos de las pinzas deben ser capaces de ser colocado dentro del espacio epidural en lados adyacentes de la médula espinal y las puntas de las pinzas debe ser capaz de alcanzar el piso del conducto vertebral. <ol><li> Asegúrese de que la visibilidad de la médula espinal es bueno. </li></ol></li><li> Situar el calibrado Dumont # 5 fórceps aproximadamente en el centro del segmento expuesta de la médula espinal. Recordemos que los brazos de la fuerzaps debe ser colocado dentro del espacio epidural en lados adyacentes y las puntas debe tocar el piso del canal vertebral para generar lesiones reproducibles. </li><li> Comprimir con cuidado la médula espinal hasta los separadores se conectan. Mantenga en su lugar durante 15 segundos. </li><li> Liberar suavemente la fuerza de compresión y quitar las pinzas calibradas de la médula espinal. La solución salina estéril se debe utilizar para recuperar la homeostasis antes de la herida se cierra. </li></ol> 4. Cierre de la herida <ol><li> Suturar cuidadosamente la capa muscular sobre la médula espinal, teniendo cuidado de no perturbar o aplicar presión a la médula espinal. </li><li> Utilice sutura o grapas para cerrar la piel sobre la herida. </li><li> Si se utiliza anestesia gas, comenzará a disminuir / apagar el anestésico. </li><li> Administrar 0,1 ml de Ringer lactato por 10 g de peso corporal para ayudar a explicar la deshidratación durante la cirugía y después de la cirugía cuando el animal está letárgico y recuperándose de la lesión. La solución debe ser Warmed a la temperatura corporal antes de la inyección. </li><li> Coloca el ratón en una jaula-cama libre. La jaula debe descansar en la parte superior de una almohadilla de calentamiento (como se describe en 1.1.5) de una manera que permite que la mitad de la superficie de la jaula para estar en la almohadilla, mientras que la otra mitad está en reposo en un contador de RT, para dar el Opciones clima ratón una vez que es ambulatoria. Tenga cuidado de asegurarse de que la &quot;jaula de recuperación&quot; se encuentra en un entorno tranquilo. Supervisar de cerca el animal hasta que se haya recuperado la consciencia, momento en el que el ratón se puede transferir a una jaula regular con ropa de cama. </li></ol> Cuidado 5. Post-operatorio <ol><li> Después de la cirugía, administrar una dosis de 0,05 mg / kg de peso corporal buprenorfina por vía subcutánea cada 12 h durante los primeros 3 días después de la cirugía, y luego según sea necesario para controlar los síntomas de dolor. </li><li> Administrar una dosis de Ringer lactato (0,1 ml por 10 g de peso corporal por vía subcutánea) durante los primeros 3 a 5 días después de la cirugía. Dé esta dosis si / cuando la unaimal comienza a mostrar signos de deshidratación fuera de este período de tiempo inicial. </li><li> Expresar manualmente la vejiga de los animales utilizando la maniobra de Crede dos veces al día. Palpar suavemente el abdomen del animal para ubicar la vejiga, y luego aplicar una presión suave hacia abajo hasta que la vejiga está vacía. <ol><li> Si la vejiga no se vacía o la orina es turbia o con sangre, administrar 50 mg / kg en peso corporal de Baytril al animal a través de la inyección intraperitoneal de 10 días. </li></ol></li><li> Observar a los animales en busca de signos de autofagia, deshidratación y pérdida de peso excesiva (mayor de 20% del peso corporal). Si un animal experimenta cualquiera de estos síntomas consulte a un veterinario de inmediato con respecto a las opciones de tratamiento, o la eutanasia del animal de una manera humana siguiendo las directrices del IACUC. <ol><li> Teniendo en cuenta que la movilidad puede ser limitado después de la cirugía, tome las medidas necesarias para asegurarse de que los animales tengan acceso a los alimentos y el agua. Pre-envasados ​​comida húmeda, así como unas hidrogel, puede ponerse a disposición de los animales en estos casos. </li></ol></li></ol> 6. Evaluar el daño tisular resultante de lesión Compresión <ol><li> Anestesiar a los animales como se describe en los pasos 1.4 y 1.5. Comprobar la profundidad de la anestesia por pizca dedo del pie y monitoreo reflejo de parpadeo de la córnea. Cuando el animal es insensible a los estímulos, continúe con el paso 6.2. </li><li> Realizar una perfusión intracardiaca 10. <ol><li> Exponer la cavidad torácica e insertar una aguja en el ventrículo izquierdo. Enjuague fluidos existentes con 20 - 30 ml de fosfato enfriada con hielo de solución salina tamponada (PBS), seguido de 15 - 25 ml de helado 4% de paraformaldehído (PFA). </li></ol></li><li> Retire la médula espinal. <ol><li> Cortar la piel dorsal de la médula espinal y despejar cualquier exceso de tejido que rodea la longitud de la columna vertebral. </li><li> Impuestos Especiales columna vertebral y cortar cualquier tejido restante. El nivel real de la laminectomía y injury puede ser confirmado contando las costillas. </li><li> Con unas tijeras y fórceps vanna para desplazar pequeñas secciones de la columna vertebral en una dirección-caudal a rostral. Continuar a cortar hasta que el cordón se expone lo suficiente para permitir una extracción segura. La visualización de la ubicación de corte y proceso puede facilitarse mediante el uso de un estereoscopio. </li></ol></li><li> Coloque el tejido de la médula espinal en el 4% PFA. Permitir que el tejido post-fix en esta solución durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Tejido Cryoprotect incubando en el 30% de sacarosa durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Poner un tejido en octubre En pocas palabras, tomar tejido de la incubación de sacarosa al 30% y eliminar el exceso de solución. Coloque el tejido en un criomolde lleno de octubre y se incuba durante 1 hora a 4 ° C. <ol><li> Eliminar el moho de 4 ° C, confirmar la orientación direccional de los tejidos, poner el molde en un plato poco profundo de 2-metilbutano (pre-refrigerada durante 1 h en hielo seco) y se deja solidificar OCT para completamente. Mantener en hielo seco si se utiliza inmediatamente o stovolver a -80 ° C. </li></ol></li><li> Cortar el tejido en 20 micras sagital secciones usando un criostato. Monte tejido directamente sobre portaobjetos. Almacenar a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Realizar hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción. <ol><li> Brevemente, rehidratar el tejido (5 min, 2 veces), mancha con hematoxilina (2,5 min), y lavar con agua (1 min, 2 veces). </li><li> Incubar el tejido en 50% y luego 70% de etanol (3 min cada uno), tinción con eosina (45 seg), y deshidratar por incubación en 90% (5 seg), 95% (5 seg), etanol al 100% (2 min) , e isopropanol (2 min). </li><li> Claro con xileno (5 min, 3 veces). NOTA: tinción H &amp; E variará con el espesor y condiciones tejido específico. Por lo tanto, es necesaria una normalización antes de proceder con las muestras de tejidos experimentales. </li></ol></li><li> Cubrir el tejido con una tira delgada de Permount (~ 100 micras) y cubreobjetos. Presione hacia abajo en todos los lados de cubreobjetos para asegurar una distribución adecuada de líquido. Deje secar los portaobjetos O / N. </li><li> Visualize secciones de tejido utilizando un microscopio y captura de imágenes digitales utilizando el software que lo acompaña. </li></ol>

