Name: Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a expresar y evaluar proteínas de membrana recombinantes en Escherichia coli mediante fusión con GFP y cromatografía de exclusión molecular con detección por fluorescencia.

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El OPPF-UK está financiado por el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (subvención MR/K018779/1) y el Laboratorio de Proteínas de Membrana por el Wellcome Trust (subvención 099165/Z/12/Z).

1. Construcción de vectores de expresión <ol><li> Uso PCR Infusión de clonación para la construcción de hasta 96 plásmidos de expresión en paralelo usando los vectores pOPINE-3C-GFP y pOPIN-N-GFP que añadir ya sea fusiones GFP-His6 C-terminal o N-terminal de las secuencias escindibles a 13 respectivamente. Nota: La elección del vector viene dictada por la topología de la proteína ya que el GFP necesita ser expresado en el citosol, por lo tanto para una proteína citosólica con un N-terminal y C-terminal extracelular usaríamos pOPIN-N-GFP y para un N-terminal extracelular y citosólica C-terminal en que usarían pOPINE-3C-GFP. Cuando ambos terminales son citosólica usaríamos pOPINE-3C-GFP menos que haya motivos funcional no etiquetar el C-terminal. </li><li> Amplificar las secuencias de ADN que codifican las proteínas de la membrana con cebadores que incorporan las siguientes extensiones mostrados: pOPINE-3C-GFP (Cebador directo - AGGAGATATACCATG; cebador inverso - CAGAACTTCCAGTTT) y pOPIN-N-GFP (Cebador directo - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; cebador inverso - ATGGTCTAGAAAGCTTTA). </li><li> Analizar la reacción de PCR por electroforesis en gel de agarosa. Una vez que los productos de PCR limpios se han obtenido, añadir 5 U DpnI a cada pocillo (maquillaje en 5 l de tampón de reacción 1x DpnI). Purificar los productos de PCR utilizando perlas magnéticas en un formato de 96 pocillos. Nota: Dpnl se añade para eliminar el vector de la plantilla; este paso no es necesario si se usa ADN genómico como plantilla. </li><li> Añadir 1 l (100 ng) del vector linealizado apropiado a cada pocillo de una placa de PCR. </li><li> Utilizando una pipeta multicanal add x l de PCR purificado insertar a los pocillos apropiados de la placa de PCR. Asegúrese de que todos los productos están en el rango de 10 a 250 ng. </li><li> Añadir (9-x) l de agua al pozo y transferir toda la 10 l a un tubo que contiene el reactivo seco-en-fusión. Dejar durante 30 seg. </li><li> Mezcle el contenido brevemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Transferencialas reacciones de vuelta a la placa de PCR original y el sello. </li><li> Incubar durante 30 minutos a 42 ° C en un termociclador. </li><li> Transferir inmediatamente las reacciones de hielo tan pronto como se completa la reacción y añadir 40 l de TE (10 mM Tris, pH 8,0, EDTA 1 mM). </li><li> Congelar a la vez o se transforman en células competentes. Para la transformación, utilice 3 l de la reacción diluida por cada 50 l alícuota de alta competencia (&gt; 5 x 10 9 transformantes / mg) E. competente células de E. coli. </li><li> Añadir 1 ml de agar LB suplementado con 50 g / ml de carbenicilina por pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos (para la clonación, preparar pocillos durante 2 x número de construcciones). </li><li> Tras consecuencia, Después de placa de derivación a cabo 25 l y 25 l de un 1 en 5 dilución del cultivo sobre el agar que contiene 24 pocillos de cultivo de tejidos. </li><li> Difundir las células inclinando suavemente la placa. </li><li> Secar la placa con la tapa durante 10-15 minutos a 37 ° C o en un flow campana a temperatura ambiente. </li><li> Vuelva a colocar la tapa y gire la placa boca abajo y se incuba durante la noche a 37 ° C. </li><li> Escoja dos colonias y mini-preparación de los vectores. </li><li> PCR verificar las construcciones utilizando el cebador inverso específico de constructo y un cebador directo específico vector (por ejemplo pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG). </li></ol> 2. Transformación de E. E coli cepas xpression Nota: Antes de realizar este protocolo, E. células competentes de E. coli se hacen, alícuotas y se almacenaron congeladas a -80 ° C como se ha descrito previamente 13. Expresión de la proteína de membrana se tamiza de forma rutinaria en dos cepas, Lemo21 (DE3) y C41 (DE3) pLysS. Para ayudar a la interpretación de los resultados puede ser útil para incluir un control positivo, por ejemplo, un plásmido que expresa GFP o una proteína de membrana fusionado a GFP conocido