Name: Los geles de poliacrilamida para invadopodios y Fuerza de tracción Ensayos sobre las células cancerosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprende a preparar geles de poliacrilamida para ensayos de invadopodios y fuerza de tracción en células cancerosas. Este método permite analizar la actividad invasiva y las propiedades contractiles en matrices de diferente rigidez.

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1. Preparación de cubreobjetos de vidrio para FCA <ol><li> Clean 12 mm cubreobjetos con toallitas bajos pelusa. </li><li> Llama el cubreobjetos mm 12 y el cubreobjetos de 14 mm en la cúpula de cada 35 mm de vidrio plato inferior pasándolos a través de un mechero Bunsen con unas pinzas. </li><li> Tratar los micropocillos con 200 l de NaOH 0,1 N durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar y aire sequen los pocillos durante 30 minutos. </li><li> Tratar a los pocillos con 50 a 100 l de 3-aminopropiltrimetoxisilano durante 10 min a temperatura ambiente en la campana de humos. Este producto químico reacciona con el plástico; por lo tanto, utilizar pipetas de vidrio y no llene los pocillos completamente para evitar el contacto con el plástico plato. </li><li> Lavar los pocillos con agua ultrapura durante aproximadamente 10 min hasta que el 3-aminopropiltrimetoxisilano se vuelve claro. </li><li> Lavar los pocillos con agua ultrapura dos veces utilizando un frasco. </li><li> Lavar los pocillos con 2 ml de agua ultrapura unt temperatura ambiente en un agitador ajustado a una velocidad media (~ 1 Hz) durante 10 min. </li><li> Aspirar y aire sequen los pocillos durante 30 minutos. </li><li> Tratar los pocillos con 2 ml de solución de glutaraldehído al 0,5% a temperatura ambiente en un agitador ajustado a una velocidad media (~ 1 Hz) durante 30 min. </li><li> Lavar los pocillos con 2 ml de agua ultrapura a temperatura ambiente en un agitador a velocidad media (~ 1 Hz) durante 10 min. Repetir dos veces más para un total de 30 min. </li><li> Pocillos secos en un ángulo empinado (60º o más) durante 30 minutos. Nota: Los platos se pueden almacenar durante 2 meses en un desecador. </li></ol> 2. Preparación de la FCA para invadopodios ensayos <ol><li> Para una solución de la PAA suave (8% de acrilamida y 0,05% BIS) 1 ml, combinar 200 l de 40% de acrilamida, 25 l de 2% BIS y 574 l de agua ultrapura (Tabla 1). </li><li> Para una solución de la PAA duro (8% de acrilamida y 0,35% BIS) 1 ml, combinar 200 l de 40% de acrilamida, 175 &amp; #181; l de 2% BIS, y 409 l de agua ultrapura (Tabla 1). </li><li> Para una solución de la PAA rígido (12% de acrilamida y 0,60% BIS) 1 ml, combinar 300 l de 40% de acrilamida, 300 l de 2% BIS, y 169 l de agua ultrapura (Tabla 1). </li><li> Desgasificar las soluciones para 15 min. Añadir 200, 215, y 230 l de 1 mg / ml de fibronectina de plasma humano en agua ultrapura a las soluciones de PAA blandos, duros, y rígidas, respectivamente. Para todas las soluciones, añadir 1 l de / ml de éster de ácido acrílico N-hidroxisuccinimida 10 mg (NHS), 5 l de un persulfato de amonio 100 mg / ml, y 2 l de N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiamina (TEMED ; Tabla 1). Mezclar con pipeteo suave y evitar la creación de burbujas en soluciones. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (L) </td><td> 2% (L) </td><td> Ultrapura Agua (L) </td><td> 1 mg / ml FN (L) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (L) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (L) </td><td> TEMED (L) </td><td> Elástico Módulo (Pa) </td></tr><tr><td> Suave </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 574 </td><td> 200 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Duro </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 409 </td><td> 215 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rígido </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 169 </td><td> 230 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Ingrediente volumes y que resulta módulos elásticos para FCA blandos, duros y rígidos utilizados en los ensayos invadopodios. AA = acrilamida, FN = fibronectina, APS = persulfato de amonio. <ol start="5"><li> Pipetear 8,48 l de la solución de PAA en el centro de cada pocillo. Nota: Este volumen se obtiene teóricamente un PAA de 75 micras de espesor. </li><li> Baje suavemente el lado flameado del cubreobjetos de 12 mm a la gota en el pocillo, en pinzas. </li><li> Deje que la solución PAA intercalada para polimerizar durante 15-30 minutos. Verifique polimerización marcando la solución sobrante. </li><li> Añadir 2 ml de 1x PBS a cada placa y retirar los cubreobjetos de 12 mm con pinzas. Nota: 10x PBS se produce en el laboratorio y compuesta por 0.011 M KH 2 PO 4, NaCl 1,54 y 0,056 M Na 2 HPO 4. </li><li> Lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x a temperatura ambiente durante 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min. </li></ol> 3. Preparación de FCA para la tracción de la Fuerza ensayos <ol><li> Para una solución de la PAA suave (8% de