Name: Evaluación del Impacto de la exposición repetida de Organotípicos 3D bronquiales y nasales Modelos Tissue Culture Whole humo del cigarrillo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende a evaluar el impacto del humo de cigarrillo en modelos tisulares 3D bronquiales y nasales mediante técnicas de interfase aire-líquido. Este método permite analizar la frecuencia del latido ciliar y respuestas transcriptómicas.

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Los autores desean agradecer a Maurice Smith y Marja Talikka para su revisión del manuscrito.

<ol><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+air-liquid+interface+and+use+of+primary+cell+cultures+are+important+to+recapitulate+the+transcriptional+profile+of+in+vivo+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiolog%22%5BJournal%5D)">The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biolog%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+airway+epithelium+air%E2%80%93liquid+cultures+represent+the+in+vivo+airway+epithelium+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome.</a> American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biolog%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicolog. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Mathis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+exposed+in+vitro+to+cigarette+smoke+at+the+air-liquid+interface+resemble+bronchial+epithelium+from+human+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physio%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).</li>
<li>Cho, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+cytotoxicity+assay+for+assessment+of+membrane+integrity+using+a+proteolytic+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitr%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker.</a> Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).</li>
<li>Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Differentiated+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Culture+Systems+for+Asthma+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allerg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research.</a> Journal of Allerg. 2012, 11(2012).</li>
<li>Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazi%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Pharmazi. , 19-24 (2010).</li>
<li>Chhin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beating+recovery+in+deficient+human+airway+epithelial+cells+after+lentivirus+ex+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetic%22%5BJournal%5D)">Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy.</a> PLoS genetic. 5, e1000422(2009).</li>
<li>Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+nasal+epithelial+cells+grown+as+explant+outgrowth+cultures+or+dissociated+tissue+cultures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Me%22%5BJournal%5D)">Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro.</a> Front Me. 7, 486-491 (2013).</li>
<li>Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+reproductive+toxicity+of+tobacco+smoke+and+its+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+%3A+review%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).</li>
<li>Port, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+CYP1B1+in+the+aerodigestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesi%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract.</a> Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).</li>
<li>Hoeng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network-based+approach+to+quantifying+the+impact+of+biologically+active+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Toda%22%5BJournal%5D)">A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances.</a> Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).</li>
<li>Iskandar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+approaches+evaluating+the+perturbation+of+xenobiotic+metabolism+in+response+to+cigarette+smoke+exposure+in+nasal+and+bronchial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+In%22%5BJournal%5D)">Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues.</a> Biomed Res In. 2013, 512086(2013).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , The R Core Team. (2011).</li>
<li>Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mapping+of+probes+to+genes+for+Affymetrix+chips%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatic%22%5BJournal%5D)">Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips.</a> BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).</li>
<li>Hermida, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confero%3A+an+integrated+contrast+data+and+gene+set+platform+for+computational+analysis+and+biological+interpretation+of+omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomic%22%5BJournal%5D)">Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data.</a> BMC genomic. 14, 514(2013).</li>
<li>Thomson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+biological+impact+using+transcriptomic+data+and+mechanistic+network+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+applied+pharmacolog%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models.</a> Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).</li>
<li>Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+applied+by+cilia+depend+linearly+on+their+frequency+due+to+constant+geometry+of+the+effective+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journa%22%5BJournal%5D)">The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke.</a> Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sc%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiolog%22%5BJournal%5D)">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+between+smoking-related+gene+expression+in+nasal+and+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+genomic%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium.</a> Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).</li>
</ol>

Este estudio fue financiado por Philip Morris International.