<ol><li>McDonough, A., Martinez-Cerdeno, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+proliferation+after+SCI+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Endogenous proliferation after SCI in animal models.</a> Stem Cells Int. 2012, 387513(2012).</li>
<li>Onifer, S. M., Rabchevsky, A. G., Scheff, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+models+of+traumatic+SCI+to+assess+motor+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Rat models of traumatic SCI to assess motor recovery.</a> ILAR J. 48 (4), 385-395 (2007).</li>
<li>Bunge, R. P., Puckett, W. R., Becerra, J. L., Marcillo, A., Quencer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+pathology+of+human+SCI.+A+review+and+classification+of+22+new+cases+with+details+from+a+case+of+chronic+cord+compression+with+extensive+focal+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Observations on the pathology of human SCI. A review and classification of 22 new cases with details from a case of chronic cord compression with extensive focal demyelination.</a> Adv Neurol. 59, 75-89 (1993).</li>
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<li>Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graded+histological+and+locomotor+outcomes+after+spinal+cord+contusion+using+the+NYU+weight-drop+device+versus+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection.</a> Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).</li>
<li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contusion+model+of+severe+SCI+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A contusion model of severe SCI in rats.</a> J Vis Exp. 78, (2013).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+graded+forceps+crush+SCI+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A graded forceps crush SCI model in mice.</a> J Neurotrauma. 25 (4), 350-370 (2008).</li>
<li>Wu, D., Shibuya, S., Miyamoto, O., Itano, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+NG2-positive+cells+associated+with+radial+glia+following+traumatic+SCI+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Increase of NG2-positive cells associated with radial glia following traumatic SCI in adult rats.</a> J Neurocytol. 34 (6), 459-469 (2005).</li>
<li>Namiki, J., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+nestin+expression+in+the+ependyma+of+the+adult+rat+spinal+cord+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and nestin expression in the ependyma of the adult rat spinal cord after injury.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (5), 489-498 (1999).</li>
<li>Teletin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+in+Mouse+Metabolic+Investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Histopathology in Mouse Metabolic Investigations.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 29, (2007).</li>
<li>McDonough, A., Hoang, A. N., Monterrubio, A. M., Greenhalgh, S., Martinez-Cerdeno, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression+injury+in+the+mouse+spinal+cord+elicits+a+specific+proliferative+response+and+distinct+cell+fate+acquisition+along+rostro-caudal+and+dorso-ventral+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compression injury in the mouse spinal cord elicits a specific proliferative response and distinct cell fate acquisition along rostro-caudal and dorso-ventral axes.</a> Neuroscience. 254, 1-17 (2013).</li>
<li>Basso, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basso+Mouse+Scale+for+locomotion+detects+differences+in+recovery+after+SCI+in+five+common+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after SCI in five common mouse strains.</a> J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La elección de un modelo de SCI es importante en el diseño de experimentos para determinar la eficacia de los tratamientos para los casos humanos de SCI. Tales experimentos requieren un modelo animal que es altamente reproducible para limitar la variabilidad que puede resultar en datos no concluyentes. También deben ser de relevancia clínica para evaluar con precisión la condición humana que están modelando. Para ello, la elección de una lesión de compresión o contundente sobre una transección es más clínicamente relevante 3. Sin embargo, impactadores y aparatos caída de peso para las lesiones de contusión requieren el uso de maquinaria costosa y complicada. En contraste, el fórceps modelo calibrado de SCI utiliza fórceps que son fáciles de montar a partir de materiales comunes de laboratorio modificado, y la cirugía requiere sólo un paso adicional después de una laminectomía dorsal estándar para exponer la médula espinal. Sin embargo, un inconveniente de la utilización de este método es que la fuerza de compresión se aplica siempre lateralmente en lugar de dorsalmente, comomás a menudo se ve en los casos clínicos humanos de SCI 9, y las lesiones de compresión generados utilizando el método afecta en mayor medida rostral caudal de tejido que los modelos contusión 1,2. Este modelo ha sido demostrado por los creadores de la técnica, y nosotros, para generar reproducible SCI 7,11, y es muy adecuado para el tamaño de los ratones. Además, este modelo de lesión permite que los animales sean evaluados después de tratamientos de cirugía y terapéuticos utilizando una multitud de pruebas de comportamiento, como el ratón Escala Basso para la locomoción y la prueba de pelo de Von Frey, para verificar que una cohorte de animales comparten la misma gravedad de la lesión y déficits neurológicos 7,11-13. Estas mismas técnicas también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de los tratamientos administrados a los animales durante los estudios de investigación, el cumplimiento de los criterios generales para modelos animales utilizados para evaluar las terapias para SCI 2,7. El método de producción de la pinza calibradas para el modelo de lesión es simple y se puede lograr con una variedad de métodos diferentes. Hemos utilizado el método de espaciador 11, según lo publicado por Plemel 7, y también han modificado fórceps utilizando un pequeño tornillo, que no sólo proporciona un método más fácil para crear el dispositivo de compresión, sino que también permite versatilidad en el ajuste de la anchura de compresión final, de beneficiarse de los estudios comparativos. La gama de opciones en la creación de las pinzas es casi ilimitado, siempre que el espaciador (s) proporciona un medio estable de siempre el cierre de las pinzas a la misma distancia y puede resistir la esterilización en autoclave y de esterilización. Los métodos quirúrgicos descritos en este vídeo son altamente reproducibles en todos los usuarios, sin embargo, es necesario que tenerse cuidado al realizar la laminectomía y suturar el animal después de que el procedimiento se ha realizado de manera que la médula espinal no sufre ningún fuerzas de compresión adicionales que pueden aumentar la gravedad de la lesión y confundir futuros experimentos. </p&gt; Con el entrenamiento y la práctica adecuada, el fórceps modelo calibrado de lesión de compresión es muy adecuado para la realización de SCI en ratones que imitan los casos clínicos observados en los seres humanos 2,3,7. Debido a la facilidad de crear fórceps, producir ratones de diferentes grados de gravedad de la lesión se puede hacer fácilmente. Esto será de gran beneficio para la observación de los efectos genéticos sobre SCI de diferentes grados de severidad en ratones transgénicos, así como la evaluación de la eficacia de los trasplantes de células madre en ratones. La mayoría de los estudios en la literatura se han realizado en ratas debido a su tamaño, que generalmente hace que las cirugías más fácil de realizar. Sin embargo, el método publicado por Plemel et al. 7 y descrito por nosotros en este vídeo debería permitir SCI a realizar en ratones con gran facilidad y reproducibilidad.

