Name: Todo un enfoque bioinformador celular para evaluar Transporte y Biodisponibilidad de los Contaminantes Orgánicos en Sistemas no saturadas de agua (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Aprende a evaluar la biodisponibilidad de contaminantes orgánicos mediante un ensayo bioreportero celular con Burkholderia sartisoli. Este método permite monitorear en tiempo real la influencia de redes miceliales en la degradación de fluoreno en sistemas no saturados.

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Se reconoce la financiación de la Fundación Alemana para el Medio Ambiente (DBU). Los autores agradecen a Ute Kuhlicke por su ayuda técnica con el análisis CLSM y a Birgit Würz, Rita Remer y Jana Reichenbach por su hábil ayuda experimental. Los autores desean agradecer especialmente al Prof. Jan Roelof van der Meer y al Dr. Robin Tecon por su fructífera discusión y por proporcionar la cepa bioreportera. Contribuye al programa de investigación "Productos químicos en el medio ambiente" (CITE) de la Asociación Helmholtz.

1. Preparación de platos, Diapositivas y Cámaras de incubación <ol><li> Prepare el siguiente material para cada microcosmos: un gran plástico Petri fondo del plato (d = 10 cm), uno modificado (véase el paso 1.2) pequeño plástico Petri fondo del plato (d = 5 cm) con tapas y una diapositiva cámara de recuento con tres cavidades. </li><li> Tome el número deseado de Petri partes inferiores plato (d = 5 cm). Quitar parte del borde con una sierra para encajar exactamente una diapositiva (26 mm de longitud de borde). Para esterilizar el sistema, tomar fondos plato de Petri y tapas en 70% de etanol O / N y secarlos durante al menos 2 horas en una cabina de flujo bajo luz UV. Almacene las cajas de Petri en un recipiente de plástico cerrado herméticamente, que también había sido expuesto a la luz UV durante 2 h. </li><li> Limpie el número deseado de diapositivas con etanol al 70% y aire secarlos. Envuelva diapositivas en papel de aluminio y los puso en un horno de mufla durante 5 horas a 450 ° C para eliminar posibles contaminaciones. </li&gt; <li> Preparar cámaras de incubación de vidrio con tapas. Limpie con un 70% de etanol y exponer cámaras abiertas a la luz UV durante al menos 2 horas en una cabina de flujo. NOTA: desecadores grandes (diámetro de alrededor de 30 cm) con tapas se puede utilizar para este propósito; cada desecador puede albergar hasta diez configuraciones de microcosmos. </li></ol> 2. Preparación de los medios de comunicación y Culturas <ol><li> Para ejecutar 20 microcosmos paralelas, obtener 100 ml de medio de triptona-levadura modificada (MTY) 14, aproximadamente 150 ml de medio mínimo 21C 16 (mm), 5 ml de agar mínimo medio (MMA; 0,5%, w / v), tres placas de agar de dextrosa de patata (PDA; 1,5%, w / v) para P. ultimum, cuatro placas en blanco, una placa de PDA que contiene 2 mg L -1 cicloheximida, cuatro placas de agarosa (3%, w / v) que contiene 0,3 g ml -1 carbón activado y 40 mg de la gripe en 2 porciones mg. </li><li> Prepare MTY contiene 50 mg L -1 de kanamicina (kanamicina se requiered para mantener la eGFP plásmido reportero) y MM que contiene acetato 10 mM para el cultivo bacteriano. Utilice MM sin ​​etilo para preparar 0,5% de MMA para la inmovilización de las bacterias en el microcosmos y verter en las placas (cada uno 20 ml) de 1,5% para el cultivo de PDA Pythium ultimum y microcosmos configuraciones. </li><li> Inocular algunas hifas de P. ultimum en tres placas de PDA frescas e incubar en la oscuridad a 25 ° C durante aproximadamente 72 horas. A continuación, asegúrese de que las placas están cubiertas completamente por el micelio fresca y esponjosa. </li><li> Iniciar dos culturas de B. sartisoli RP037-MCHE en 50 ml de Mty desde una acción de glicerol. Se incuba a 30 ° C con 230 rpm movimiento frasco rotativo O / N. </li><li> Medida