Aquí, hemos demostrado la aplicabilidad de los modelos de tejidos nasales bronquial y organotípico humano para evaluar el impacto de la exposición repetida CS. Como alternativa a la experimentación con animales, se han desarrollado una serie de sistemas de exposición para las evaluaciones toxicológicas de la exposición al aerosol in vitro (por ejemplo., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Estos módulos de exposición también se pueden utilizar para una evaluación toxicológica de los contaminantes del aire, partículas en el aire, nanopartículas, etc. En este estudio, hemos utilizado el sistema Vitrocell que puede acomodar hasta 48 muestras diferentes de forma simultánea, lo que permite más grandes experimentos a escala y una menor variabilidad entre tratamientos. Para cada exposición al aerosol in vitro, el riesgo de contaminación de cultivo de tejidos sigue siendo un riesgo importante cuya mitigación exige un manejo cuidadoso de los cultivos de tejidos a lo largo de los experimentos. Medición de la deposición de partículas en tiempo real en la microbalanza durante el eexperimento Xposure permite monitorear que las dosis CS generados por el sistema de exposición son conformes a las expectativas. Para asegurar la exactitud de la deposición de partículas medido, creación de la medición en línea correctamente antes de la exposición es critial, por ejemplo, el establecimiento de la escala a 0. Además, debido a la diferencia entre las áreas de la microbalanza (2 cm) y la inserción de cultivo de tejido (0,33 cm 2), se ajustó el cálculo final de la zona de la inserción de cultivo: sólo el 33% de la deposición sobre la microbalanza refleja la deposición real en el inserto de cultivo. La medición de la TEER para determinar la funcionalidad de barrera apretado nudo y para evaluar la interrupción de la capa epitelial es un procedimiento relativamente fácil de implementar, que se informó aquí. Sin embargo, debido a que los modelos de tejidos bronquiales y nasales contienen células caliciformes intercalados productoras de moco, lavado apical debe realizarse antes de las meas TEERmedi-. El lavado apical es crítico debido a la presencia de la capa de moco y la variabilidad de su espesor puede sesgo de la medición de la TEER, interferring con el impacto de la exposición CS. Esta noción está de acuerdo con lo reportado por Hilgendorf y sus colegas, en el que la permeabilidad de las células Caco-2 se vio afectada por el co-cultivo con la línea de células caliciformes productoras de moco HT29 23. El moco necesita ser lavada antes de la medición TEER, porque el lavado apical justo antes de la exposición puede interferir con las respuestas de los tejidos a CS. Por lo tanto, la medición se lleva a cabo tres días antes de la exposición, y no justo antes de la exposición. Hemos demostrado que la actividad de CYP1A1 / CYP1B1 podría medirse a partir de los modelos de cultivos organotípicos tras la exposición CS aunque la actividad se incrementó sólo modestamente por CS. Esta señal débil puede ser amplificada por una incubación más largo del sustrato CYP1A1 / 1B1 (es decir., Luciferina-CEE), por ejemplo para24 h (datos no mostrados). Una de las limitaciones de la medición de la actividad de CYP en el presente trabajo es la ausencia de normalización a nivel de la proteína CYP o para el recuento de células, lo que podría ser tomada en consideración para futuros estudios para garantizar que la alteración en la actividad de la enzima no se ve influenciada por la alteración de ya sea el nivel de proteína o el recuento de células. Nos informó que la exposición CS inhibe la ciliar superando tanto en los modelos de tejido bronquial y nasal. Observaciones similares se realizaron en diversos modelos de mamíferos y no mamíferos 12. Para ciliar batiendo medición, asegurando que los tejidos son manipulados y tratados de manera similar es crítica, por ejemplo, si se implementa el cambio medio, debe ser aplicado en todas las muestras. Sutto y sus colegas informaron que el pH afecta la ciliar mamíferos latiendo