Los modelos animales de SCI son herramientas valiosas para evaluar la eficacia de paradigmas terapéuticos diseñados para mitigar los daños como consecuencia de un traumatismo en la médula espinal. Fuera de la necesidad experimental, estos modelos deben proporcionar déficits reproducibles en locomotora y los comportamientos sensoriales, ser ajustable para producir lesiones de diferente gravedad, y demuestran que la gravedad de la lesión se correlaciona con el grado de déficit neurológico observado. Hay tres tipos principales de SCI con distintas características de la lesión: transección, contusión, compresión y 1. Brevemente, una lesión en la transección es una laceración en la médula espinal, una lesión por contusión surge de una breve vigor, focal aplicada a la médula espinal dorsal, y una lesión de compresión se produce cuando se aplica una fuerza perjudicial a la médula espinal, y puede ser también referido como una lesión por aplastamiento 2. Las lesiones completas transección son clínicamente poco común en los seres humanos 3, mientras que una contusiónd lesiones de compresión son más comunes. La lesión de compresión produce un resultado similar a lo que se encuentra en SCI humana causada por, por ejemplo, compresión del tumor u otras fuerzas de compresión perjudiciales, y se puede realizar utilizando un simple conjunto de herramientas. Contusiones y compresión son similares en que ambas son una fuerza de compresión y ambos tienen características patológicas similares, tales como la desorganización cytoarchitectonic, y evocan respuestas endógenas similares a las lesiones 1,4. El modelo de lesión por contusión por lo general se aplica esta fuerza a la médula espinal dorsal usando un aparato especial de una manera similar a los casos humanos de SCI resultantes de una impactación de la columna vertebral 2,5,6. En contraste, las lesiones de compresión pueden ser generados por una variedad de métodos de aplicación de la fuerza dorsalmente o lateralmente. Métodos de una lesión de compresión incluyen pinzas 7, clips de aneurisma calibrados 2, o la colocación de un peso directamente en la médula espinal 8. Una ventaja de laclips de aneurisma es que son capaces de proporcionar diferentes cantidades de fuerza 9. El método de la adición de pesos a la superficie dorsal de la médula espinal directamente 8 requiere que el peso a estar en su lugar durante 10 min, aumentando drásticamente la duración de la cirugía y que resulta en inconsistencias debido a la colocación del peso y el movimiento debido a la respiración de la animal. Debido al pequeño tamaño de los ratones, situando los animales en aparatos especializados diseñados para el uso en ratas, como impactadores para las lesiones de contusión, puede ser difícil o resultar en lesiones inconsistentes 7. Sin embargo, los ratones están disponibles en una amplia gama de cepas transgénicas, a diferencia de los animales más grandes tales como ratas o conejos que son muy útiles para la investigación SCI. El método Plemel de utilizar fórceps calibrados para comprimir la médula espinal genera un SCI reproducible con un alto grado de correlación entre la gravedad de la lesión y el déficit neurológico 7. Este modelo SCI quirúrgico esgenerado usando un par de fórceps No. 5 Dumont modificados que tendrá lugar aparte a una distancia definida por cualquiera de epoxi de metal o de alguna otra obstrucción para impedir el cierre completo. Esta separación de ingeniería asegura que el fórceps será siempre cerca de una cierta anchura en múltiples cirugías y por diferentes usuarios. La ventaja del método Plemel es que los materiales para producir los fórceps calibrados se pueden comprar y ensamblados en el laboratorio sin necesidad de equipo especializado fácilmente. Estas pinzas pueden soportar múltiples rondas de tratamiento en autoclave y de esterilización, y la falta de un aparato separado, voluminosos agiliza cirugías. En este vídeo se demuestra el uso quirúrgico de un par de fórceps calibrados en la médula espinal de ratón para generar una lesión de compresión. También abordamos preocupaciones únicas relacionadas con el cuidado de los animales de la médula espinal lesionada de laboratorio para mejorar su calidad de vida después de la operación y reducir la mortalidad.