de la densidad de cultivo óptica (DO) a 578 nm y se centrifuga a 1000 xg durante 10 min (para B. sartisoli RP037-MCHE, la OD espera 578 es de aproximadamente 1,0 y las células están en fase exponencial). Desechar el sobrenadante y volver a suspender las célulasen una cantidad apropiada de MM para llegar a un OD 578 de 0,4. Inocular 20 ml de MM que contienen 50 mg L -1 kanamicina con 400 l de las células resuspendidas. Se incuba a 30 ° C con 230 rpm movimiento frasco rotativo O / N. </li><li> Mida OD 578 de la cultura en la MM (por B. sartisoli RP037-MCHE, el OD esperado 578 es aproximadamente 0,2 y las células se encuentran en la fase exponencial). Cultura Centrifugar a 2000 xg durante 10 min y volver a suspender las células en una cantidad apropiada de MM para alcanzar una DO de 0,4. Mezclar 50 l de la suspensión celular con 500 l de MMA caliente, líquido en tubos de 2 ml y se almacena a 50 ° C hasta su uso. Utilice 150 l de células en las MMA para cada microcosmos. </li><li> Verter en las placas de gel de agarosa que contiene carbón activado. Derretir de agarosa (3%; w / v) en agua bidestilada. Mezclar bien con carbón activado (0,3 g ml -1) y vierta la mezcla en placas Petri de plástico(D = 10 cm). </li></ol> 3. Microcosmos montaje NOTA:. La configuración completa microcosmos se representa esquemáticamente en la Figura 1 Por favor refiérase a la Figura 1 para todos los siguientes pasos individuales. Los pasos siguientes se describen la preparación de una muestra (SAM) con los vectores de transporte de micelio y tres configuraciones diferentes de control (Con Air, NEG CON, POS CON). Un resumen de todas las diferentes configuraciones se puede encontrar en la Tabla 1. <ol><li> Tome número deseado de placas de Petri y toboganes y exponerlas a la luz UV bajo una campana de flujo durante 30 minutos. </li><li> Coloque la pequeña placa de Petri en el interior de la grande y colocar la diapositiva a través del hueco de la pequeña placa de Petri. Tomar una muestra de la suspensión de células caliente en MMA y añadir 150 l en la cavidad medio de una diapositiva. Repita este paso hasta que las cavidades medias de todas las diapositivas sonlleno de MMA. Espere 5 min para el MMA se solidifique. </li><li> Use un perforador de corcho 1 cm para perforar parches circulares de una placa de PDA en blanco. Coloque un parche a una distancia de 2 mm al lado de la MMA dentro de la pequeña placa de Petri. Añadir este para promover el crecimiento del micelio en la configuración (PDA 3 en la Figura 1). </li><li> Cortar parches PDA curvas como barreras mecánicas. Use una pequeña placa de Petri parte inferior limpia y estéril y presiónelo en una placa de PDA. Utilice una espátula para cortar otro anillo más pequeño a una distancia de 0,5 cm en el agar que resulta en un anillo PDA. <ol><li> Corte un pedazo, que encaja exactamente en el hueco de la pequeña placa de Petri en la configuración de microcosmos y colocarlo dentro de la brecha en la parte superior de la diapositiva. Asegúrese de que la distancia entre el MMA y la barrera PDA circular es de aproximadamente 2 mm. Cierre la tapa de la pequeña placa de Petri presionando suavemente en la barrera PDA. </li><li> Repita los pasos 3.4 y 3.4.1 con una placa de PDA que contiene 2 g L -1de cicloheximida. NOTA: Esta es la configuración de controles para el transporte aéreo (CON AIRE) hacia las células bioinformador, ya que los micelios son inhibidas por la cicloheximida y no crecen en exceso MMA. </li></ol></li><li> Use un perforador de corcho 1 cm para perforar parches circulares de una placa PDA en blanco. Utilice otro perforador de corcho 0,5 cm para cortar el centro de la primera parche. Coloque el pequeño anillo PDA resultante a una distancia de 1 mm junto a la barrera de PDA (PDA 1 en la Figura 1). </li><li> Añadir 2 mg de FLU en el agujero de PDA 1. Use un sacabocados 