acrilamida y 0,05% BIS) 1 ml, combinar 200 l de 40% de acrilamida, 25 l de 2% BIS y 566 l de agua ultrapura (Tabla 2). </li><li> Para una solución de la PAA duro (8% de acrilamida y 0,35% BIS) 1 ml, combinar 200 l de 40% de acrilamida, 175 l de 2% BIS, y 401 l de agua ultrapura (Tabla 2). </li><li> Para una solución de la PAA rígido (12% de acrilamida y 0,60% BIS) 1 ml, combinar 300 l de 40% de acrilamida, 300 l de 2% BIS, y 161 l de agua ultrapura (Tabla 2). </li><li> Desgasificar las soluciones para 15 min. Añadir 200, 215, y 230 l de 1 mg / ml de fibronectina de plasma humano a las soluciones de PAA blandos, duros, y rígidas, respectivamente. Sonicar 8 l de 200 nm microesferas rojas fluorescentes (excitación / emisión de 580/605 nm) durante 30 segundos. Para cada solución, añadir 8 l de 200 microesferas fluorescentes rojas nm,1 l de ácido acrílico 10 mg / ml de éster de NHS, 5 l de una persulfato de amonio 100 mg / ml, y 2 l de TEMED (Tabla 2). Mezclar con pipeteo suave y evitar la creación de burbujas en soluciones. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td style="width:40px"> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (L) </td><td> 2% BIS (L) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> Ultrapura Agua (L) </td><td> 1 mg / ml FN (L) </td><td> Micro-esferas (L) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (L) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (L) </td><td> TEMED (L) </td><td> Elástico Módulo (Pa) </td></tr><tr><td> Suave </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 566 </td><td> 200 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Duro </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 401 </td><td> 215 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rígido </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 161 </td><td> 230 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tabla 2:. Volúmenes de ingredientes y resultando módulos elásticos para FCA blandos, duros y rígidos utilizados en los ensayos de la fuerza de tracción AA = acrilamida, fn = fibronectina, APS = persulfato de amonio. <ol start="5"><li> Pipetear 8,48 l de la solución de PAA en el centro de cada pocillo. Nota: Este volumen se obtiene teóricamente un PAA de 75 micras de espesor. </li><li> Baje suavemente el lado flameado del ªe 12 mm cubreobjetos sobre la gota en el pocillo, en pinzas. </li><li> Deje que la solución PAA intercalada para polimerizar durante 15-30 minutos. Verifique polimerización comprobando solución sobrante. </li><li> Añadir 2 ml de 1x PBS a cada placa y retirar los cubreobjetos de 12 mm con pinzas. </li><li> Lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x a temperatura ambiente durante 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min. </li></ol> 4. Preparación de ECM para invadopodios ensayos <ol><li> Calentar la solución de gelatina (gelatina al 1% y 1% de sacarosa) a 37 ° C. </li><li> Tratar los FCA con 150 l de la solución de gelatina durante 1 min luego cuidadosamente aspirado desde el fondo de los pocillos al sostener los platos con fondo de cristal en un ángulo de 45 °. </li><li> Se seca la capa fina restante de gelatina sobre las DAP en los micropocillos en un ángulo empinado (60 ° o mayor) para optimizar el secado durante 60 min. </li><li> Tratar los pocillos con 2 ml de una solución fría de glutaraldehído 0,5% en iCE para 15 min seguido por temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x para una 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min. </li><li> Tratar los pocillos con 2 ml de una solución de borohidruro de sodio durante 1 min. Golpee suavemente los platos en el banco para eliminar las burbujas que se forman en la superficie de la gelatina. </li><li> Aspirar y lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x durante 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min. </li><li> Se diluye una solución de fibronectina de plasma humano marcado con FITC a 50 g / ml con un PBS 1X y se centrifuga a 175.000 xg a 4 ° C durante 15 min. Cualquiera de adquirir comercialmente disponible fibronectina etiquetado o la etiqueta de la siguiente manera: <ol><li> Disolver 5 mg de fibronectina en 10 ml de tampón de borato (metaborato de sodio tetrahidratado 170 mM y NaCl 40 mM) y el lugar en tubos de diálisis. </li><li> Etiqueta de la fibronectina mediante la colocación de la tubería en 200 ml de tampón de borato que contiene 6 mg de FITC disuelto a temperatura ambiente en un agitador magnéticofijado en la posición más baja de 1,5 horas en la oscuridad. </li><li> Se dializa con 500 ml de una PBS 1x en un agitador magnético fijado en la posición más baja durante 3 días en una habitación oscura y fría (4 ° C) con dos volúmenes cambia un día. </li><li> La concentración de fibronectina marcada con FITC calcular sobre la base de la densidad óptica de alícuotas diluidas (1: 200) a 280 nm y 493 nm como [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 veces el factor de dilución de 200 veces 2 (que representa para el glicerol concentración de