frecuencia 24. Por lo tanto, al comparar superando frecuencias entre las células tratadas con diferentes COMPUESTOS / mezclas, pHajuste debe ser considerado para minimizar la variabilidad de la medición latido ciliar. Además, la temperatura a la que se lleva a cabo la medición es también crítico como la frecuencia de golpeo ciliar disminuye con la disminución de la temperatura. Para minimizar la variabilidad debida a estos cambios, una incubadora de etapa superior, equipadas con la temperatura, CO2 y de la humedad se utilizó en este estudio. A pesar de ello, se observó que el ciliar batiendo frecuencias en los tejidos bronquiales después de la exposición CS eran muy variables (es decir., Aumentar en un inserto y disminuir en el otro inserto), lo que sugiere que el movimiento ciliar es correcto altamente perturbado después de la exposición. En contraste, se observó la ausencia de frecuencias de batido ciliar medibles en el tejido nasal después de la exposición CS, lo que sugiere que la respuesta del tejido nasal es más sensible y consistente. Esto está de acuerdo con una publicación anterior que demuestra que el tejido de la nariz tiene una menor capacidad para desintoxicar comoen comparación con el bronquio 25. Por último, hemos demostrado que la expresión de genes de perfiles del bronquial organotípico y modelos de tejidos nasales expuestos a CS podría demostrar un impacto de CS en el metabolismo de xenobióticos. Curiosamente, la alteración observada en el metabolismo de xenobióticos en el organotípicos bronquial y nasal en modelos in vitro expuestos a CS asemejan a la de la situación in vivo en los fumadores como se discute en mayor detalle en una publicación anterior 15. Para los análisis de la expresión génica, usando el instrumento robótico hace un análisis de alto rendimiento posible. Por otra parte, el manejo robótico automático aumenta aún más la consistencia y exactitud de los resultados de la expresión génica. Sin embargo, la recogida rápida de las muestras de tejido era crítico para evitar la degradación del ARN durante la extracción de RNA. El procesamiento del ARN y los enfoques transcriptomic descritos aquí también se pueden aplicar a in vivo muestras de tejido.

Los pulmones están directa y constantemente expuestos al aire inhalado que puede contener diversos tóxicos como contaminantes y constituyentes del humo del cigarrillo (CS). El estudio del impacto de la exposición a esos tóxicos en los tejidos respiratorios es más informativo cuando se realiza de una manera que se asemeja a la exposición in vivo. En comparación con los cultivos celulares sumergidos en 2D clásicos (por ejemplo, células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE)), los modelos de tejido organotípico en 3D recapitulan mejor los aspectos morfológicos, fisiológicos y moleculares del epitelio de las vías respiratorias humanas in vivo1,2: los modelos de tejido en 3D contienen la diversidad de los tipos de células observados in vivo, incluidas las células epiteliales diferenciadas, las células ciliadas y no ciliadas, las células caliciformes y las células basales. Tienen uniones estrechas funcionales y exhiben un fenotipo mucociliar 1-3. Además, los cultivos pueden cultivarse en una membrana porosa permeable, en una interfaz aire-líquido, lo que permite una exposición directa al aerosol en el lado apical (mientras que el lado basolateral se sumerge en el medio de cultivo) 3-5. Dvorak y sus colegas informaron que los perfiles de expresión génica de los modelos de tejido bronquial eran similares a los obtenidos de los cepillados bronquiales humanos. Además, Mathis y colaboradores demostraron que las respuestas de estos modelos de tejido a la CS eran similares a las diferencias observadas entre las células epiteliales bronquiales obtenidas de fumadores y las células obtenidas de no fumadores 6. Por último, dado que los modelos de tejido bronquial podrían cultivarse durante varios meses 4,5, podrían utilizarse para examinar los efectos de la exposición a largo plazo de los elementos de prueba. 
