Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en Escherichia coli

El objetivo general de este procedimiento es identificar las proteínas de membrana expresadas en SIA coli para análisis estructurales y funcionales. En primer lugar, se recolectan las bacterias, se analizan y se analizan mediante la página SDS para la visualización de las proteínas GFP correctamente plegadas mediante fluorescencia de Ingel. En el segundo paso, se aumenta la producción de la E. coli determinada para expresar las proteínas de membrana de interés, y se prepara una fracción total de membrana a partir de las células después de la inducción de la expresión de la proteína.

Finalmente, la fracción total de la membrana se solubiliza en cuatro detergentes diferentes y la monodispersidad del detergente. Solubilizado. Las proteínas GFP se analizan mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En última instancia, las proteínas se pueden monitorizar mediante fluorescencia y los perfiles elucianos se pueden trazar para evaluar la monodispersión de agregación y la GFP libre en las muestras.

La producción de proteínas de membrana recombinantes para estudios estructurales y funcionales sigue siendo un desafío técnico debido a su baja solubilidad y heredan inestabilidad una vez extraídas en detergentes. La experiencia ha demostrado que el cribado de múltiples variantes de proteínas de membrana, como ortólogos de diferentes especies, puede mejorar la tasa de éxito de la expresión de proteínas de membrana. La fusión con proteínas fluorescentes verdes se utiliza para informar de un plegamiento auténtico.

El primer paso en nuestro protocolo basado en GFP para el cribado de la expresión de proteínas de membrana y E. coli utiliza la fluorescencia ingel de lisados de detergente de células enteras para identificar las construcciones de proteínas de membrana para su posterior análisis en función del nivel de expresión en el cribado, El comportamiento de la selección de proteínas de membrana y diferentes detergentes se evalúa luego mediante detección de fluorescencia acoplada a cromatografía de exclusión por tamaño. Esto proporciona información sobre la monodispersidad de los complejos de proteínas del detergente. Para analizar la expresión bacteriana inducida por IPTG, comience transfiriendo un mililitro de duplicado de colina e tratada con IPTG del cultivo nocturno de 24 bloques de pocillos profundos a 96 bloques de pocillos profundos, selle los bloques y luego centrifugue las células durante 10 minutos a 6.000 veces G a temperatura ambiente.

A continuación, invierta el bloque para decantar el medio golpeando suavemente una toalla de papel para escurrir el líquido restante. Vuelva a sellar la placa y almacene las celdas a menos 80 grados centígrados después de al menos 20 minutos. Descongele los pellets durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego use una pipeta multicanal para resuspender las células por completo en 200 microlitros de tampón de lisis.

Tratar las células con 20 microlitros de solución DLPI se agitó a 1000 RPM y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, añada 25 microlitros de 10%doda multiside a cada pocillo e incube las células durante otros 60 minutos agitando. Después de la centrífuga de tratamiento DDM, el pozo profundo bloquea y luego transfiere 10 microlitros del lisado aclarado a una placa de microtitulación y agrega 10 microlitros de tampón de carga de gel de página SDS.

Ahora cargue el gel con 10 microlitros de la solución tampón de lisado por pocillo y haga funcionar el gel a voltaje constante entre 100 y 120 voltios en una cámara frigorífica durante dos a 2,5 horas cuando el diafragma llegue al fondo. Coloque el gel en un generador de imágenes con un filtro de luz azul para detectar las proteínas de fusión y ampliar los cultivos celulares. Después de transformar un Eloqua de ecoli competente, elija una colonia en 10 mililitros de caldo energético para que crezca durante la noche a 37 grados centígrados.

A la mañana siguiente, diluya cinco mililitros del cultivo durante la noche en 500 mililitros de caldo energético y continúe cultivando los cultivos agitando a 250 RPM y 37 grados centígrados. Cuando el diámetro exterior a 595 nanómetros sea de aproximadamente 0,5, induzca la expresión añadiendo IPTG a una concentración final de un milimolar y, a continuación, vuelva a colocar el cultivo en el agitador durante la noche, esta vez a 20 grados centígrados. A la mañana siguiente, recoja las células por centrifugación y almacene los gránulos a menos 80 grados centígrados.