1 cm para cortar los parches circulares de placas PDA cubiertos de P. ultimum y coloque un parche (PDA 2 en la Figura 1) inferior hacia abajo sobre el anillo de PDA de manera que la esterilla micelial se enfrenta a los cristales de la gripe. <ol><li> Repita el paso anterior sin añadir cristales gripe. NOTA: Esta es la configuración de control negativo (CON NEG) para determinar el fondofluorescencia de las células bioinformador. </li></ol></li><li> Use un perforador de corcho 1 cm para perforar parches circulares del agar que contiene carbón activado. Coloque cuatro parches en cada configuración microcosmos para disminuir aún más la concentración GRIPE gaseoso (Figura 1). </li><li> Preparar un control positivo (POS CON). Añadir algunos cristales gripe a 200 l de suspensión celular MMA y lo puso en una cavidad de una diapositiva vacía. </li><li> Colocar una placa de Petri (d = 10 cm) con un poco de polvo de carbón activado en la parte inferior de la cámara de incubación para minimizar la concentración de FLU gaseoso en la cámara. También, coloque cuatro y cincuenta y seis minutos 50 ml vasos con agua estéril en la parte inferior para mantener una alta humedad en la cámara. <ol><li> Traslado configuraciones de microcosmos en cámaras de incubación e incubar a 25 ° C durante 96 horas. Colocar las muestras al azar en las diferentes cámaras de crecimiento para excluir los efectos de localización. NOTA: Esta vez ap incubacióntelas al oomiceto P. ultimum. Podría ser diferente para otros organismos. </li></ol></li></ol> 4. escaneo láser confocal Microscopía <ol><li> Ideal es utilizar una configuración MBRC con microscopio vertical. NOTA: Puede ir equipada con láseres convencionales ofrenda por ejemplo, 488, 561 y 633 líneas nm para la excitación o con una fuente láser sintonizable blanco. </li><li> Utilice los siguientes parámetros para la colección de imágenes: Excitación: 490 nm (EGFP) y 585 nm (mCherry) en la intensidad del láser adecuado (excitación simultánea); rangos de emisión: 500 hasta 550 nm (eGFP) y 605-650 nm (mCherry); lente objetivo: 63X NA 0.9 sumergible de agua (debido a su distancia de trabajo); tamaño de paso para z-pilas: 0,5 micras. </li><li> Microcosmos configuración abierta y utilizar un bisturí para extraer PDA 1, 2, 3 y la barrera PDA. Ponga una hoja de cubierta de vidrio en la parte superior de la MMA y presione suavemente para eliminar las burbujas de aire. Montaje de diapositivas sobre platina del microscopio. Añadir una gota de agua en la parte superior de le hoja de la cubierta y utilizar la configuración mCherry para encontrar células bioinformador en la muestra. </li><li> Obtener una visión general rápida de la muestra y optimizar la relación señal-ruido usando un resplandor sobre-bajo tabla de consulta para el rojo (mCherry) y verde (EGFP) canal. Elija una posición aleatoria en la muestra a analizar la fluorescencia bioinformador. NOTA: las hifas puede mostrar autofluorescencia en el rango de emisión bioinformador (por ejemplo, autofluorescencia verde) 17. Asegúrese de seleccionar áreas sin hifas si este es el caso. </li><li> Definir y registrar z-pilas para cada posición en el verde (EGFP) y el (mCherry) canal rojo. Evitar el blanqueo de la muestra por una larga exposición a la luz de epifluorescencia o luz láser. <ol><li> Repita el paso anterior para diez posiciones aleatorias, distribuidas de manera uniforme. </li></ol></li><li> Repita todos los pasos que utilizan los mismos ajustes para todas las muestras de la pista de pruebas (SAM), aire acondicionado, NEG CON y POS CON. </li></ol&gt; Análisis 5. Imagen NOTA: Analizar rojo (mCherry) y verde (EGFP) fluorescencia en los z-pilas grabados, entre otras opciones la ImageJ software libre 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) puede ser utilizado. <ol><li> Asegúrese de instalar el plugin logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/). </li><li> Abrir el archivo en ImageJ. Seleccione &quot;Los canales divididos&quot; y cerca del canal verde. Utilice la macro &#39;mCherry zona »prevista como archivo de código adicional para cuantificar el área de fluorescencia roja en z-stack. Ajustar la configuración preferida en la macro (indicado en negrita). <ol><li> La salida es una tabla con los píxeles medidos por encima del umbral (y por encima del mínimo definido) en pila z. NOTA: La suma de todos los valores es el número total de píxeles rojos (área) en la pila. </li></ol></li><li> Abrir el archivo en ImageJ. Seleccione &quot;Los canales divididos&quot; y cerca del canal rojo. Utilice la macro<html> 216; eGFP int &#39;proporciona como archivo de código adicional para cuantificar la intensidad de la fluorescencia verde en la pila z. Ajustar la configuración preferida en la macro (indicado en negrita). <ol><li> La salida es una tabla con las intensidades medias y el área de todos los objetos de color verde por encima del umbral (y por encima del mínimo definido) en z-stack. Para calcular la intensidad total de píxeles verdes en la pila, se multiplican cada intensidad media por el área correspondiente. </li></ol></li><li> Calcular la inducción eGFP relativa (eGFP rel): <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/52334/52334eq1.jpg" width="300px" /> (1) NOTA: Como mCherry se expresa constitutivamente, el valor resultante de eGFP rel es una medida relativa de la cantidad de eGFP expresado por una cierta cantidad de células. Por favor, consulte también la Tabla 3 para obtener más información sobre el cálculo de eGFP rel. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. La cuantificación química NOTA: microcosmos configuraciones también se pueden usar para llevar a cabo la cuantificación química de cantidades GRIPE translocados con o sin un disipador de contaminante abiótico. <ol><li> Envuelva 15 mL viales de vidrio, 1 ml de GC / MS viales e insertos en papel de aluminio. Rellene evaporación platos con Na 2 SO 4; colocar todo en horno de mufla durante 5 horas a 450 ° C para eliminar posibles contaminaciones. Guarde el Na 2 SO 4 en el interior de un desecador activado. </li><li> Cortar fibras de vidrio recubierto de PDMS en 0,5 cm de longitud. Lávese las fibras agitando cuatro veces 2 horas en metanol fresco. Repetir el lavado pasos otros cuatro veces con agua ultrapura y almacenar fibras limpias en agua ultrapura en un vial de vidrio sellado. </li><li> Preparar 1,5 L de tolueno / acetona (3: 1, v / v) que contiene 10 g L -1 fenantreno-d 10. </li><li> Realice los pasos 1, 2 y 3 del protocolo. Preparar microcosmos sin bioreporter células para estudiar el transporte GRIPE (SAM (-) y CON AIRE (-)) y con células bioinformador (SAM) para verificar la degradación GRIPE. <ol><li> Opcional (sin células bioinformador): Coloque tres PDMS revestidas fibras de vidrio (generalmente utilizados para experimentos SPME) como disipador contaminante artificial y cuantificables dentro de MMA de SAM (-) utilizando unas pinzas finas. </li><li> Eliminar las fibras de vidrio utilizando unas pinzas finas y poner cada uno en un GC / MS vial con parte. </li><li> Añadir 200 l de tolueno y agitar verticalmente O / N y analizar a través de GC / MS. Utilice los ajustes previstos en la Tabla 2. </li></ol></li><li> Traslado de MMA de la cavidad central en un vial de vidrio de 15 ml y añadir unos tres espátulas de Na 2 SO 4. Mezcle bien con una espátula y añadir 10 ml de disolvente. Vortex la mezcla y agitar horizontalmente O / N en la oscuridad. <ol><li> Transferencia 1001; l de muestra en GC / MS vial con parte. Añadir 10 l de acenaftileno-d 08 (10 mg L -1) y analizar a través de GC / MS usando el mismo programa como se describe en 6.4.3. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero contrapuesto.