Las evaluaciones de citotoxicidad son parámetros comunes medidos después de agresiones químicas o para evaluar la toxicidad de compuestos o mezclas específicas. Por ejemplo, la integridad de la membrana puede medirse mediante un ensayo luminiscente y permite medir un efecto citotóxico dependiente de la dosis en el cultivo celular 7. Sin embargo, para evaluar los efectos fisiopatológicos de los compuestos a concentraciones subtóxicas, deben medirse otros parámetros. Por ejemplo, la integridad del tejido determinada mediante el ensayo de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) garantiza la funcionalidad de las uniones estrechas y monitorea la disrupción de la capa epitelial 8,9. La frecuencia de latidos ciliares también permite medir los efectos relacionados con el CS en los tejidos respiratorios. Una frecuencia normal de latidos para el revestimiento de cilios que bordea el tracto respiratorio superior e inferior es importante para proteger contra las infecciones de las vías respiratorias 10. Cada una de las células epiteliales cilíndricas ciliadas del epitelio respiratorio tiene 200-300 cilios latiendo a una frecuencia determinada para eliminar los agentes infecciosos o las partículas inhaladas atrapadas en el moco liberadas por las células caliciformes intercaladas 11. El CS contiene sustancias químicas que pueden inhibir el latido ciliar 12, lo que reduce la protección de las vías respiratorias. Este trabajo muestra que el latido ciliar se puede medir en modelos de tejido organotípico. Este enfoque permite evaluar si las células epiteliales exhiben su función normal en el cultivo de tejido organotípico. El CS también activa las respuestas del metabolismo xenobiótico en el tracto respiratorio para metabolizar los componentes del humo del tabaco 13. Se puede medir la actividad de las enzimas del metabolismo xenobiótico de fase I, CYP1A1 y CYP1B1, de los modelos tisulares. Además, como se informó anteriormente, la expresión génica global se puede medir en los modelos organotípicos de tejido bronquial 6,14,15. Se aprovecha un enfoque de biología de sistemas basado en redes y datos transcriptómicos para evaluar el impacto de la CS en el metabolismo de los xenobióticos 15. 
Las metodologías utilizadas para exponer modelos organotípicos de tejido bronquial y nasal en 3D a la corriente principal de CS utilizando un sistema de exposición in vitro y para medir las respuestas de los tejidos a esta exposición en comparación con la exposición al aire fresco (control) se detallan aquí.

<table><tbody><tr><td>MucilAir-fibroblastos humanos-bronquios</td><td>Epithelix S&aacute; rl, Ginebra, Suiza</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>MucilAir Culture Medium</td><td>Epithelix S&aacute; rl, Ginebra, Suiza</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>VITROCELL</td><td>VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Alemania</td><td>http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=</td><td></td></tr><tr><td>3R4F cigarrillo de referencia</td><td>Universidad de Kentucky</td><td>http://www2.ca.uky.edu/refcig/</td><td></td></tr> <tr><td>30 puertos máquina de fumar carrusel SM2000 Philip</td><td>Morris, Int.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara y software CiliaMetrix</td><td>La Haute &Eacute; cole de Gestion (HESGE), Ginebra, Suiza</td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>Microscopio Leica DMIL&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz LED</td><td>Titan Tool Supplies, Buffalo, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de palillo STX-2</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/</td><td></td></tr> <tr><td>Voltohmímetro epitelial EVOMXTM&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/</td><td></td></tr> <tr><td>Reactivo de detección de luciferina&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento MagNA Lyser&nbsp;</td><td>Roche</td><td>http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66</td><td></td></tr><tr><td>cloroformo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001882</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Bioanalizador Agilent 2100&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GeneChip Alto rendimiento 3' IVT Express Kit</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit</td><td></td></tr><tr><td>Scanner 3000 7G&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación del impacto de la exposición repetida de organotípicos 3d bronquiales y nasales modelos tissue culture whole humo del cigarrillo

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

El humo del cigarrillo (CS) tiene un gran impacto en la biología pulmonar y puede resultar en el desarrollo de enfermedades pulmonares como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o el cáncer de pulmón. Para comprender los mecanismos subyacentes del desarrollo de la enfermedad, sería importante examinar el impacto de la exposición al CS directamente en los tejidos pulmonares. Sin embargo, este enfoque es difícil de implementar en estudios epidemiológicos porque el muestreo de tejido pulmonar es complejo e invasivo. Alternativamente, los modelos de cultivo de tejidos pueden facilitar la evaluación de los impactos de la exposición en el tejido pulmonar. Los cultivos celulares 2D sumergidos, como los cultivos de células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE), se han utilizado tradicionalmente para este propósito. Sin embargo, no pueden exponerse directamente al humo de manera similar a la situación de exposición in vivo. Los modelos de cultivo de tejidos en 3D desarrollados recientemente reflejan mejor la situación in vivo porque se pueden cultivar en la interfaz aire-líquido (ALI). Sus lados basales están inmersos en el medio de cultivo; mientras que sus lados apicales están expuestos al aire. Además, los cultivos de tejidos organotípicos que contienen diferentes tipos de células, representan mejor la fisiología del tejido in vivo. En este trabajo, se demuestra la utilización de un sistema de exposición in vitro para exponer modelos de tejido bronquial y nasal organotípico humano a la corriente principal de CS. Se midió la frecuencia de latidos ciliares y la actividad del citocromo P450s (CYP) 1A1/1B1 para evaluar los impactos funcionales del CS en los tejidos. Además, para examinar las alteraciones inducidas por CS a nivel molecular, se generaron perfiles de expresión génica a partir de los tejidos tras la exposición. Se observó un ligero aumento en la actividad de CYP1A1/1B1 en los tejidos expuestos al CS en comparación con los tejidos expuestos al aire. Un enfoque de biología de sistemas basado en redes y transcriptómica fue lo suficientemente sólido como para demostrar alteraciones del metabolismo xenobiótico inducidas por CS que eran similares a las observadas en las células epiteliales bronquiales y nasales obtenidas de fumadores.

