Humano madre pluripotentes células Basado Toxicidad para el desarrollo de ensayos de la seguridad química Detección y biología de sistemas de generación de datos

El objetivo general de este procedimiento es describir dos sistemas de ensayos de toxicidad para el desarrollo in vitro basados en células madre embrionarias humanas y estudios de transcriptoma. Esto se logra cultivando primero células madre embrionarias humanas en fibroblastos embrionarios de ratón. El segundo paso es dejar que las células madre embrionarias humanas formen cuerpos Embry en los que puedan generar células de las tres capas germinales o diferenciarlas en progenitores neuroectodérmicos.

A continuación, los cuerpos embrionarios o progenitores neuroectodérmicos se tratan con compuestos de interés a diferentes concentraciones durante la diferenciación. Los pasos finales son evaluar la viabilidad de las células y aislar el ARN. En última instancia, el análisis de microarrays de transcriptoma se utiliza para mostrar los cambios en la expresión de ARN de las células tratadas con un compuesto de interés en comparación con las células de control no tratadas. Sobre la base de células madre neonicoides humanas y macroáreas de ADN, hemos establecido una metodología in vitro que permite el seguimiento de los efectos de toxicidad relevantes para el desarrollo humano.

La metodología puede ser aplicada por la industria farmacéutica y química para la detección de seguridad de posibles medicamentos y tóxicos ambientales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la toxicidad del desarrollo, como el efecto de los productos químicos en el desarrollo neurológico muy temprano. Para comenzar, descongele el suplemento de medio de células madre a temperatura ambiente y agregue 100 mililitros en 400 mililitros del medio de células madre basales.

A continuación, descongele la matriz de la membrana basal en hielo y luego agregue el volumen suplementado de la matriz a 24 mililitros de dmm refrigerado. F 12 medio basal según lo recomendado por el fabricante, mezcle una solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, y luego agregue dos mililitros de la mezcla en 12 placas separadas de seis centímetros. Incubar las placas a temperatura ambiente durante una hora mientras la matriz recubre las placas.

Luego retire el medio y agregue dos mililitros de medio de células madre. A continuación, retire cuatro placas confluentes de la incubadora que contienen embriones humanos. H Nueve células cultivadas en capas de alimentación de fibroblastos embrionarios de ratón que se preparan como se describe en el protocolo de texto adjunto bajo un estereoscopio, utilizan una punta de pipeta de un mililitro y eliminan las colonias diferenciadas de la placa.

Las colonias indiferenciadas tienen bordes bien definidos y las células son compactas, mientras que las células diferenciadas comienzan a propagarse desde los bordes y sus células son de mayor tamaño. Aspirar el medio y lavar las células con cuatro mililitros de PBS. A continuación, añade dos mililitros de medio de células madre con los ocho de un estereoscopio.

Corta las colonias en seis a nueve pedazos cada uno con una aguja de calibre 26 y raspa los grumos con puntas de pipeta de un mililitro. Recoja suavemente las colonias cortadas en un tubo de halcón de 50 mililitros y péguelas a 200 G durante cinco minutos. A continuación, aspire el snat y vuelva a suspender las células en 12 mililitros de medio de células madre.

Coloque 20 microlitros de la suspensión celular en un portaobjetos de vidrio y cuente el número de grumos bajo el microscopio. Ajuste una concentración de la suspensión a 150 grumos por mililitro y luego agregue dos mililitros de la suspensión en cada placa de seis centímetros. Mueva las placas hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir las células de manera uniforme, y luego incube las placas en una incubadora de cultivo celular cada dos días.

Cambie con cuidado el medio Después de eliminar las colonias diferenciadas, agregue 40 microlitros de una solución estéril de copolímero en bloque al 5% a cada pocillo de una placa de 96 pocillos Vbo y déjela incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Retire de la incubadora una placa confluente que contenga colonias y seleccione las colonias diferenciadas bajo un microscopio estereoscópico con una punta de pipeta de un mililitro. A continuación, aspire el medio de la placa y lave suavemente las células con cuatro mililitros de PBS.

A continuación, agregue dos mililitros de medio de diferenciación aleatoria a cada plato. Utilice la herramienta de paso para cortar las colonias de nueve celdas H en grupos de tamaño uniforme. Raspe los grumos con un raspador de células y recójalos suavemente en una centrífuga de tubo de halcón de 50 mililitros.