la fibronectina en el paso siguiente) resulta en unidades de mg / ml. </li><li> Dializar noche en una solución de glicerol al 50% en un agitador magnético fijado en la posición más baja durante la noche en una habitación fría oscuridad a 4 ° C.) </li></ol></li><li> Tratar los micropocillos con 150 l de la solución de fibronectina marcada con FITC a temperatura ambiente durante 60 min en la oscuridad. </li><li> Aspirar cuidadosamente la solución de fibronectina marcada con FITC desde el fondo de los pocillos al sostener los platos con fondo de cristal enun ángulo de 45 ° y luego se llenan los platos inferiores de vidrio con solución de etanol al 70% a temperatura ambiente durante 10 min en una campana de cultivo de células oscuro para la esterilización. También llenar tapas de los recipientes de vidrio de fondo o limpiar con toallitas bajos pelusa empapado en etanol al 70%. </li><li> Lave los platos con fondo de cristal, llenándolos con 1x PBS durante 5 min. Repetir dos veces más con 2 ml de PBS 1x para un total de 15 min. </li></ol> 5. Preparación e Imagen de invadopodios ensayos <ol><li> Añadir 25,000 células cancerosas en 2 ml de medio invadopodios (1: 1 DMEM y medio RPMI 1640 con 5% de suero baja en proteínas, suero bovino fetal al 10%, y 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico recién añadido) a los platos de fondo de cristal y incubar durante la noche. </li><li> Aspirar y tratar las microcubetas con 2 ml de una solución de paraformaldehído al 3,7% a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 min para fijar las células. </li><li> Después de dos lavados rápidos con 2 ml de PBS 1x, tratar los micropocillos con 2 ml de una solución de 0,1% de Triton X-100 en tempe habitaciónratura en la oscuridad durante 5 min para permeabilizar las células. </li><li> Después de un lavado rápido con 2 ml de PBS 1x, tratar las microcubetas con 3% de albúmina de suero bovino solución de bloqueo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 60 min para bloquear las células. </li><li> Incubar los pocillos con 150 l de anticuerpo de ratón anti-cortactin (1: 750) en solución de bloqueo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 60 min. </li><li> Lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x para 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min. </li><li> Incubar los pocillos con 150 l de anticuerpo de cabra anti-ratón 633 de anticuerpos (1: 500) y 546 faloidina (1: 750) en solución de bloqueo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 60 min. </li><li> Lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x para 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min. </li><li> Añada seis gotas de medio de montaje para llenar cada pocillo y cubra con 22 x 22 cubreobjetos. </li><li> Cortactin Imagen y actina para identificar invadopodios utilizando filtros de excitación y emisión de 632/647 nm y556/570 nm, respectivamente, utilizando una lente de inmersión en aceite de alta NA, 40X en un microscopio invertido de campo amplio. Del mismo modo, la imagen de fibronectina para identificar la degradación de ECM utilizando un filtro de excitación y emisión de 492/518 nm. </li></ol> 6. Preparación e Imagen de la fuerza de tracción Ensayos <ol><li> Añadir 15,000 células cancerosas en 2 ml de medio invadopodios a los platos con fondo de cristal y se incuba durante la noche. </li><li> Aspirar medio en los platos de fondo de cristal y reemplazar con 2 ml de medio L-15, con los mismos suplementos (5% de suero baja en proteínas, suero bovino fetal al 10%, y 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico recién añadido), pre -warmed a 37 ° C. </li><li> Incubar los platos inferiores de vidrio en una cámara ambiental en un microscopio invertido pre-equilibrada a 37 ° C con alta humedad durante 1 hr. </li><li> Tome cuatro conjuntos de imágenes con una alta NA, 40X lente de un microscopio de campo amplio invertida con una etapa automatizado para marcar posiciones celulares: <ol><li> Celdas de imagen sobre dep de los PAA utilizando contraste de fase (&quot;fase&quot; de la imagen). </li><li> Image microesferas fluorescentes utilizando filtros de excitación y emisión de 560/645 nm, centrándose ligeramente por debajo de las células hasta que la primera capa de microesferas en la parte superior de la FCA entra en el foco (&quot;estresados&quot; imagen). </li><li> Además, se centran en la parte inferior de la FCA (utilizando las microesferas como marcadores) y tomar una imagen (imagen &quot;de abajo&quot;). Nota: El propósito de esta imagen es para registrar la posición z para obtener el espesor PAA real en cada posición para el cálculo de la fuerza de tracción como se describe en resultados representativos. </li><li> Después de estas imágenes han sido adquiridos en múltiples posiciones, mezclar suavemente en 220 l de solución al 10% de Triton-X para eliminar las células. Microesferas de la imagen en la parte superior de la FCA en cada posición como se describe anteriormente (imagen &quot;nulo&quot;). </li></ol></li></ol>