<table><tbody><tr><td>Máquina de isoflurano</td><td>Smiths Medical PM, Inc</td><td>VCT302</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Phoenix Pharmaceutical</td><td>NDC: 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Visor de disección</td><td>Seiler Microscopios de precisión</td><td>SSI 202/402</td><td></td></tr><tr><td>Germinator-500 (esterilizador de herramientas)</td><td>Thomas Scientific</td><td>3885A20</td><td></td></tr><tr><td>Puralube (ungüento para los ojos)</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí (#3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí (#11)</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 08-914B</td><td></td></tr><tr><td>Retractor (Colibrí)</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson roungeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Vanna (Castroviejo) tijeras</td><td>Roboz</td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de tejido</td><td>Fine Science Tools</td><td>11029-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de laminectomía (Dumont #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Grapadora</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>Grapas (pinzas enrolladas)</td><td>Reflex7</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Agujas (30 G x &frac12;)</td><td>BD Biomedical</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa (1 ml)</td><td>BD Biomedical</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (enrofloxacina)</td><td>Bayer</td><td>NADA 140-913</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex (buprenorfina)</td><td>Cardinal Health</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td></td></tr></tbody></table>

calibrado pinzas modelo de lesión medular compresión

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Lesiones por compresión de la médula espinal murino son modelos animales valiosos para el estudio de la lesión de la médula espinal (SCI) y la terapia regenerativa vertebral. El fórceps modelo calibrado de lesión de compresión es un cómodo, de bajo costo, y el modelo animal muy reproducible para SCI. Se utilizó un par de fórceps modificados de acuerdo con el método publicado por Plemel et al. (2008) para comprimir lateralmente la médula espinal hasta una distancia de 0,35 mm. En este video, vamos a demostrar una laminectomía dorsal para exponer la médula espinal, seguido de compresión de la médula espinal con las pinzas modificados. En el video, también vamos a tratar temas relacionados con el cuidado de los animales de laboratorio parapléjicos. Este modelo de lesión produce ratones que exhiben deterioro en la sensación, así como deterioro de la función del miembro posterior del aparato locomotor. Además, este método de lesión produce aberraciones consistentes en la patología de la SCI, como se determina por métodos inmunohistoquímicos. Después de ver este videoeo, los espectadores deben ser capaces de determinar los suministros y métodos necesarios para la producción de SCI de diversos niveles de gravedad en el ratón para los estudios sobre SCI y / o tratamientos diseñados para mitigar el deterioro después de la lesión.