para expresar y un control negativo vector vacío. <ol><li> Descongele la aliquotted E. coli en hielo. Añadir 3 l de plásmido de expresión de mini-preparada a cada alícuota de células competentes. </li><li> Se incuba la mezcla en hielo durante 30 min. </li><li> De choque térmico de las células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Permitir que las células se recuperen en hielo durante 2 min y luego se añaden 300 l de caldo de potencia a cada tubo. </li><li> Incubar durante 1 hora en un incubador estático 37 ° C. </li><li> Preparar el LB agar en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, suplementado con 50 mg / ml de carbenicilina y 35 mg / ml de cloranfenicol. Añadir ramnosa a una concentración final de 0,25 mM a los pocillos que contienen Lemo21 (DE3). Nota: Si el producto es probable que sea tóxico los pocillos que contienen C41 (DE3) pLysS se puede complementar con 1% (w / v) de glucosa. </li><li> Transferencia de 30 l de células de la mezcla de transformación sobre las placas de LB agar. Corre y seque la placa como se describe en 1.13 a 1.15. </li></ol> 3. Preparación de cultivos iniciadores durante la noche Nota: Siempre preparar cultivos de la noche el día después de la transformación nunca de una placa de transformación de edad. <ol><li> Añadir 0,7 ml de caldo de potencia a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de pozo profundo suplementado con 50 mg / ml de carbenicilina y 35 mg / ml de cloranfenicol. Añadir ramnosa a los pocillos que contienen Lemo21 (DE3) a una concentración final de 0,25 mM. Opcionalmente, complementar C41 (DE3) pLysS con 1% (w / v) de glucosa; ver más arriba (2,6 de nota). </li><li> Elige una colonia de las placas de transformación durante la noche en cada pocillo. Sellar el bloque con una junta de gas-permeable. </li><li> Agitar el bloque a 250 rpm en una incubadora con una gran banda (por ejemplo, una órbita 25 mm) o al 600 rpm en una incubadora con una pequeña banda (por ejemplo, una órbita 4,3 mm) a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 4. Crecimiento e inducción de las Culturas <ol><li> Añadir 3 ml de caldo de potencia suplementado con 50 mg / ml de carbenicilina y 35 mg / ml de cloranfenicol a cada well de 24 pocillos placa de pozo profundo. Añadir L-ramnosa (y glucosa) como se describe en el apartado 3.1. Usar 3 ml de cultivo para permitir la recolección por duplicado y para permitir cierta evaporación del agua a través del sello permeable al gas. </li><li> Configure los cultivos de expresión mediante la adición de 150 l de Lemo21 (DE3) o C41 (DE3) pLysS cultivos de una noche a cada pocillo de los bloques 24 y pozos profundos. </li><li> Agitar los bloques a 37 ° C hasta que la DO promedio a 595 nm es ~ 0.5 a través de la placa. </li><li> Inducir la expresión mediante la adición de IPTG a los cultivos a una concentración final de 1,0 mM IPTG. </li><li> Cultivar las culturas durante la noche (18-20 h) con agitación a 20 ° C. </li></ol> 5. Análisis de Expresión por In-gel Fluorescencia <ol><li> Cosecha por duplicado. Transferir 1 ml de la cultura de cada pocillo en un pozo cuadrado, fondo cónico, bloque de pozo profundo de 96 pocillos. Nota: Cosecha por duplicado en caso de rotura del bloque o para permitir la prueba de un alternatihe detergente si lo desea. </li><li> Sellar los bloques y recoger las células por centrifugación a 6000 xg durante 10 min. </li><li> Invierta el bloque y decantar los medios de comunicación. Toque en el bloque con cuidado sobre una toalla de papel para drenar residuos de medios. </li><li> Sellar las placas y almacenar a -80 ° C durante un mínimo de 20 min. Opcionalmente, deje el experimento en este punto y el bloque de procesado cuando sea conveniente. </li><li> De-heladas las pastillas durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Utilice una pipeta multicanal o un agitador orbital (1000 rpm durante 10 min) a 4 ° C para resuspender las células completamente en 200 l de tampón de lisis (50 mM NaH 2 PO 4, NaCl 300 mM mM de imidazol 10 1% v / v de Tween 20, ajustar el pH a 8,0 usando NaOH). </li><li> Añadir 20 l de la solución DLPI (20 l ADNasa I (4000 unidades / ml), 20 mg de lisozima, y ​​20 l de cóctel inhibidor de proteasa en un volumen final de 2 ml de agua). Incubar durante 10 min con agitación (~ 1000 rpm) a 4 ° C. </li><li&gt; Añadir 25 l de 10% n dodecil β-D-maltósido (DDM). </li><li> Incubar durante 60 min con agitación (~ 1000 rpm) a 4 ° C. </li><li> Se centrifuga el bloque de pozo profundo a 6.000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Transferencia