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el premio número K25CA143412 (Parekh). Nos gustaría reconocer que el apoyo adicional fue proporcionada por el Departamento de Otorrinolaringología. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Se presenta un método para la fabricación de FCA que se pueden utilizar como la base para los ensayos de invadopodios y fuerza de tracción para correlacionar comportamientos celulares invasivas y contráctiles. Mientras FCA han sido utilizados para observar los efectos de rigidez en las células y calcular las fuerzas de tracción 18,24,27, este protocolo es el primero en desarrollar ensayos paralelos basados ​​en APA con las mismas rigideces correlacionar comportamientos celulares invasivos y contráctiles en re...

La rigidez de la ECM asociado al tumor ha sido identificado como un factor significativo en la conducción de comportamiento maligno mediante el aumento de la contractilidad actomyosin 1-3. Mientras que este efecto se ha demostrado principalmente con células de cáncer de mama, la rigidez de la matriz se ha encontrado para alterar las propiedades invasivas de las células derivadas de una variedad de cánceres 4-8 lo que sugiere que la rigidez tumor pueden desempeñar un papel en otro tipo de cánceres. Para penetrar en los tejidos entrecruzados durante la migración invasivo, las células cancerosas utilizan protuberancias adhesivas actina-ricos conocidos como invadopodios que localizar proteinasas para degradar focalmente el ECM 9. Invadopodios se consideran una característica de las células invasoras y han sido implicados en la invasión de células tumorales y la metástasis 10,11. El trabajo previo ha mostrado que la rigidez de la matriz puede regular los números invadopodios y la degradación de ECM asociado 4,12 través de la miosina II actividad y proteínas mechanosensitive 12. Dado quecorrelación entre la densidad del tumor y la agresividad del cáncer 13,14, estos resultados sugieren un mecanismo por el cual las células cancerosas pueden responder a los tejidos tumorales rígidos para conducir la invasión y la metástasis a través de la contractilidad actomiosina. En rigidez ECM vitro y en la densidad del tejido vivo se ha demostrado para regular el comportamiento invasivo de las células cancerosas 1,15-17. Mientras que la contractilidad actomyosin parece ser importante en este proceso, la corriente de conflicto estudios en cuanto a si la capacidad metastásica se correlaciona con aumento o disminución de las fuerzas contráctiles 6,18-20. Además, aún se desconoce si estas fuerzas median directamente la actividad invadopodios 21. Recientemente, hemos encontrado que las fuerzas contráctiles célula cancerosa dependían de la rigidez de la matriz y fueron predictivos de la degradación de ECM por invadopodios 5. Estos resultados sugieren que las fuerzas celulares pueden desempeñar un papel importante en la progresión del cáncer mediando invadopodios actividad en respuesta a las propiedades mecánicas del microambiente del tumor. Para correlacionar propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas 5, modificamos un protocolo para la creación de FCA con diferentes rigideces que se utilizó anteriormente para investigar la actividad invadopodios rigidez dependiente 4,12,22. Por reticulación químicamente fibronectina plasmática humana en todo el FCA, estos hidrogeles modificados se pueden utilizar como la base para tanto invadopodios y los ensayos de fuerza de tracción para asegurar que las células experimentaron las mismas rigideces en ambos experimentos 5. En los ensayos de invadopodios, la fibronectina proporciona un dominio de unión natural para la gelatina para vincular el ECM superpuesto a la FCA para detectar degradación de la matriz. En los ensayos de fuerza de tracción, la fibronectina proporciona un ligando para la adhesión celular directa para detectar desplazamientos de microesferas utilizadas para calcular las fuerzas de tracción celulares. Este método resulta en lo que hemos llamado blando, duro,y PAA rígidos que están unidos a los platos con fondo de cristal y tienen módulos de elasticidad, E, de 1.023, 7.307 y 22.692 Pa 5 que abarcan la gama de propiedades mecánicas reportados para los tejidos normales y cancerosos 23.