Para preparar las membranas celulares. Vuelva a suspender los gránulos a temperatura ambiente en cinco mililitros de PBS por gramo de gránulo de celda, aumentando el volumen según sea necesario hasta que la viscosidad se reduzca a una consistencia líquida. Luego agregue cloruro de magnesio a una concentración final de ADN milimolar a una concentración final de 10 microgramos por mililitro y una tableta inhibidora de proteasa preempaquetada por 20 gramos de gránulo celular a las células.

A continuación, abra las celdas con un disruptor celular refrigerado a una presión de 30 KPSI y luego granule las celdas intactas y los desechos durante 15 minutos a 30.000 veces G y cuatro grados Celsius. Transfiera el supinato a un tubo de ultracentrifugación y recoja la fracción total de la membrana girando el supinato durante una hora a 200.000 veces G y cuatro grados Celsius. A continuación, utilice el homogeneizador de células para volver a suspender el pellet de membrana en 10 mililitros de PBS helado para solubilizar las membranas de cada detergente que se vaya a utilizar.

Alícuota de 900 microlitros de la suspensión de membrana en un tubo centrífero de polietileno de 1,5 mililitros. A continuación, añada 100 microlitros de cada detergente recién preparado a los tubos de 1,5 mililitros correspondientes e incube las mezclas a cuatro grados centígrados con vegetación suave. Después de una hora, granule el detergente y las fracciones solubles con una ultracentrífuga de sobremesa, asegurándose de que los tubos estén al menos medio llenos y retengan el agente supino para la cromatografía de exclusión por tamaño detectada fluorescente o el análisis FEC.

A continuación, una columna de exclusión de tamaño de ecuador con un amplio rango de fraccionamiento con tampón de flujo continuo a una velocidad de 0,3 mililitros por minuto. A continuación, inyecte 100 microlitros de una muestra de membrana solubilizada en la columna con el mismo caudal y controle el perfil eluciano mediante óptica de fluorescencia. Finalmente, importe los datos de volumen e intensidad de fluorescencia elucian en un programa de hoja de cálculo para su visualización gráfica y analice el material de membrana solubilizado restante mediante fluorescencia ingel.

Como se demostró anteriormente, dicha familia de proteínas es esencial para la división celular bacteriana. En estas imágenes, se muestra un representante en la visualización de fluorescencia en gel de 24 OUTTA 47 dichos constructos. La intensidad de las bandas da una indicación del nivel de expresión.

Por ejemplo, la proteína de fusión en la escena cuatro del carril se expresa bien en ambas cepas. Sin embargo, las bandas adicionales de menor peso molecular sugieren que la proteína está parcialmente degradada en muchos carriles. Hay una banda que corresponde en tamaño solo a GFP.

Por ejemplo, G cuatro y H cuatro se descomponen completamente en GFP libre en la deformación C 41 DE tres P lies S. Mientras que en el LEMO 21 DE tres, hay alguna proteína intacta en estos gráficos. El análisis de dos constructos que se comportaron bien en el cribado primario mediante la exclusión de tamaño detectada por fluorescencia demuestra cómo las proteínas se comportan de manera diferente dependiendo de cuál de los cuatro detergentes se probó.

Por ejemplo, esta proteína solo dio un pico simétrico con la agregación de hojarasca en Dool Multiside, lo que la convierte en el detergente de elección para la purificación posterior. Por el contrario, la otra proteína de fusión exhibió un perfil similar en todos los detergentes probados. Este protocolo puede ampliarse fácilmente para incluir, por ejemplo, diferentes cepas de E. coli cultivadas en diferentes condiciones de expresión y disuasivos adicionales tanto en el cribado primario como en el secundario.

En resumen, el objetivo principal de este protocolo es permitir el cribado de un gran número de proteínas de membrana en términos de expresión y detergente con el fin de identificar candidatos para análisis posteriores.