En los resultados se describen a continuación, los tejidos organotípicos fueron células epiteliales humanas primarias aisladas de saludable, no fumar, donantes de raza blanca y se reconstituyeron utilizando fibroblastos 15. Modelos de tejidos nasales bronquial 3D y En bronquial vitro y modelos organotípicos nasales parecerse a nivel celular del epitelio del tracto respiratorio humano (Figura 2). Exposición CS Modelos de tejidos nasales bronquial organotípicos y pueden estar expuestos repetidamente a la corriente principal de CS en la interfase aire-líquido. El procedimiento experimental utilizado para la exposición al humo de los resultados ilustrados aquí se representa en la figura 1. Grabación de movimiento ciliar Los cilios golpiza fue grabado en los tejidos expuestos al aire, como se ilustra en los videos. La exposición CS se asoció con una reducción de la frecuencia de latido ciliar: el pico más fuerte observado alrededor4 Hz en el simulacro expuestas y antes de la exposición no se observa por más tiempo después de la exposición CS (Figura 3). Esta frecuencia reducida haría los cilios latir menos eficiente para eliminar el moco y agentes infecciosos 22. La medición de la TEER y CYP1A1 / actividad 1B1 TEER se midió 48 horas después de la última exposición a garantizar el tejido sigue siendo funcional. CYP1A1 / 1B1 actividad también se midió 48 h después del final de la exposición como se ilustra en la Figura 1. Los valores de TEER en los tejidos expuestos-CS no fueron significativamente diferentes en comparación con los tejidos expuestos al aire, confirmando que no hay ningún efecto citotóxico principal de humo a esta concentración. En la 48 h después de la exposición, CYP1A1 / 1B1 actividad de los tejidos se incrementó ligeramente, lo que indica un aumento modesto del mecanismo de defensa del tejido después de la exposición (Figura 4). Los perfiles de expresión génica y sistemas basados ​​en la red bilogía enfoque para estudiar el impacto de la exposición CS en la alteración del metabolismo de xenobióticos Los tejidos se recogieron a las 48 h puntos de tiempo después de la exposición. Posteriormente, se llevó a cabo el análisis de microarrays para generar perfiles de expresión génica de la CS- y tejidos expuestos al aire. Impacto de la exposición CS sobre el metabolismo de xenobióticos se investigó mediante un enfoque de la biología de sistemas basados ​​en la red que pueda traspasarse de los perfiles de expresión génica y como se informó anteriormente 15. Utilizando un enfoque de biología de sistemas basados ​​en la red muestra que los impactos de exposición CS en el nivel de los nodos de red troncal en el modelo de red de metabolismo de xenobióticos estaban bien correlacionados entre la in vitro y en conjuntos de datos in vivo (Figura 5). En contraste, en el nivel de cada individuo cambios de expresión génica, se observaron correlaciones entre el pobres in vitro (CS expuestos al aire vs. expuesta) e in vivo (fumadores vs. no fumadores). Figura 1. Esquema de procedimiento de la exposición repetida de CS a los modelos de tejidos bronquiales organotypic Abreviaturas:. CYP, citocromo P450; CS, el humo del cigarrillo; TEER, resistencia eléctrica transepitelial. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig2.jpg" /> Figura 2. organotípicos bronquial y modelos de cultivo de tejidos epiteliales nasales. Historieta que ilustra la bronquial (A) y el inserto de cultivo nasal (B) tejido en la interfase aire-líquido. Los modelos in vitro contenían células ciliadas que se muestran en la capa apical de las células teñidas con hematoxilina y eosina (C durante bronquial, nasal para D) como se informó anteriormente 15. Los modelos fueron co-cultivadas con fibroblastos que son importantes<html> para el crecimiento y diferenciación de células epiteliales (indicado por las flechas). La tinción de los marcadores de linaje de las vías respiratorias: p63 (E para bronquial, F para nasal) y Muc5AC (G para bronquial, H para nasal) se muestran como se informó anteriormente 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig3.jpg" /> Figura 3. Los cilios Beating frecuencia. Cilios frecuencia de latidos (CBF) se midió en aire expuesto y en el cultivo antes y después de la exposición. La disminución de la CBF fue visto después de la exposición CS (resultados representativos de dos inserto se muestran como réplica 1 (R1) y se replican 2 (R2)). ad / 52325 / 52325fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Medición de CYP1A1 / actividad CYP1B1 y TEER paneles de izquierda. Indican la actividad CYP1A1 / CYP1B1 en el bronquial (A) y nasal (b) modelos de tejido. Paneles de la derecha indican la medición TEER en el bronquial (C) y nasal (D) los modelos de tejido. Se muestran las medias ± SD. Abreviaturas: CS, el humo del cigarrillo; CYP, el citocromo P450; TEER, resistencia eléctrica transepitelial; RLU, unidad de luminiscencia relativa. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig5.jpg" /> Figura 5. Los sistemas basados ​​en la red enfoque de la biología de la evaluación de impacto de la exposición al CS en el contexto del metabolismo de xenobióticos. Los cambios de los niveles de expresión de los genes se utilizaron para calcular la activación del nodo columna vertebral del modelo de red xenobióticos Metabolismo (A) </<html> strong&gt; como se informó en una publicación previa 15. La figura de la derecha ilustra el concepto de la cuantificación de los nodos troncales, también conocidos como &quot;valor de la red troncal diferencial&quot;, utilizando el enfoque de NPA. Los óvalos azules representan la actividad de los nodos de la red principal (es decir., La capa funcional) y las bolas verdes representan la expresión de genes (es decir., La capa de la transcripción). Impactos de la exposición CS en los tejidos bronquiales organotypic (in vitro, CS-expuestos vs aire expuesto) a las 48 h de post-exposición se compararon con los de fumar en epitelio bronquial humano recogido por broncoscopia y nasal epitelial por burshing cornete inferior (GSE16008 ) (in vivo, los fumadores frente a los no fumadores) (B). Inserciones, correlación de la expresión génica cambios entre la in vitro e in vivo de datos. Abreviaturas: CS, el humo del cigarrillo; NPA, red amplitud perturbación.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El objetivo de este protocolo es exponer modelos organotípicos de tejido bronquial y nasal en 3D humanos al humo de cigarrillo (CS) convencional en la interfaz aire-líquido. A continuación, se investiga el impacto de la CS en los tejidos mediante un ensayo de actividad del citocromo P450, una medición del latido de los cilios y un enfoque de biología de sistemas.