La colonia se agrupa a 200 g durante cinco minutos y luego aspira el snat y resuspende la célula y el medio de diferenciación aleatoria a 1000 grumos por mililitro. A continuación, aspire el copolímero en bloque de la placa de 96 pocillos inferior en V Con la ayuda de una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de la suspensión de colonias a cada pocillo, agregue los grumos al fondo de los pocillos en forma de V centrifugando la placa a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos a 400 G. Luego coloque una placa en la incubadora durante cuatro días usando puntas de 200 microlitros de diámetro más ancho. Retire los cuerpos embrionarios de la placa de 96 pocillos y colóquelos en una placa cuadrada estéril de 122 milímetros.

A continuación, utilice una pipeta serológica estéril de 10 mililitros para transferir los cuerpos embrionarios de la placa cuadrada a un tubo de halcón de 15 mililitros. Deje que los cuerpos embrionarios se asienten durante dos minutos y luego aspire el snat y lave los cuerpos embrionarios con cinco mililitros de PBS. Nuevamente, espere a que los cuerpos embrionarios se asienten durante dos minutos y luego aspire el sobrenadante.

Esta vez se resuspenden los cuerpos embrionarios en cinco mililitros de medio de diferenciación aleatoria. A continuación, transfiera los cuerpos embrionarios a una placa bacteriológica de 10 centímetros y agregue 10 mililitros adicionales de diferenciación aleatoria. Medio. Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5%CO2 en un agitador horizontal.

A 50 RPM, se muestran los cuerpos embrionarios representativos para el día cinco, el día nueve y el día 14. Cambie cuidadosamente el medio cada dos días, reemplazando los 15 mililitros con una diferenciación aleatoria fresca. Medio. Para evaluar el efecto de un fármaco en la diferenciación, se debe comenzar a añadir el fármaco al medio en el quinto día durante 10 días, tal y como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Con una pipeta estéril, recoja los cuerpos embrionarios de las placas de 10 centímetros en un tubo de halcón de 15 mililitros. Deje que se asienten durante dos minutos, luego aspire el sobrenadante. Lávelos con cinco mililitros de PBS y transfiéralos a un tubo de 1,5 mililitros sin nucleasa.

Permita que se asienten y aspiren la subida de caja. Suspenda los cuerpos embrionarios en un mililitro de reactivo de triol y pase una solución a través de una aguja de calibre 24 con una jeringa de un mililitro aproximadamente 15 veces para interrumpir las células. A continuación, añada 200 microlitros de cloroformo a cada muestra.

Agite brevemente el contenido y luego centrifugue las muestras a 12.000 g durante 15 minutos A cuatro grados centígrados, recoja el sobrenadante en tubos de 1,5 mililitros sin alterar ninguna de las otras capas. A continuación, añada un volumen igual de etanol frío al 70% al sobrenadante y mezcle suavemente el contenido agitándolo. Transfiera 700 microlitros de la mezcla a una mini columna de centrifugación y siga las instrucciones del fabricante para purificar el ARN en el paso final de elución.

Aplique 22 microlitros de agua libre de nucleasas a la columna de centrifugación y centrifugue los tubos a 12.000 G durante un minuto. A continuación, retire el tubo de recogida y ponga el ARN en hielo. Agregue un mililitro de espacio de disco precalentado por matraz T 25 confluente de H nueve celdas, e incube el matraz durante nueve minutos a 37 grados Celsius.

A continuación, añade dos mililitros de precalentamiento. Lave el medio hasta las células tratadas desplazadas y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces con una pipeta de cinco mililitros. Transfiera la solución celular a un tubo de halcón.

A continuación, lave el matraz con nueve mililitros de medio de lavado y añádalo al tubo con las celdas. PT la cosecha de sus células durante tres minutos y medio a 500 G. Luego retira el snat y vuelve a suspender las células en 10 mililitros de medio de lavado. PT las células de nuevo durante tres minutos y medio a 500 g y luego retire el supnatante y vuelva a suspender las células en cuatro mililitros de medio de células madre embrionarias humanas, agregue 0,5 mililitros de la suspensión celular y 4,5 mililitros de medio fresco en un matraz T 25 lavado con PBS fresco que contenga fibroblastos embrionarios de ratón mitóticamente inactivados.

Cambie el medio en el matraz todos los días. Cubrir un plato de 10 centímetros con gelatina al 0,1% en PBS e incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, recoja una célula madre embrionaria humana retirando el medio y añada un mililitro de acuta al matraz T 25 mientras las células se desprenden.