La configuración microcosmos presentado resultó adecuado para estudiar la biodisponibilidad de los productos químicos separados espacialmente para degradar los organismos después de la captación y el transporte por micelios. Se evita el transporte en fase gaseosa potencial de los compuestos volátiles y parcialmente células bacterianas bioinformador puede visualizarse sin preparación de la muestra elaborada y por lo tanto con una perturbación mínima del sistema sensible. Al mismo tiempo, el análisis químico de la muestra...

El suelo está densamente poblada por una amplia gama de microorganismos tales como bacterias 1,2. Sin embargo, las condiciones en este hábitat son un reto, especialmente en términos de la disponibilidad de agua 3. Las bacterias de forma permanente deben buscar condiciones óptimas en entornos heterogéneos 4, pero la ausencia de películas de agua continuos está dando lugar a una movilidad restringida 5 obstaculizar a difundir libremente. Además, las tasas de difusión de solutos (por ejemplo, nutrientes) se reducen en condiciones no saturadas 6. De este modo, las bacterias y los nutrientes son a menudo separados físicamente y accesibilidad de nutrientes se limita 3. Como consecuencia de ello, un vector de transporte para compuestos químicos que no requiere una fase continua de agua podría ayudar a superar estas limitaciones. De hecho, muchos microorganismos como hongos y oomicetos han desarrollado una forma de crecimiento filamentoso que les permite crecer a través de los espacios de poros llenos de aire alcanzar y mobi con ellolizing nutrientes 7 y 8 carbonosos sustancias también separa física a través de largas distancias. Incluso pueden actuar como vectores biológicos de transporte que entregan los azúcares y otras fuentes de energía a las bacterias 9. La captación y el transporte en los organismos de micelio también se ha demostrado que los contaminantes orgánicos hidrofóbicos, como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en Pythium ultimum 10 o en hongos micorrícicos arbusculares 11. Desde HAP son contaminantes solubles en agua en todas partes y mal 12 en el suelo, el transporte micelios mediada podría ayudar a aumentar la biodisponibilidad del contaminante para potenciales degradadores bacterianas. Considerando que el importe total de transporte de contaminantes se puede cuantificar directamente por medios químicos 10, la biodisponibilidad de los contaminantes transportados por el micelio de bacterias que degradan y otros organismos no puede evaluarse fácilmente. El siguiente protocolo presenta un método para evaluar el impacto de mycelia sobre la biodisponibilidad de contaminantes a degradadores bacterianas en forma directa; que permite la recopilación de información sobre el impacto espacio-temporal de los contaminantes sobre los ecosistemas microbianos. Se describe cómo configurar un elaborado sistema microcosmos insaturado imitando interfases aire-agua en el suelo mediante la vinculación de una fuente puntual PAH separados físicamente con bacterias bioinformador-PAH degradantes a través de vectores de transporte de micelio. Dado que el transporte aéreo se excluye el efecto de transporte basados ​​micelio en HAP biodisponibilidad para las bacterias pueden ser estudiados de forma aislada. En más detalle, se aplicaron tres anillos PAH fluoreno, el organismo del micelio Pythium ultimum y la bacteria Burkholderia bioinformador sartisoli RP037-MCHE 13 en las configuraciones de microcosmos descritos. La bacteria B. sartisoli RP037-MCHE fue construido originalmente para estudiar los flujos de fenantreno a la célula 14 y expresa proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) como resultado del flujo de PAHla célula, mientras que la fluorescencia roja mCherry se expresa constitutivamente. La información detallada de la construcción reportera está dada por Tecon et al. 13 En pruebas preliminares, la bacteria no reveló la natación y única habilidad enjambre muy lento. Fue capaz de migrar lentamente en hifas de Pythium ultimum cuando se aplica como una suspensión densa en la parte superior de las hifas. Puesto que las bacterias se incluyeron en agarosa en el siguiente protocolo, no se produjo la migración en las hifas. Usando microscopía de barrido láser confocal (CLSM), las bacterias bioinformador pueden ser visualizados directamente en los microcosmos y la expresión de eGFP se pueden cuantificar en relación con la cantidad de células (proporcional a la señal mCherry) con la ayuda de la ImageJ software. Esto permite la comparación de la biodisponibilidad cualitativamente en diferentes escenarios (es decir, mayor o menor). FLU se encontró que era biodisponible después del transporte del micelio de P. ultimum (es decir,fue mayor que en un control negativo). Además, el protocolo describe cómo cuantificar la cantidad total de micelios de transporte mediada a través de medios químicos y para verificar la biodisponibilidad de contaminantes usando fibras de vidrio revestida de silicio (fibras de SPME) en microcosmos idénticas. Los resultados basados ​​en esta configuración microcosmos se han publicado y discutido por la combinación de P. ultimum, fluoreno y B. sartisoli RP037-MCHE 15. Aquí, la atención se centra en una descripción del método detallado y la identificación de los peligros potenciales del protocolo para proporcionar este conocimiento para potenciales aplicaciones adicionales. Otras aplicaciones pueden implicar varios hongos, especies bacterianas (por ejemplo, de zonas contaminadas), y otros contaminantes (por ejemplo, pesticidas) o contaminante de alimentación (por ejemplo, suelos de edad).