Evaluación del Impacto de la exposición repetida de Organotípicos 3D bronquiales y nasales Modelos Tissue Culture Whole humo del cigarrillo

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el impacto de la exposición repetida de modelos de cultivo de tejido bronquial y nasal organotípico en 3D al humo total del cigarrillo. Esto se logra mediante el cultivo primero de modelos de cultivo organotípico, bronquial y de tejido nasal en la interfaz aire-líquido. El segundo paso es generar aerosol con una máquina de fumar y exponer los cultivos de tejidos según el diseño experimental en un sistema de exposición.A continuación, se evalúa el impacto de la exposición midiendo la frecuencia de batido ciliar y la integridad del tejido del cultivo. El último paso es medir los intercambios de transcriptomas inducidos por el aerosol utilizando la tecnología de microarrays. En última instancia, se utilizaron enfoques de biología de sistemas basados en redes para mostrar el impacto del humo de cigarrillo entero en el cultivo de tejidos.La principal ventaja de estas técnicas de los métodos existentes en toxicología respiratoria es que los enfoques están alineados con los requisitos de las agencias reguladoras para encontrar alternativas a la experimentación con animales, permiten la evaluación de los efectos de la exposición a corto plazo al humo del cigarrillo en células cultivadas en la interfaz ilíquida, imitando las condiciones que ocurren en el tracto respiratorio humano. Para comenzar el experimento, agregue 0,7 mililitros de medio de cultivo precalentado a cada pocillo de una placa estéril de 24 pocillos. A continuación, retire el embalaje de pañuelos y transfiera los insertos de cultivo de tejidos a la placa de 24 pocillos recién preparada.Mantenga el cultivo de tejido en una incubadora y reemplace el medio cada dos días durante el cambio de medio. Examine los tejidos bajo un microscopio óptico para asegurarse de que estén libres de contaminación y de que no haya fugas de medios. Tres días antes de los experimentos de exposición, lavar el lado apical del cultivo de tejidos con 200 microlitros de medios de cultivo.A continuación, precalentar la cámara climática del sistema in vitro y el módulo base de cultivo a 37 grados centígrados. Después de que se caliente, llene el módulo base de cultivo con 17,5 mililitros de medio por fila. Retire los tejidos de la incubadora y transfiera los insertos de cultivo de tejidos de la placa de cultivo al módulo de base de cultivo del sistema de exposición in vitro.A continuación, cubra el módulo de la base de cultivo con una tapa de cristal. Transfiera los pañuelos a la cámara climática para exponerlos al humo del cigarrillo convencional o al humo del cigarrillo. Genere humo de cigarrillo utilizando una máquina de fumar carrusel calibrada de 30 puertos.Fuma los cigarrillos hasta un tamaño estándar pero de aproximadamente 35 milímetros a 55 mililitros. Inhale durante dos segundos, dos veces por minuto y ocho segundos de tiempo de escape de la bomba. El humo del cigarrillo convencional generado se acumula y se libera en el sistema de exposición in vitro.Exponga los pañuelos durante seis a siete minutos. Después de transferir los tejidos a una placa de cultivo, vuelva a colocarlos en la incubadora durante una hora. Retire las placas de cultivo de tejidos de la incubadora y déjelas debajo del capó a temperatura ambiente durante 30 minutos para estabilizar el batido de CLIA.Después de la estabilización, observe los tejidos bajo un microscopio óptico conectado al software cliometrics. A continuación, registre la frecuencia de los latidos ciliares, midiendo la frecuencia cada tres segundos durante un minuto y 48 horas. Después de la exposición, agregue 200 microlitros de medio de cultivo al lado apical de los tejidos epiteliales bronquiales humanos y mida la resistencia del tejido insertando un electrodo de palillo en el medio basal y en el medio recién agregado en el lado apical del cultivo de tejido sin tocar el tejido.Después de las mediciones, retire suavemente los medios del lado apical de los cultivos de tejidos con una pipeta de pasta conectada a una bomba de vacío y devuelva los tejidos a la incubadora. Para medir la actividad enzimática del citocromo P 4 50, prepare una nueva placa con sustrato de Lucifer y CEE previamente preparado y transfiera los insertos a esa cubierta de placa e incube los insertos de tejido durante la noche. Después de la incubación, transfiera 50 microlitros de medio de cultivo de cada tejido a una placa luminométrica blanca opaca de 96 pocillos a temperatura ambiente.Luego agregue 50 microlitros de reactivo de