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropiltrimetoxisilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida (40%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acrílico NHS éster</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8060</td><td>preparar fresco en campana extractora 10 mg/ml en DMSO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 faloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A22283</td><td>también puede utilizar rodamina</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>preparar una solución fresca al 10% en 1x PBS</td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606</td><td>usar 6 gotas para llenar micropocillos</td></tr><tr><td>BIS (2%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>RPI</td><td>A30075</td><td>hacer 3% para la solución de bloqueo en 1x PBS y almacenar en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Cubreobjetos (12 mm)</td>Tubo de diálisis <td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9777</td><td>preequilibrado en tampón de borato durante 15 - 30 min</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>úselo para hacer medio de invadopodia</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>úselo para hacer ácido acrílico solución de éster NHS</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico Vida</td><td> Tecnologías</td><td>PHG0311</td><td>utilizar para hacer que el medio de invadopodia</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>E200</td><td>diluido con agua ultrapura al 70%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>uso para hacer que el medio de invadopodia</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>proteja de la luz</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Polysciences</td><td>00639</td><td>Por lo general, prepare 10 ml de solución de sacarosa al 1% / gelatina al 1% en PBS y almacene a 4 grados; C (precaliente PBS para disolver la gelatina fácilmente)</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio (cubreobjetos de 35 mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>los cubreobjetos no están recubiertos</td></tr><tr><td>de glutaraldehído (25%)</td><td>Polysciences</td><td>01909</td><td>diluido con 1x PBS al 0,5%</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón de cabra Alexa Fluor 633</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma humano</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>agregue 5 ml de agua ultrapura para hacer 1 mg/ml; alícuota en volúmenes basada en el uso para evitar ciclos excesivos de congelación y descongelación</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>PX-1565-1</td><td>uso para fabricar 10 veces el stock de PBS</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-cortactina 4F11 para ratones</td><td>EMD Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>SX-0720-1</td><td>uso para hacer 10x stock de PBS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td>se usa para hacer 10x PBS stock y tampón de borato</td></tr><tr><td>NaOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>diluido con agua ultrapura a 0.1 N</td></tr><tr><td>Nu-Serum (suero bajo en proteínas)</td><td>BD Biosciences</td><td>355500</td><td>uso para hacer medio de invadopodia</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Acros</td><td>416785000</td><td>Por lo general, haga un 10% de caldo en 1x PBS, prepare en una campana extractora y agregue unos pocos ml de NaOH fuerte para disolver el paraformaldehído fácilmente y luego vuelva a pH 7.4 con HCl)</td></tr><tr><td>PBS (estéril)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>uso para cultivo celular</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>uso para hacer medio de invadopodia</td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>preparar fresco en campana extractora 1 mg/ml en 1x PBS</td></tr><tr><td>Metaborato de sodio tetrahidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0251</td><td>se usa para hacer tampón de borato</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td>generalmente hace 10 ml de solución de sacarosa al 1% / gelatina al 1% en PBS y almacene a 4 & grados; C (precaliente PBS para disolver la gelatina fácilmente)</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td>haga un 10% de caldo en 1x PBS y úselo tal cual para la eliminación de células en el ensayo de fuerza de tracción o diluya con 1x PBS para tinción</td></tr></tbody></table>