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td></td><td>TCS SP5X, LAS AF - Versión 2.6.1; o equivalente CLSM</td></tr><tr><td>GC HP 7890 Series GC y Agilent 5975C MSD</td><td>Agilent</td><td></td><td>se puede utilizar un GC/MS equivalente</td></tr><tr><td>Columna capilar GC J& W 121-5522&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td>Barrancador de corcho <td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12863952</td><td>o cualquier otro</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Marienfeld</td><td>107222</td><td>Alto rendimiento, No.1.5H</td></tr><tr><td>GC/MS insterts</td><td>WICOM</td><td>WIC 47080</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS viales 2 ml</td><td>WICOM</td><td>WIC 41150</td><td></td></tr><tr><td>Tapas / tabiques para viales con tapón de rosca</td><td>DIONEX</td><td>49463 / 049464&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tapas para viales de GC/MS</td><td>WICOM</td><td>WIC 43948/B</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos Fibras de</td> vidrio <td>recubiertas</td>de PDMS ordinarias <td>Menzel</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Polymicro Technologies, Inc.</td><td></td><td>V (PDMS) = 13.55&nbsp; &plusmn; &nbsp; 0.02&nbsp; y micro; l&nbsp; m-1</td></tr><tr><td>Placas de Petri pequeñas / grandes</td><td>Greiner</td><td>633-102 / 628-102</td><td></td></tr><tr><td>Viales con tapón de rosca 40 ml</td><td>DIONEX</td><td>48783</td><td>se pueden utilizar otros viales de vidrio</td></tr><tr><td>Viales con tapón de rosca 60 ml</td><td>DIONEX</td><td>48784</td><td>se pueden utilizar otros viales de vidrio</td></tr><tr><td>Acenaftileno d08</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20510100</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Carl Roth</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbón activado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Carl Roth</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreno</td><td>Fluka</td><td>46880</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Carl Roth</td><td>T832.2</td><td>50 mg L-1</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>P7171</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Mínimo Medio:</fuerte> 100 ml <fuerte>Solución 1</fuerte> + 25 ml <fuerte>Solución 2</fuerte> + 5 ml <fuerte>Solución 3</fuerte> ad. 1.000 ml aqua dest</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Solución 1</fuerte></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Carl Roth</td><td>3746.1</td><td>5 g L-1&nbsp; </td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio x 6&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>1 g L-1</td></tr><tr><td>Nitrato de calcio x 4&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>P740.1</td><td>0.5 g L-1</td></tr><tr><td colspan="4">Solution 2</td></tr><tr><td>Fosfato disódico</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>55.83 g L-1</td></tr><tr><td>Fosfato monopotásico</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td>20 g L-1</td></tr><tr><td colspan="4">Solution 3 (pH 6,0)</td></tr><tr><td>EDTA disódico</td><td>MERCK</td><td>1084180250</td><td>0,8 g L-1</td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (II) x 4&nbsp; H2O</td><td>MERCK</td><td>1038610250</td><td>0,3 g L-1</td></tr><tr><td>Cloruro de cobalto (II) x 6&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>T889.3</td><td>4 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso (II) x 1&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4320.2</td><td>10 mg L-1</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre(II)</td><td>Carl Roth</td><td>P023.1</td><td>1 mg L-1</td></tr><tr><td>Molibdato de sodio x 2&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>0274.1</td><td>3 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloruro de zinc</td><td>MERCK</td><td>1088160250</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloruro de litio</td><td>Carl Roth</td><td>P007.1</td><td>0.5 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloruro de estaño (II) x 2&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4473.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Riedel-de-Haen&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>11606</td><td>1 mg L-1</td></tr><tr><td>Bromuro de potasio</td><td>Carl Roth</td><td>A137.1</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Yoduro de potasio</td><td>Carl Roth</td><td>6750.1</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloruro de bario</td><td>Carl Roth</td><td>4453.1</td><td>0.5 mg L-1</td></tr><tr><td>MMA</td><td></td><td></td><td>Medio mínimo + agarosa 0.2%</td></tr><tr><td>Fenantreno d10</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20920100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Patata Dextrosa Agar:</fuerte> 24 g L-1 caldo + bacto-agar 1,5%; pH 6,8</td></tr><tr><td>Caldo de patata Dextrosa</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio x 3 hydr.</td><td>Carl Roth</td><td>6779.1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sodio</td><td>MERCK</td><td>1066495000</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>MERCK</td><td>1083252500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>mTY medio:</fuerte> 3 g&nbsp; L-1 extracto de levadura, 5&nbsp; g&nbsp; L-1 bacto triptona y 50 mM NaCl</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Merck</td><td>1037530500</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Serva</td><td>4864702</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ con el complemento</td><td></td><td></td> logi tool <td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html y http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10</td></tr><tr><td>Pythium ultimum cepa 67-1</td><td></td><td></td><td>Obtenida del laboratorio del Dr. Christoph Keel; Departamento de Microbiología Fundamental, Universidad de Lausana, Suiza</td></tr><tr><td>Burkholderia sartisoli RP037-mChe</td><td></td><td></td><td>Obtenido del laboratorio del Prof. Jan Roelof van der Meer; Departamento de Microbiología Fundamental, Universidad de Lausana, Suiza</td></tr></tbody></table>