de 10 l de la lisado aclarado a una placa de microtitulación y añadir 10 l de tampón de carga SDS gel PAGE (Tris 100 mM, pH 6,8, 4% w / v SDS, 0,2% w / v azul de bromofenol, 10% v / v β mercaptoetanol, y 20% v / v de glicerol). PRECAUCIÓN! No hierva el MUESTRA. </li><li> Cargar 10 l de muestra de la etapa 5.11 / pocillo sobre gel SDS PAGE (s) y ejecutar a 100-120 V (voltaje constante) en una habitación fría hasta que el frente de colorante llega a la parte inferior (2-2,5 h). </li><li> Colocar el gel en un generador de imágenes (por ejemplo, con un filtro de luz azul para detectar las proteínas de fusión GFP). Se elige el tiempo de exposición para asegurar que las bandas más brillantes no están saturados. </li></ol> 6. La ampliación de los cultivos celulares <ol><li> Transformar una alícuota de competente <em&gt; E. coli como se describe en la sección 2. </li><li> Elija una colonia en 10 ml de caldo de potencia (complementado como se describe en la sección 3) y crecer durante la noche a 37 ° C. </li><li> Diluir 5 ml del cultivo durante la noche en caldo de potencia 500 ml. </li><li> Crecer con agitación a 250 rpm a 37 ° C hasta que la DO a 595 nm es de ~ 0,5. </li><li> Inducir la expresión mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1,0 mM. </li><li> Crecer durante la noche con agitación a 250 rpm a 20 ° C. </li><li> Cosecha células por centrifugación a 5000 xg durante 15 min. </li><li> Sobrenadante Descartar. Los sedimentos celulares se pueden almacenar a -80 ° C. </li></ol> 7. Preparación de Membranas <ol><li> Descongelar las células (si es necesario) a temperatura ambiente y resuspender en 1x PBS pH 7,5 a un volumen de 5 ml por gramo de sedimento celular; Aumentar el volumen como sea necesario hasta que la viscosidad se reduce a una consistencia líquida. Añadir MgCl 2 a una concentración final de 1 mM, DNAsa I a concentración final de 10 mg / ml y unopre-envasados ​​proteasa tableta de inhibidor por 20 g de sedimento celular. Romper las células abiertas usando un disruptor celular refrigerada a una presión de 30 kpsi. </li><li> Sedimentar las células intactas y los desechos a 30.000 g durante 15 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo de ultra-centrifugación. </li><li> Recoger la fracción de membrana total desacelerándose el sobrenadante en un ultra-centrifugar a 200.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento de membranas en agua helada 10 ml de PBS pH 7,5 usando un homogeneizador celular. Se requiere 1 ml membranas resuspendidas para cada detergente. Opcionalmente, en esta etapa, flash congelar la suspensión de membrana en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. </li></ol> 8. solubilización y Análisis de la fracción de membrana <ol><li> Fracción de membrana deshielo (si es necesario), y para cada detergente a utilizar para la solubilización, alícuotas 900 l de la suspensión de membrana en un 1,5 ml polialómero micro-centrifutubo ge. </li><li> Añadir 100 l de cada detergente recién preparado (10% w / v soluciones de DDM, DM, cimal-6 y LDAO) a una concentración final de 1% al tubo de 1,5 ml especificado. Para la solubilización de proteínas de membrana eucariota hemisuccinato de colesterol (concentración final 0,2%) se puede añadir a los detergentes. </li><li> Incubar las mezclas a 4 ° C durante 1 hora con agitación suave. </li><li> Sedimentar la fracción insoluble detergente con un banco de la parte superior ultra-centrífuga, tubos, lo que garantiza al menos medio lleno, en 150.000 g a 4 ° C durante 45 min y retener sobrenadante. Nota: La eficacia de solubilización de detergente se puede estimar usando un lector de placas fluorescente mediante la medición de la fluorescencia de GFP de las membranas solubilizadas con la fracción insoluble detergente se resuspendieron en el mismo volumen de PBS. </li><li> Analizar el mono-dispersidad de los diferentes detergentes: complejos de proteínas de membrana utilizando cromatografía de exclusión por fluorescencia detectada (FSEC). </li><li> Para el análisis FSEC, equilibrar una columna de exclusión de tamaño con una amplia gama de fraccionamiento, por ejemplo, 5.000 a 5.000.000 de peso molecular, con el funcionamiento de tampón (20 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,03% DDM) a una velocidad de flujo de 0,3 ml / min . Utilice este tampón para todas las muestras, es decir, no se cambia para cada detergente probado. </li><li> Inyectar 100 l de membranas solubilizadas en la columna a un caudal de 0,3 ml / min. Monitorear perfil de elución usando la óptica de fluorescencia (excitación a 488 nm y emisión a 512 nm). Si un monitor de fluorescencia en línea no está disponible, recoger las fracciones y leer la fluorescencia en un lector de placas. </li><li> Volumen de elución de importación y los datos de intensidad de fluorescencia en un programa de hoja de cálculo para la visualización gráfica. </li><li> Analizar restante material de la membrana solubilizada por fluorescencia de gel como se describe en la sección 5. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el protocolo descrito en este artículo, la ligadura de la clonación en un vector independiente reportero GFP se combina con detección de fluorescencia para detectar rápidamente la expresión relativa de múltiples proteínas de la membrana en E. coli. Los vectores se pueden hacer en cuatro días de trabajo con expresión de cribado primario de tomar una semana más. En-gel fluorescencia de lisados ​​detergentes de células enteras se utiliza para clasificar expresión golpea para su posterior análisis en una pantalla secundaria. La pantalla de expresión primaria tal como se presenta no requiere ningún equipo especializado, aparte de un incubador agitador adecuado para el cultivo de células en bloques de pocillos profundos. Todas las otras manipulaciones líquido en la que placas de 96 pocillos SBS puede llevarse a cabo utilizando pipetas multicanal. El protocolo puede modificarse fácilmente para incluir otras cepas de E. coli cultivadas bajo diferentes condiciones de expresión (por ejemplo, temperatura baja). En el caso de la LEMO21 (DE3) titulando el nivel de ramnosa (de 0 a 2,0 mM)añadido para modular la tasa de transcripción puede aumentar el nivel de expresión de algunas proteínas de la membrana 7. Detergentes distintos de DDM podrían ser utilizados para la extracción en la pantalla primaria aunque detergentes más duras pueden solubilizar proteínas a partir de cuerpos de inclusión y por lo tanto dar falsos positivos. Es evidente que la más elaborada la pantalla inicial se convierte, el tiempo del experimento más. La pantalla secundaria implica la preparación de una fracción de membrana total a partir de los éxitos de expresión identificados en la pantalla primaria. Este es un paso crítico, ya que confirmar la localización de las proteínas de fusión a la membrana de la E. células de E. coli. La extracción subsiguiente de la proteína de fusión GFP en diferentes detergentes se controla por el tamaño de cromatografía de exclusión por fluorescencia detectada del material solubilizado para evaluar la mono-dispersidad de los complejos proteína-detergente. Este es otro paso importante, ya que identifica el detergente más adecuado parasolubilización de la proteína de membrana para el procesamiento aguas abajo subsiguiente. Sin embargo, la experiencia demuestra que una mayor optimización de la selección del detergente (s) puede ser necesaria durante la purificación y cristalización. Evidencia de un comportamiento uniforme en diferentes detergentes incluidas las micelas con un tamaño relativamente pequeño (por ejemplo, LDAO) parece ser un buen indicador de la propensión a formar así cristales de difracción por lo menos para las proteínas de membrana procariotas 14. En este sentido, el perfil se muestra para la proteína de la membrana en la Figura 2B aparece altamente favorable. La principal ventaja de utilizar un reportero GFP es que da una rápida lectura de expresión en muestras sin purificar. Una desventaja es que la proteína de fusión GFP tiene que ser eliminado durante la purificación de la proteína para la cristalización. En el caso de los vectores utilizados aquí, un sitio de proteasa 3C de rinovirus permite la escisión de la GFP. Alternativamente, es sencillopara volver a clonar proteínas candidatos, identificados en la pantalla, en vectores que sólo añaden una polihistidina u otro marcador de afinidad para la purificación posterior. Esto supone que la fusión a GFP no es necesaria para la expresión. La principal alternativa al uso de la fusión a GFP para la detección de la expresión de proteína de membrana y solubilización es añadir sólo una etiqueta de histidina. Sin embargo, este enfoque requiere típicamente a partir de una fracción de membrana 15 que para la evaluación de muchas variantes se convertiría consume mucho tiempo. En resumen, el objetivo principal del protocolo descrito en este artículo es para permitir que un gran número de secuencia de la proteína de membrana variantes de ser evaluado rápidamente en términos de expresión y solubilización de detergente y priorizado para el análisis más profundo.