Se realizó una laminectomía en 12 ratones (de 25 - 30 gramos) tal como se describe anteriormente, seguido de compresiones de la médula espinal a 0,25 mm (n = 4), 0,35 mm (n = 4) y 0,55 mm (n = 4). Sacrificamos animales en tres (n = 6) y siete (n = 6) días después de la lesión por perfusión intracardiaca. La médula espinal fue retirado de la columna vertebral, y el tejido se preparó y se procesó como se ha descrito anteriormente. Imágenes de toda la médula espinal fueron tomadas con un microscopio digital Leica EZ4 y el software que lo acompaña. Imágenes de la médula espinal secciones fueron tomadas con una ampliación de 2X usando un microscopio digital Olympus y el software que lo acompaña. Encontramos que la compresión de la médula espinal produce una lesión con el epicentro en el sitio de la compresión (Figura 1). Los efectos de la lesión se extienden varios milímetros en las direcciones rostral y caudal. La gravedad de la lesión aumentó a medida que la distancia entre los espaciadores disminuyó (0,25 mm&gt; 0,35 mm&gt;0,55 mm, la Figura 2). Tres días después de la compresión había sangre en el epicentro de la lesión y las regiones circundantes que no se presentan 7 días después de la lesión. Las compresiones 0,25 mm y 0,35 mm producen una cavidad, pero no el modelo de 0,55 mm. Después de 7 días, el dorsal y ventral de la sustancia blanca disminuyeron en gran medida de tamaño en el epicentro, la organización de la materia gris fue muy distorsionado, y la cavitación era persistente. Estas alteraciones cytoarchitectonical se traducen a motor y alteraciones sensoriales en el comportamiento de los animales evaluados mediante pruebas adecuadas, tales como el ratón Escala Basso para la función locomotora y las pruebas para el cabello y el cloruro de etilo von Frey de la función sensorial como lo demostramos en publicaciones anteriores 8. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52318/52318fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Imágenes representativas de la médula espinal intacta tanto antes como aflesiones ter. (A) Intacto médula espinal. (B) de la médula espinal después de 0,35 mm de compresión. Las flechas indican la frontera de la lesión. Asterisk indentifies epicentro de la lesión. D = Dorsal, L = Lateral. Barra de escala:. 0.50 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52318/52318fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52318/52318fig2highres.jpg" width="650" /> Figura 2. Imágenes representativas de médula espinal de ratón antes y después de la lesión por compresión a diferentes anchos de compresión. (A) Corte sagital de control de la médula espinal. (B) Corte coronal en epicentro de un 0,35 mm SCI 7 días lesión de compresión post (dpi). (C, E, G) Sagital secciones de la médula espinal 3 dpi a una anchura de 0,25 , 0,35 o 0,55 mm. (D, F, H) sagital secciones de H &amp; E manchadas de la médula espinals 7 dpi a una anchura de 0,25, 0,35 o 0,55 mm. Asterisk indentifies epicentro de la lesión. Todas las secciones teñidas con H &amp; E. D = Dorsal, L = Lateral. Barra de escala:. 1.25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52318/52318fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los modelos de lesiones medulares deben ser altamente reproducibles. Demostramos que el modelo de compresión con pinzas calibradas de la lesión de la médula espinal es un método quirúrgico fácil de usar para generar lesiones reproducibles en la médula espinal murina.