todo un enfoque bioinformador celular para evaluar transporte y biodisponibilidad de los contaminantes orgánicos en sistemas no saturadas de agua

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

La biodisponibilidad de los contaminantes es un requisito previo para su biodegradación efectiva en el suelo. Sin embargo, la concentración aparente promedio de un contaminante no es una medida apropiada para su disponibilidad; La biodisponibilidad depende más bien de la interacción dinámica de la transferencia de masa potencial (flujo) de un compuesto a una célula microbiana y de la capacidad de esta última para degradar el compuesto. En las partes del suelo no saturadas de agua, se ha demostrado que los micelios superan las limitaciones de biodisponibilidad al transportar y movilizar activamente compuestos orgánicos en el rango de centímetros. Mientras que el grado de transporte basado en micelios puede cuantificarse fácilmente por medios químicos, la verificación de la biodisponibilidad del contaminante para las células bacterianas requiere un método biológico. Para abordar esta limitación, elegimos el fluoreno HAP (FLU) como compuesto modelo y desarrollamos un microcosmos modelo de agua insaturada que vincula una fuente puntual de FLU separada espacialmente y la bacteria bioreportera degradadora de FLU Burkholderia sartisoli RP037-mChe mediante una red micelial de Pythium ultimum. Dado que el bioreportero expresa eGFP en respuesta al flujo de HAP a la célula, la exposición y degradación bacteriana de la gripe pudo monitorizarse directamente en el microcosmos mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). El CLSM y los análisis de imágenes revelaron un aumento significativo de la expresión de eGFP en presencia de P. ultimum en comparación con los controles sin micelio o FLU, lo que indica la biodisponibilidad de FLU para las bacterias después del transporte mediado por micelios. Los resultados de CLSM fueron respaldados por análisis químicos en microcosmos idénticos. El microcosmos desarrollado demostró ser adecuado para investigar la biodisponibilidad de contaminantes y visualizar concomitantemente las interacciones bacterias-miceliales involucradas.

Los resultados presentados aquí ya han sido publicados anteriormente 15. Por favor, consulte el artículo de detallada discusión mecanicista y ambiental. Después de la grabación de imágenes a través de CLSM, una proyección de intensidad máxima se puede realizar utilizando el software ImageJ microscopio respectivo o para obtener una primera impresión visual de la muestra y los controles (Figura 2). Más tarde, los conjuntos de datos se pueden proyectar de manera dife...

Un ensayo de toda bioinformador celda con Burkholderia sartisoli RP037-MCHE fue desarrollado para la detección de fracciones de un contaminante orgánico (es decir, fluoreno) disponible para la degradación bacteriana después de transporte activo por micelios puente poros llenos de aire en un sistema modelo saturado de agua.

Todo un enfoque bioinformador celular para evaluar Transporte y Biodisponibilidad de los Contaminantes Orgánicos en Sistemas no saturadas de agua

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un ensayo bioreportero para monitorear directamente la influencia de las redes miceliales en la biodisponibilidad de contaminantes orgánicos. Esto se logra inmovilizando bacterias bio reporteras que expresan proteína fluorescente verde mejorada o EGFP en función de la biodisponibilidad del contaminante en el sinfín, y aplicándolas en un portaobjetos de vidrio adecuado. A continuación, la fuente de contaminante se añade a la configuración dentro de un anillo de barrena, y el organismo micelial se inocula en un parche de barrena encima.Luego, el microcosmos se incuba hasta que el micelio ha crecido por completo y el contaminante puede translocalizarse a lo largo de la red. Por último, las células bio reporteras se visualizan mediante microscopía de barrido láser confocal. En última instancia, la influencia de las redes miceliales en la biodisponibilidad del flúor se evalúa mediante la cuantificación de la expresión de EGFP de las células bioreporteras mediante software de análisis de imágenes.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la extracción química de HAP, es que la biodisponibilidad de los contam

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