Se ha estimado que las proteínas de membrana representan aproximadamente el 20-30% de los genes codificados en todos los genomas secuenciados 1, incluyendo el genoma humano 2. Dado su papel fundamental en muchos procesos biológicos, por ejemplo, el transporte de metabolitos, generación de energía y como dianas de medicamentos, hay un gran interés en la determinación de su estructura tridimensional. Sin embargo en comparación con las proteínas solubles, proteínas de membrana son muy poco representadas en el Protein Data Bank. De hecho, de las 99.624 estructuras liberadas en el AP ( <a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a> ) sólo 471 ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) se clasifican como proteínas de membrana. Esto refleja las dificultades técnicas de trabajar con proteínas de membrana que se expresan naturalmente en niveles relativamente bajos; rodopsina es una de las pocas excepciones 3,4. La sobreexpresión de la versión recombinantes en células heterólogas a menudo resulta en mal plegamiento y la mala orientación a la membrana que limita el nivel global de producción. Seleccionar el mejor detergente para la extracción y solubilización de una proteína de membrana, una vez expresada hace posterior purificación difícil y requiere la optimización cuidadosa. Escherichia coli sigue siendo el huésped de expresión más comúnmente utilizado para proteínas de membrana que representan el 72% ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) de las estructuras resuelto hasta la fecha, que son casi exclusivamente a partir de fuentes bacterianas. Específico E. cepas de E. coli, C41 (DE3) y C43 (DE3), se han aislado que no conducen a la sobreexpresión de proteínas de la membrana y por lo tanto evitar los efectos de la toxicidad observada en otros BL21 cepas de 5,6. Ajuste del nivel de expresión de proteína de membrana recombinante parece ser crítica para optimizar el nivel de producción de 6,7. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; En muchos casos, la producción exitosa de proteínas de membrana para la determinación de la estructura ha requerido la evaluación de varias versiones incluyendo amino y deleciones carboxi-terminal, múltiples orthologues para explotar variación de la secuencia natural y diferentes proteínas de fusión 6.8. Por lo tanto, un método para la detección expresión de múltiples proteínas de la membrana en paralelo es esencial. Un enfoque comúnmente utilizado es fusionar la proteína a proteína verde fluorescente (GFP) de expresión que permite realizar un seguimiento sin la necesidad de purificar la proteína. De esta manera, la información sobre el nivel de expresión, la estabilidad y el comportamiento en diferentes detergentes se puede evaluar con pequeñas cantidades de material sin purificar 9-12. En este artículo se describe un protocolo eficiente para la detección de clonación y expresión de proteínas de membrana en E. coli usando la fusión de GFP como reportero de la producción y la posterior caracterización de detergente: borrador proteínaReflejos (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>pOPIN-N-GFP</td><td>addgene (www.addgene.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pOPINE-3C-GFP</td><td>addgene (www.addgene.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C41(DE3)pLysS</td><td>Lucigen (http://lucigen.com/)</td><td>60444-1</td><td></td></tr><tr><td>LEMO21(DE3)</td>Sistema de clonación New <td>England Biolabs</td><td>C2528H</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD EcoDry, 96 Rxns</td><td>Clontech/Takara</td><td>639688</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de potencia</td><td>Dimensiones moleculares (http://www.moleculardimensions.com/)</td><td>MD12-106-1</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa comprimidos</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-Free; Cóctel de inhibidores de proteasa&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>L-ramnosa monohidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83650</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>DNAtasa 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>Hemisuccinato de colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6512</td><td></td></tr><tr><td>CYMAL-6 (6-Ciclohexil-1-Hexil-&beta;-D-Maltósido)</td><td>Anatrace</td><td>C326</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Dodecil &beta;-maltósido)</td><td>Generon</td><td>D97002</td><td></td></tr><tr><td>DM (n-Decyl &beta;-maltósido)</td><td>Generon</td><td>D99003</td><td></td></tr><tr><td>LDAO (N,N-Dimetil-n-dodecilamina N-óxido)Generon</td><td></td> <td>D71111</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip Eq384 8&nbsp; canal 1-30 y micro; l</td><td>Termo Científico&nbsp;</td><td></td><td></td>4672030</tr><tr><td>Pipeta Rainin Pipet-Lite XLS 6ch 100-1.200 &micro; l LTS Espaciador</td><td>Anachem</td><td>LA6-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Rainin Light XLS+ 8ch 2-20 &micro; l LTS</td><td>Anachem</td><td>L8-20XLSPLUS</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 y micro; l LTS Tip</td><td>Anachem</td><td>L8-1200XLS</td> 24 pocillos <td></td></tr><tr><td>V fondo pozos profundos</td> bloques <td>de pozos Porvair sciences</td><td>360115</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5928</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 pocillos</td><td>Life Technologies</td><td>WG1203BOX</td><td></td></tr><tr><td>XCell4 SureLock