Calibrado Pinzas Modelo de Lesión Medular Compresión

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar los pasos necesarios para generar una lesión por compresión de la médula espinal reproducible en ratones utilizando fórceps calibrados. Esto se logra mediante la eliminación cuidadosa de las capas de piel y músculo sobre la columna vertebral e identificando el objetivo vertebral correcto. A continuación, se realiza una laminectomía en las vértebras seleccionadas para exponer la médula espinal, y luego se utilizan fórceps calibrados para producir la lesión de la médula espinal.Los resultados ilustran el grado de daño en el tejido de la médula espinal tras una compresión de la médula espinal, utilizando técnicas histoquímicas. Por lo general, las personas que son nuevas en este método tendrán dificultades. Usted está realizando un procedimiento muy delicado en un animal pequeño, con un margen de error mínimo.Este es un tejido sensible, y podría causar accidentalmente una lesión más grave de la deseada, por lo que conviene practicar primero. Para prepararse para la cirugía, reúna los siguientes instrumentos y reactivos quirúrgicos: pinzas, tijeras de Van, bisturíes URS, suturas retráctiles, grapas quirúrgicas, bastoncillos de algodón, solución salina estéril, esponjas quirúrgicas y isoflurano, que se utiliza junto con una máquina de anestesia. Esterilice los instrumentos en autoclave para una sola cirugía y utilice un esterilizador de instrumentos para desinfectarlos entre intervenciones. Use alcohol isopropílico al 70 % para desinfectar el campo quirúrgico y coloque campos quirúrgicos para garantizar que se mantenga un campo estéril durante la cirugía.Después de pesar a cada ratón antes de la cirugía, administre una dosis de 0,05 miligramos por kilogramo de peso corporal de buprenorfina por vía subcutánea una vez que el animal haya sido anestesiado; según el protocolo descrito, aplique un ungüento en los ojos para prevenir la deshidratación y afeite la superficie dorsal del ratón aproximadamente un centímetro alrededor del lugar previsto para la incisión. Para desinfectar el sitio de la incisión, utilice una solución de yodo seguida de alcohol isopropílico al 70%. Repita el procedimiento tres veces antes de comenzar la cirugía.Primero, realice un pellizco en el dedo del pie o en la cola para evaluar los reflejos. Si no hay ninguno presente, use un escalpelo para hacer una incisión a lo largo de la columna dorsal, cortando a través de la piel.Inserte el retractor para mantener la piel alejada de la médula espinal. Vuelva a verificar los reflejos. Luego, elimine el tejido a ambos lados de la médula espinal para exponer los músculos que cubren la columna; arquee la espalda para visualizar adecuadamente puntos de referencia anatómicos, como los límites entre las vértebras.Deben ser visibles los siguientes puntos de referencia. El ángulo inferior de la escápula, que corresponde al T siete, y la parte superior de la curva natural de la médula espinal del ratón en TT 12 con iluminación adecuada. Determine el espacio entre las vértebras.Luego, localice el extremo posterior de T10 y corte solo los músculos y la fascia necesarios, perpendicularmente al espacio del disco intervertebral, para exponer el proceso espinoso y la lámina posterior de T10 utilizando una pinza fina Dumont número cinco. Retire algo del tejido de la lámina y del proceso espinoso para exponer una pequeña porción de la médula espinal. Cuando sea necesario, utilice pinzas de tejido para estabilizar la columna vertebral.A continuación, realice la laminectomía insertando un lado de un par de tijeras pequeñas de VNA a lo largo del lado lateral dorsal de la vértebra, justo debajo de la lámina. Luego, haga pequeños cortes cuidadosos para seccionar el lado lateral izquierdo de la lámina vertebral. Repita el procedimiento en el otro lado.Asegúrese de que no se aplique presión sobre la médula espinal con un hisopo de algodón ni con una esponja quirúrgica. Aplique presión suave para detener la hemorragia según sea necesario, teniendo cuidado de no