Agregue 6.6 mililitros de medio frío a 330 microlitros de matriz de membrana basal congelada. Filtre la solución a través de un filtro de celdas de 40 micrómetros y use un mililitro de la solución filtrada para cubrir cada pocillo de una placa de seis pocillos. Las células se colocarán posteriormente en las placas recubiertas después de la incubación de 30 minutos de las células embrionarias humanas con Accutane, detenga la reacción añadiendo 1,5 mililitros de medio Hess.

Raspe las células del matraz y luego agregue ocho mililitros adicionales de medio Hess. Produzca una solución de una sola célula pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 10 mililitros celdas de filtro a través de un filtro de celdas de 40 micrómetros, y luego centrifugar las celdas durante tres minutos A 500 G, retire el sobrenadante S y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de células de espín medio nuevamente durante tres minutos a 500 G. Luego retire el sobrenadante y reutilice. Suspender las células en 10 mililitros de medio Hess S que contenga inhibidor de rocas Y 2 7 6 3 2 a una concentración final de 10 micromolares.

A continuación, retire el sobrenadante de la placa del plato recubierto de gelatina, la suspensión celular en el plato recubierto de gelatina e incube durante exactamente una hora a 37 grados centígrados. Durante estos pasos, el hipoplasto se depositará en las placas recubiertas de gelatina donde las células madre embrionarias humanas permanecerán libres. El tiempo de flotación es crucial, ya que la incubación prolongada dará lugar a la aglomeración de las células madre y la incubación corta solo eliminará algunos de estos fibroblastos cuando los fibroblastos se hayan adherido.

Use el medio en la placa para lavar suavemente las células madre no adherentes de la placa. Lave la placa por segunda vez con 10 mililitros de medio Hess y agrupe las células, centrifugue las células durante tres minutos a 500 G, retire el sobrenadante S resultante y vuelva a suspender las células en aproximadamente cuatro mililitros de medio acondicionado que contenga 10 micromolares de inhibidor de roca Y 2, 7, 6, 3, 2 y 10 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblasto dos. A continuación, mezcle las células con azul de trian y cuéntelas en una placa de hemocitómetro.

18.000 células por centímetro cuadrado en la placa antes del sótano. Las placas recubiertas de membrana cubren las células con 1,5 mililitros de medio por pocillo e incuban a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, refresque el medio Después de 24 horas más, cambie el medio a medio acondicionado fresco suplementado con solo 10 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos 2 72 horas.

Después de sembrar las células, cambie el medio a un medio de reemplazo de suero knockout. Este punto de tiempo se conoce como día cero de diferenciación. Refresque las células con medio fresco todos los días durante los próximos tres días.

Al cambiar el medio en el cuarto y quinto día, agregue un 25% de N con dos medios suplementados y un 75% de reemplazo de suero knockout. Medio al sexto día cosechar las células para su análisis. Los cuerpos embrionarios se pueden utilizar para muchos estudios diferentes.

Aquí hay un ejemplo de estudio de citotoxicidad que muestra el efecto de diferentes concentraciones de metilmercurio en la viabilidad de las células. A partir de este gráfico, se determinó que el punto 24 del micromolar causó el 10% de la muerte celular y una concentración de 1,61 micromolar causó el 50% de la muerte celular después de la exposición durante 14 días. Los ARN aislados de los cuerpos embrionarios de tres grupos de tratamiento con metilmercurio se ejecutaron en una micromatriz para observar una amplia variedad de biomarcadores.

Los expuestos al mercurio micromolar del punto 25 se muestran en rojo. Los expuestos a un micromolar de metilmercurio se muestran en azul, y el ARN de control se muestra en verde. Este mapa de análisis de componentes principales muestra que las características genéticas de cada grupo de tratamiento varían significativamente del otro: en total, más de 276 genes se modificaron más del doble cuando se expusieron a una concentración micromolar de metilmercurio.

30 de esos genes también fueron modificados por el grupo de menor concentración en el punto 25 del micromolar. En este mapa de calor, se puede ver que 233 de los genes modificados en el grupo de tratamiento de un micromolar eran genes que estaban regulados a la baja y solo 43 estaban regulados al alza por el tratamiento. No olvide que trabajar con triazol u hormigas de desarrollo puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tener en cuenta precauciones como el uso de gafas antitabique, guantes de mano resistentes a productos químicos y realizar todo el trabajo relacionado con el triol en la campana extractora al realizar este procedimiento.

Siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como la tinción, la formación de feros, que pueden mezclar la formación de tubos, para responder a preguntas adicionales como el anclaje fenotípico.