Midi-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>Vibramax 100</td><td>Heidolph</td><td>544-21200-00</td><td></td></tr><tr><td>Accesorio de rodillos tensores</td><td>Heidolph</td><td>549-81000-00</td><td></td></tr><tr><td>ptima L-100 Ultracentrífuga con rotor 45-Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP con rotor TLA-55</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de pie, Avanti J-26S XPI con JA-17 y rotores JS-5.3&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14535</td><td></td></tr><tr><td>Prominence UFLC con RF-20A Detector de fluorescencia</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 6 10/300 GL columna de exclusión de tamaño</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SSI5R-HS SHEL LAB Incubadora de agitación modelo de piso, 5 pies cúbicos (144&nbsp; L), 30-850 rpm</td><td>Shel Lab&nbsp;</td><td>SSI5R-HS</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Innova44R</td><td>New Brunswick /Eppendorf</td><td>Innova44R</td><td></td></tr><tr><td>Serie TS 0,75 kW Disruptor 230 V 50 Hz 1&nbsp; PH (40 kpsi)</td><td>Sistemas constantes</td><td>PL083016</td><td></td></tr><tr><td>L-Ramnosa monohidrato</td><td>Sigma</td><td>83650</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescente verde a base de proteína expresión proyección de proteínas de membrana en<em&gt; escherichia coli</em

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

La producción de proteínas de membrana recombinantes para estudios estructurales y funcionales sigue siendo técnicamente difícil debido a los bajos niveles de expresión y la inestabilidad inherente de muchas proteínas de la membrana una vez solubilizado en detergentes. Un protocolo se describe que combina la ligadura de la clonación independiente de proteínas de membrana como fusiones de GFP con la expresión en Escherichia coli detectadas por fluorescencia de GFP. Esto permite la detección de la construcción y expresión de la proteína de la membrana múltiple / variantes para identificar candidatos adecuados para una mayor inversión de tiempo y esfuerzo. El reportero GFP se utiliza en una pantalla primaria de expresión mediante la visualización de la fluorescencia de GFP después de la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). Las proteínas de membrana que muestran tanto un alto nivel de expresión con un mínimo de degradación como se indica por la ausencia de GFP libre, se seleccionan para una pantalla secundaria. Estas construcciones se escalan y una fracción total de membrana preparada y solubilizard en cuatro detergentes diferentes. Después de la ultracentrifugación para eliminar el material insoluble en detergente, los lisados ​​se analizaron por cromatografía de exclusión de tamaño de detección de fluorescencia (FSEC). Monitorización del perfil de exclusión de tamaño por la fluorescencia de GFP proporciona información sobre el mono-dispersidad y la integridad de las proteínas de membrana en diferentes detergentes. Proteína: combinaciones de detergente que eluyen con un pico simétrico con poca o ninguna libre de GFP y la agregación mínima son candidatos para la posterior purificación. Utilizando la metodología anterior, la expresión heteróloga en E. Se analizó coli de SED (forma, el alargamiento, la división y la esporulación) proteínas de 47 especies diferentes de bacterias. Estas proteínas tienen típicamente diez dominios transmembrana y son esenciales para la división celular. Los resultados muestran que la producción de los SED orthologues en E. coli fue muy variable con respecto a los niveles de expresión y la integridad de las proteínas de fusión GFP. El i experimentodentified un subconjunto para una mayor investigación.

La familia SEDS de proteínas (forma, elongación, división, y esporulación) es esencial para la división celular bacteriana. Estas proteínas integrales tienen típicamente diez dominios transmembrana con ambos extremos amino y carboxilo dentro de la célula. Para ejemplificar el protocolo descrito anteriormente, 47 SED orthologues se clonaron en el vector pOPINE-3C-eGFP. Una pantalla de expresión a pequeña escala de las construcciones se llevó a cabo en dos cepas .coli E, Lemo21 (DE3) cultivadas en la presencia de 0.25 mM ramnosa para bloquear la expresión fugas y C41 (DE3) pLysS, que se utilizan de forma rutinaria para la expresión de membrana proteínas 5-8. Solubilizados con detergente lisados ​​de cultivos inducidos se analizaron mediante electroforesis en SDS-poliacrilamida. El uso de la fluorescencia en gel para visualizar proteínas de fusión GFP expresadas mostraron que se produjeron entre las dos cepas 38 de los 47 SED construcciones. Curiosamente hubo diferencias entre las dos cepas de expresión. De los 38 expresaron construcciones, sólo 18 fueron producidos en ambas cepas, 14 sólo se expresa en Lemo21 (DE3) y 6 sólo en C41 (DE3) pLysS. En general, hubo una mayor tasa de éxito para la Lemo21 (DE3) en comparación con el pLysS C41 (DE3) (38 vs 24). Sin embargo, la observación de que algunas proteínas parecen ser específicos cepa significa que el cribado en tanto es útil. Los datos representativos para 24 de los 47 SEDs constructos se muestran en la Figura 1. La intensidad de las bandas da una indicación del nivel de expresión, por ejemplo, la proteína de fusión en C4 bien en la figura 1A y 1B se expresa bien en ambas cepas sin embargo, la adicional bandas de menor peso molecular sugieren que la proteína es parcialmente degradada. En muchos carriles hay una banda que corresponde en