ejercer presión sobre la médula espinal.Una vez realizadas las incisiones, levante la porción dorsal de la vértebra y retire con cuidado cualquier tejido adyacente. Utilice los medios adecuados para controlar la hemorragia si fuera necesario. Con pinzas inadecuadas o pinzas para laminectomía, asegúrese de que los lados laterales de la médula espinal estén libres de hueso vertebral para que las pinzas calibradas para la lesión por compresión puedan colocarse correctamente a ambos lados de la médula espinal.Ahora coloque la pinza Dumont calibrada número cinco aproximadamente en la mitad del segmento expuesto de la médula espinal, con las ramas de la pinza dentro del espacio epidural y las puntas tocando el piso del canal vertebral. Comprima cuidadosamente la médula espinal hasta que los separadores se conecten y manténgalos en su lugar durante 15 segundos.Luego, libere suavemente la fuerza compresiva y retire la pinza calibrada de la médula espinal. Aplique solución salina estéril para restablecer la homeostasis y sutúre cuidadosamente la capa muscular sobre la médula espinal, teniendo cuidado de no alterar ni aplicar presión sobre esta.Utilice suturas o grapas para cerrar la piel sobre la herida. Administre un mililitro de solución de Ringer lactatado por cada 10 gramos de peso corporal para ayudar con la deshidratación. Antes de colocar al ratón en una jaula sin cama sobre una almohadilla térmica ajustada a aproximadamente 37 grados Celsius.En un ambiente tranquilo, supervise estrechamente al animal hasta que recupere la conciencia. Luego, transfiera al animal a una jaula normal con cama para los primeros tres días posteriores a la cirugía, administre una dosis de 0,05 miligramos por kilogramo de peso corporal de buprenorfina por vía subcutánea cada 12 horas, y posteriormente según sea necesario para controlar los síntomas de dolor dos veces al día. Utilice la maniobra decretada para expresar manualmente la vejiga del animal mediante la palpación suave del abdomen del animal con el fin de localizar la vejiga y aplicar una presión suave descendente hasta que la vejiga quede vacía.Debido a la movilidad reducida del animal inmediatamente después de la cirugía, tome las medidas necesarias para facilitarle el acceso a alimento y agua proporcionando alimento húmedo e hidrogel. Consulte el protocolo escrito para evaluar el daño tisular en la laminectomía y las compresiones de la médula espinal en el punto 25 milímetros. En 12 ratones se realizaron procedimientos en el punto 35 milímetros o en el punto 55 milímetros, y fueron sacrificados a los tres o siete días posteriores a la lesión mediante perfusión intracardiaca, como se observa aquí.La compresión de la médula espinal produce lesiones con el epicentro en el sitio de la compresión, y los efectos de la lesión se extienden varios milímetros en dirección rostral y caudal. Esta figura muestra que la gravedad de las lesiones aumentó a medida que disminuía la distancia entre los espaciadores. Por ejemplo, las compresiones de 25 milímetros y de 35 milímetros produjeron una cavidad que no se observó en el modelo de 55 milímetros; tres días después de la compresión, había sangre en el epicentro de la lesión y en las regiones circundantes, la cual no estaba presente siete días después de la lesión. Tras siete días, la sustancia blanca dorsal y ventral disminuyó considerablemente en tamaño en el epicentro.La organización de la sustancia gris estaba altamente distorsionada y la cavidad persistía tal como se demostró previamente; la arquitectónica celular se traduce en alteraciones motoras y sensoriales en el comportamiento animal, evaluadas mediante la escala de ratón besso para la función locomotora y las pruebas del pelo von Frey y del cloruro de etilo para la función sensorial. Tras este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales, como el trasplante directo de células o la inyección de otros agentes terapéuticos en la médula espinal, para responder preguntas adicionales, tales como si una terapia específica puede mejorar el resultado tras una lesión medular.