detección Lucifer a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos. Una vez finalizada la incubación, mida la luminiscencia con el luminómetro. Recoja la placa de insertos de tejido organotípico 3D de la incubadora y lave cada inserto de la placa tres veces con PBS frío y aspire el PBS con una pipeta pasada entre lavados.Después del último lavado, aspire el PBS y cubra la placa para evitar que el inserto se seque. A continuación, corte la membrana del inserto para cada inserto de la placa hasta que la membrana quede plana sobre la hoja. Transfiera el tejido de la cuchilla al tubo homogeneizador y enrosque la tapa en el tubo.Luego agítalo, haz un vórtice y colócalo sobre hielo seco. Descongele y muela las muestras con el instrumento homogeneizador a 6.000 rpm durante 45 segundos. Dejar actuar durante cinco minutos a temperatura ambiente y luego añadir 140 microlitros de cloroformo a la muestra y volver a vortexar durante 15 segundos.Transfiera toda la muestra del tubo de homogeneización a un tubo de bloqueo de fase. Colócalo en un termo agitador y agítalo durante dos minutos a 1400 RPM a temperatura ambiente. A continuación, dejar actuar durante dos minutos a temperatura ambiente.Una vez finalizado el agitado, gire el tubo durante 15 minutos a cuatro grados centígrados a 12.000 G. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros. Siga con el lavado, la suspensión y la purificación de la precipitación de ARN. Una vez extraídos, los ARN se someten a un control de calidad.Para evaluar la cantidad y la integridad, prepare el sistema de manejo de líquidos y la síntesis objetivo. Coloque el ARN extraído. Las placas y todos los reactivos necesarios y los desgastes de laboratorio en el robot.Las primeras concentraciones de ARN se normalizarán. A continuación, se cambiará la plataforma para los siguientes pasos, desde la amplificación hasta el etiquetado, la purificación y la fragmentación. A continuación, la mezcla de hibridación se añade a 33 microlitros de ARN A fragmentado y marcado, se desnaturalizan las muestras y se humedece previamente la matriz con 200 microlitros de prehibridación.Mezcla del kit de lavado y tinción de hibridación. Luego coloque el chip en el horno de hibridación configurado a 45 grados centígrados y 60 RPM durante 10 minutos. Retire el tampón de prehibridación y cargue 200 microlitros de la muestra.Incubar el array durante 16 horas a 45 grados centígrados y 60 RPM en el horno. Aspire el cóctel del chip y llene el microarray con 250 microlitros de tampón de lavado a. Abra el software y ejecute fluidics desde la barra de menú del software.Seleccione el módulo de interés y el programa prime four 50 para cada módulo. Asigne el chip correcto a cada módulo escaneando el código de barras del chip y coloque los chips en el sistema de fluidos. Por último, asegúrese de que el escáner esté caliente.A continuación, cargue el chip en el cargador automático del escáner y escanee el microarray. Se midió la frecuencia de latidos de CELIA o CBF del tejido nasal antes y después de la exposición al aire o al humo del cigarrillo o cs. El CBF y el tejido nasal fueron más lentos después de la exposición al cs.Una frecuencia de batido más baja del CLIA reduce la eficiencia para eliminar la mucosidad y los agentes infecciosos. Se realizaron análisis de microarrays para estudiar los impactos de la exposición a CS en modelos organotípicos, bronquiales y de tejido nasal. 48 horas después de la exposición.Este impacto del SC in vitro se comparó con el impacto del tabaquismo en el tejido epitelial bronquial humano recolectado por broncoscopia y cepillado epitelial nasal, respectivamente. La biología de sistemas basada en redes muestra una correlación positiva entre los nodos troncales de los conjuntos de datos in vivo e in vitro. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se trata de un área de investigación en desarrollo reciente.Hay dos componentes clave, por un lado, una plataforma de exposición a aerosoles bien caracterizada y, por otro lado, un sistema experimental relevante que puede consistir en un modelo de cultivo de tejidos tridimensional que imite mejor la arquitectura específica, las señales bioquímicas y mecánicas, así como la interacción de la célula con el microambiente relevante para el tejido o el órgano diana. En investigación.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

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Evaluación del Impacto de la exposición repetida de Organotípicos 3D bronquiales y nasales Modelos Tissue Culture Whole humo del cigarrillo (Video) | JoVE Journal

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