tamaño a GFP solo. Una evaluación cualitativa de la integridad de la proteína puede llevarse a cabo mirando a la intensidad de la proteína de fusión con respecto a la GFP libre;por ejemplo, G4 y H4 están completamente descompuestos a GFP libre en C41 (DE3) pLysS (Figura 1B), mientras que en el Lemo21 (DE3) hay algo de proteína intacta (Figura 1). Para 14 de los 38 proteínas expresadas de la intensidad de la banda de GFP libre es similar a la de la proteína de fusión, para 21 la intensidad de la banda de GFP libre es mayor que la de la proteína de fusión y una minoría de las proteínas de fusión (3 / 38 expresado), por ejemplo F6 y G6 en la Figura 1A tener relativamente poco GFP libre en comparación con la proteína de fusión. Dos de las construcciones que expresan bien en los B5 pantalla principal (bandas de alta intensidad para GFP libre y proteínas de fusión) y G6 (poco libre GFP) se expresaron y una fracción total de la membrana preparada a partir de la cultura ml celular 500. Membranas resuspendidas se dividen en alícuotas y se analizaron mediante cromatografía de exclusión por fluorescencia detectada (FSEC). Los perfiles FSEC se presentan en la Figure 2A y 2B, respectivamente, y muestran que las dos proteínas SED comportan de manera diferente en los cuatro detergentes ensayados. En un caso (Figura 2A: muestra B5) la proteína sólo dio un pico simétrico con poca agregación en DDM que sería por lo tanto el detergente de elección para la posterior purificación. Por el contrario la otra proteína de fusión (Figura 2B: muestra G6) dio un perfil similar en todos los detergentes probados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" /> Figura 1: Diagrama de flujo de trabajo para el cribado de la membrana expresión de la proteína en E. coli usando un reportero GFP. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" /> Figura 2: Pantalla primaria de expresión de proteínas de membrana mediante fluorescencia en gel. </strong&gt; lisados ​​detergentes de E. coli células fueron analizadas por SDS-PAGE y geles imágenes utilizando azul Epi iluminación y un filtro 530/28. Los resultados se muestran para 24 constructos etiquetados (A4-H6 basado en su posición en una placa de 96 pocillos). Las posiciones de las bandas para GFP y libre de proteínas de fusión GFP se indican. (A) las proteínas expresadas en Lemo21 (DE3). (B) Las proteínas expresadas en C41 (DE3) pLysS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Pantalla secundaria de la membrana de expresión de la proteína usando cromatografía de exclusión de tamaño de la fluorescencia detectada (FSEC) fracciones de membrana total se extrajeron en cuatro detergentes diferentes y las proteínas de membrana solubilizadas se analizó por cromatografía de exclusión por tamaño usando un sistema de FPLC acoplado a un detector de fluorescencia. Perfiles FSEC para (A) B5 proteína de membrana y (B) </strong&gt; G6 proteína de membrana. La posición de los picos correspondientes a la proteína agregada, solubilizado proteína de fusión GFP y GFP libre se indican. Los detergentes ensayados se indican debajo de los perfiles.

Se presenta un método simplificado para la detección de la expresión de proteínas de membrana recombinantes en Escherichia coli basada en la fusión a la proteína verde fluorescente.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar proteínas de membrana expresadas en SIA coli para análisis estructurales y funcionales. Primero, las bacterias se cosechan, lisaron y analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS para la visualización de las proteínas GFP correctamente plegadas mediante fluorescencia en gel. En el segundo paso, la producción de la e coli determinada para expresar las proteínas de membrana de interés se amplía y se prepara una fracción total de membranas a partir de las células tras la inducción de la expresión proteica.Finalmente, la fracción de membrana total se solubiliza en cuatro detergentes diferentes y se analiza la monodispersidad de las proteínas GFP solubilizadas con detergentes mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En última instancia, las proteínas se pueden monitorear mediante fluorescencia y los perfiles de elución se grafican para evaluar la agregación, la monodispersidad y la presencia de GFP libre en las muestras.La producción de proteínas de membrana recombinantes para estudios estructurales y funcionales sigue siendo técnicamente difícil debido a su baja solubilidad y a su inestabilidad inherente una vez extraídas en detergentes. La experiencia ha demostrado que el análisis de múltiples variantes de proteínas de membrana, como ortólogos de diferentes especies, puede mejorar la tasa de éxito en la expresión de proteínas de membrana. La fusión con proteínas verdes fluorescentes se utiliza para informar sobre el plegamiento auténtico.El primer paso en nuestro protocolo basado en GFP para la selección de expresión de proteínas de membrana y E. coli utiliza la fluorescencia en gel de lisados con detergentes a partir de células completas para identificar los constructos de proteínas de membrana para análisis posteriores, basándose en el nivel de expresión en la prueba. A continuación, se evalúa el comportamiento de las proteínas de membrana con diferentes detergentes mediante detección de fluorescencia acoplada a cromatografía de exclusión por tamaño. Esto proporciona información sobre la monodispersidad de los complejos proteína-detergente. Para analizar la expresión bacteriana inducida