los geles de poliacrilamida para invadopodios y fuerza de tracción ensayos sobre las células cancerosas

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Tejidos tumorales rígidos han sido fuertemente implicados en la regulación de la migración celular y la invasión del cáncer. La migración invasiva a través de tejidos reticulados se ve facilitada por los salientes de actina-ricos llamados invadopodios que proteolíticamente degradan la matriz extracelular (ECM). Actividad invadopodios ha demostrado ser dependiente de la rigidez ECM y célula de cáncer de fuerzas contráctiles que sugieren que las señales de rigidez pueden regular estas estructuras subcelulares a través de la contractilidad actomiosina. Propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas pueden ser correlacionados in vitro utilizando ensayos invadopodios y de la fuerza de tracción sobre la base de geles de poliacrilamida (PAA) de diferentes rigideces. Propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas pueden ser correlacionados in vitro utilizando ensayos invadopodios y de la fuerza de tracción sobre la base de geles de poliacrilamida (PAA) de diferentes rigideces. Aunque existen algunas variaciones entre los dos ensayos, el protocolo presentado aquí proporciona un método para crear FCA ésimoa se puede utilizar en ambos ensayos y son fácilmente adaptables a las necesidades biológicas y técnicas específicas de los usuarios.

En el ensayo de invadopodios, invadopodios se identifican típicamente por colocalización de los marcadores como la actina y la cortactin en estructuras punteadas dentro del cuerpo de la célula (Figura 1). Tanto la degradación de forma activa y no degradante invadopodios puede ser contado y se diferencian por si estas estructuras están colocalized con áreas negras que carecen de señal fluorescente en la fibronectina marcada con FITC (Figura 1). Invadopodios se cuentan manualmente, y la d...

Rigidez mecánica en el microambiente tumoral juega un papel fundamental en el impulso de comportamiento maligno mediante el aumento de la actividad invadopodios y actomyosin contractilidad. Geles de poliacrilamida utilizando (PaaS), ensayos de invadopodios y de la fuerza de tracción se pueden utilizar para estudiar las propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas en respuesta a la matriz rigidez.

Los geles de poliacrilamida para invadopodios y Fuerza de tracción Ensayos sobre las células cancerosas

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

El objetivo general de este procedimiento es crear geles de poliacrilamida que puedan utilizarse tanto en ensayos de invasión, podios y fuerza de tracción para estudiar las propiedades invasivas y contráctiles de células cancerosas. Esto se logra primero activando las cubreobjetos de 14 milímetros en las placas de vidrio tipo flor de cristal para asegurar que los geles de poliacrilamida se adhieran al vidrio. A continuación, se preparan soluciones de poliacrilamida para ambos ensayos, con el fin de obtener geles con diferentes rigideces o propiedades mecánicas.Luego, se preparan los ensayos de podios invadidos con una capa delgada de matriz extracelular marcada con fluorescencia para detectar la degradación. Finalmente, los ensayos se siembran con células cancerosas para una incubación nocturna, seguida de la fijación y tinción del invasor, las placas de podios y la obtención de imágenes en células vivas de las placas de fuerza de tracción. En última instancia, se utiliza microscopía de fluorescencia para obtener imágenes del invasor, los podios y la degradación de la matriz extracelular.Aunque la microscopía de fluorescencia y de campo amplio se utilizan para obtener imágenes de m

polyacrylamide-gels-for-invadopodia-traction-force-assays-on-cancer

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

En este vídeo, que muestran las técnicas experimentales utilizadas para la fabricación de cumplimiento, la matriz extracelular (ECM) sustratos recubiertos adecuadas para el cultivo celular, y que son susceptibles de microscopía de fuerza de tracción y observando los efectos de la rigidez de ECM en el comportamiento celular.

Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular

Se describe el método para producir prototípico cubreobjetos de microscopio recubiertos de gelatina fluorescente para visualizar invadopodios mediada por la degradación de la matriz. Técnicas computacionales utilizando software disponible se presentan para la cuantificación de los niveles resultantes de la proteólisis matriz por las células individuales dentro de una población mixta y para los grupos multicelulares que abarcan todo campos microscópicos.

La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares

Este video describe el ensayo de microscopía de fuerza de tracción. El ensayo determina la tracción celular de las células de cáncer de colon humano en la matriz extracelular presente en un hidrogel elástico suave que tiene perlas fluorescentes incrustadas. El desplazamiento resultante de las perlas fluorescentes se mide utilizando un software adecuado.

Ensayo de citometría de tracción: un método para cuantificar la fuerza de tracción ejercida por las células cancerosas en la MEC

De uso general, se describen métodos muy accesibles para el examen de la migración celular y la invasión in vitro. El primer método es el ensayo de cierre de la herida de células que mide la motilidad celular. El segundo método es la migración y la invasión de ensayo Transwell que evalúa la quimiotaxis y la capacidad invasiva de las células.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

Nuestro laboratorio ha desarrollado hidrogeles de poliacrilamida de ADN-reticulada, un sistema dinámico de hidrogel, para entender mejor los efectos de la modulación de la rigidez del tejido en función de la célula. Aquí, ofrecemos esquemas, descripciones y protocolos para preparar estos hidrogeles.

Preparación de ADN-poliacrilamida reticulada hidrogeles

Se describe un protocolo para extraer células humanas primarias de un tumor de colon quirúrgico y tejidos normales. A continuación, las células aisladas se cultivan en sustratos elásticos blandos (hidrogeles de poliacrilamida) funcionalizados por una proteína de la matriz extracelular e incrustados con microesferas fluorescentes. La citometría de tracción se realiza para evaluar las tensiones contráctiles celulares.

Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría

Aquí, se describe un método que permite la preparación rápida, eficiente y económica de geles de poliacrilamida en un formato de placa multipocillo. El método no requiere ningún equipo especializado y podría ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio de investigación. Sería particularmente útil en investigaciones centradas en la comprensión de las respuestas celulares dependientes de la rigidez.

Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

La diferenciación celular está regulada por una serie de factores microambientales, incluyendo tanto la composición de la matriz y de material de sustrato propiedades. Se describe aquí una técnica utilizando microarrays de células en combinación con microscopía de fuerza de tracción para evaluar tanto la diferenciación celular y las interacciones célula-sustrato biomecánicas como una función del contexto microambientales.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

La migración celular colectiva en el desarrollo, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer a menudo se guía por los gradientes de los factores de crecimiento o moléculas de señalización. Aquí se describe un sistema experimental que combina la microscopía de tracción con un sistema microfluídico y una demostración de cómo cuantificar la mecánica de la migración colectiva bajo gradiente bioquímico.

Microscopía de tracción integrada con microfluídicos para la migración colectiva quimiotáctica

Para avanzar, los conos de crecimiento deben ejercer fuerzas de tracción contra el entorno externo. La generación de fuerzas de tracción depende de la dinámica de la actina y el acoplamiento del embrague. El presente estudio describe métodos para analizar la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y las fuerzas de tracción para el avance del cono de crecimiento.

Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Aprende a preparar geles de poliacrilamida para ensayos de invadopodios y fuerza de tracción en células cancerosas. Este método permite analizar la actividad invasiva y las propiedades contractiles en matrices de diferente rigidez.

Los geles de poliacrilamida para invadopodios y Fuerza de tracción Ensayos sobre las células cancerosas

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