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Una manera confiable y repetible para producir una lesión unilateral del cuello uterino de la médula espinal con el impactador horizonte infinito es descrito. El método aprovecha las ventajas de un marco de diseño personalizado y la abrazadera para estabilizar la columna. El procedimiento estandarizado y las lesiones biomecánicas resultado los parámetros de las lesiones suficiente y sostenida.

Un modelo de la contundente unilateral Lesión Medular Cervical Uso del Impactador Infinite Horizon

Fuente: Elzat, E. Y. Y., et al., Establecimiento de un modelo de lesión medular por contusión en ratón basado en una técnica mínimamente invasiva. J. Vis. Exp. (2022). Este video muestra el método para inducir una lesión por contusión a nivel de la médula espinal T9 en un modelo de ratón, utilizando una plataforma coaxial para lesiones de la médula espinal. Se deja caer un peso sobre la médula espinal a nivel T9 que crea una contusión que inmediatamente causa decoloración e hinchazón del tejido.

Inducción de una contusión de la médula espinal en un modelo de ratón utilizando una plataforma coaxial para lesiones de la médula espinal

Fuente: Zheng, W. et. al., Imágenes de resonancia magnética con tensor de difusión en la compresión crónica de la médula espinal. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra imágenes de tensor de difusión para evaluar la compresión crónica de la médula espinal. Al analizar los patrones de difusión del agua, la anisotropía fraccional y los valores del coeficiente de difusión aparente, los hallazgos revelan daño axonal en regiones comprimidas. Los hallazgos proporcionan información crítica sobre la...

Evaluación de la compresión de la médula espinal mediante imágenes de tensor de difusión

Se describe un modelo de contusión de la lesión medular grave. Medidas pre-operatorio, operatorio y post-operatorio detalladas se describen para obtener un modelo coherente.

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Estabilización vertebral es necesaria para minimizar la variabilidad, y para la producción de lesiones de médula espinal experimentales consistentes. Utilizando un aparato de estabilización personalizado en combinación con el dispositivo impactador NYU / Mascis, hemos demostrado aquí el equipo y el procedimiento adecuado para la generación de cervicales (C5) de lesiones de la médula reproducibles-hemi contusa espinal en ratas adultas.

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Este artículo describe un método para generar una lesión por compresión de la médula espinal (LME) reproducible en el ratón neonatal. El modelo proporciona una plataforma ventajosa para estudiar los mecanismos de plasticidad adaptativa que subyacen a la recuperación funcional espontánea.

Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo

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Un modelo de lesión de la médula espinal contundente basado en el desplazamiento de tejidos en ratones

Las técnicas mínimamente invasivas y un dispositivo de laboratorio simple mejoran la reproducibilidad del modelo de lesión de la médula espinal al reducir el daño operatorio a los animales de experimentación y permitir el mantenimiento de la morfología anatómica. El método vale la pena porque los resultados confiables y el procedimiento reproducible facilitan las investigaciones de los mecanismos de reparación de enfermedades.

Establecimiento de un modelo de lesión de la médula espinal por contusión en ratones basado en una técnica mínimamente invasiva

El protocolo actual, que simula el síndrome del cordón central (CCS) en ratones, ha mejorado la repetibilidad y minimizado el daño operativo a los animales de experimentación, evitando alterar excesivamente la estructura anatómica. La estrategia de este estudio es ventajosa porque permite investigar los mecanismos de lesión al producir resultados consistentes.

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Aquí se presenta un novedoso dispositivo automatizado de contusión por lesión de la médula espinal para ratones, que puede producir con precisión modelos de contusión por lesión de la médula espinal con diversos grados.

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Calibrado Pinzas Modelo de Lesión Medular Compresión

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