por IPTG, comience transfiriendo un mililitro de cultivo de E. coli tratado con IPTG en duplicado desde placas de cultivo nocturno de 24 pozos profundos a placas de 96 pozos profundos, selle las placas y luego centrifugue las células durante 10 minutos a 6.000 × g a temperatura ambiente.Posteriormente, invierta el bloque para decantar el medio, golpeando suavemente sobre una toalla de papel para drenar cualquier líquido restante. Vuelva a sellar la placa y almacene las células a menos 80 grados Celsius durante al menos 20 minutos. Desele las pastillas durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego use una pipeta multicanal para resuspender completamente las células en 200 microlitros de tampón de lisis.Trate las células con 20 microlitros de solución DLPI agitando a 1000 RPM y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Luego, agregue 25 microlitros de doda multiside al 10 % a cada pocillo e incube las células durante otros 60 minutos con agitación. Después del tratamiento con DDM, centrifugue el bloque de pocillos profundos y luego transfiera 10 microlitros del lisado clarificado a una placa de microtitulación y agregue 10 microlitros de tampón de carga para geles SDS-PAGE.Ahora cargue el gel con 10 microlitros de la solución tampón de lisado por pocillo y corra el gel a voltaje constante entre 100 y 120 voltios en una cámara fría durante dos a 2,5 horas, cuando el diafragma alcance la parte inferior. Coloque el gel sobre un sistema de imagen con filtro de luz azul para detectar las proteínas de fusión y escalar las culturas celulares. Después de transformar un Eloqua de E. coli competente, seleccione una colonia e introdúzcala en 10 mililitros de caldo power para crecimiento nocturno a 37 grados Celsius.La mañana siguiente, diluya cinco mililitros de la cultivo nocturno en 500 mililitros de caldo power y continúe cultivando las muestras con agitación a 250 RPM y 37 grados Celsius. Cuando la DO a 595 nanómetros sea aproximadamente 0,5, induzca la expresión añadiendo IPTG hasta una concentración final de un milimolar, y luego coloque el cultivo de nuevo en el agitador durante la noche, esta vez a 20 grados Celsius. La mañana siguiente, recoja las células por centrifugación y almacene los pellet a menos 80 grados Celsius.Para preparar las membranas celulares, re suspenda los terceros pellet a temperatura ambiente en cinco mililitros de PBS por gramo de pellet celular, aumentando el volumen según sea necesario hasta que la viscosidad disminuya a una consistencia fluida. Luego, añada cloruro de magnesio hasta una concentración final de un milimolar, ADN hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro y una tableta de inhibidor de proteasas preempaquetada por cada 20 gramos de pellet celular a las células.A continuación, rompa las células utilizando un disruptor celular enfriado a una presión de 30 KPSI y luego centrifugue para obtener el pellet de células no rotas y restos celulares durante 15 minutos a 30.000 ×g y cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga y recoja la fracción total de membranas centrifugando el sobrenadante durante una hora a 200.000 ×g y cuatro grados Celsius. A continuación, use el homogenizador celular para resuspender el pellet de membranas en 10 mililitros de PBS frío con hielo, con el fin de solubilizar las membranas para cada detergente que se vaya a utilizar.Aliquotar 900 microlitros de la suspensión de membranas en un tubo de centrífuga de polipropileno de 1,5 mililitro. A continuación, añadir 100 microlitros de cada detergente recién preparado a los tubos de 1,5 mililitros correspondientes e incubar las mezclas a cuatro grados Celsius con agitación suave. Tras una hora, centrifugar para obtener el pellet de las fracciones detergente y soluble mediante una ultracentrífuga de sobremesa, asegurándose de que los tubos estén al menos medio llenos, y conservar el sobrenadante para análisis por cromatografía de exclusión por tamaño con detección de fluorescencia o análisis FEC.A continuación, utilice una columna de exclusión por tamaño de rango fraccionador amplio con tampón de flujo a una velocidad de 0,3 mililitros por minuto. Luego, inyecte 100 microlitros de una muestra de membrana solubilizada en la columna a la misma velocidad de flujo y supervise el perfil de elución mediante óptica de fluorescencia. Finalmente, importe los datos de volumen de elución e intensidad de fluorescencia a un programa de hoja de cálculo para su representación gráfica y analice el material de membrana solubilizado restante mediante fluorescencia en gel.Como se demostró anteriormente, la familia mencionada de proteínas es esencial para la división celular bacteriana. En estas imágenes, se muestra una representación de la visualización por fluorescencia en gel de 24 de los 47 constructos mencionados. La intensidad de las bandas da una indicación del nivel de expresión.Por ejemplo, la proteína de fusión en la banda escena cuatro se expresa bien en ambas cepas. Sin embargo, las bandas adicionales de menor peso molecular sugieren que la proteína está parcialmente degradada en muchas bandas. Hay una banda que corresponde en tamaño a GFP solo.Por ejemplo, G cuatro y H cuatro se descomponen completamente en GFP libre en la cepa C 41 DE tres P lys S. En cambio, en la LEMO 21 DE tres, hay algo de proteína intacta en estos gráficos. El análisis de dos constructos que tuvieron buen desempeño en la pantalla primaria mediante exclusión por tamaño con detección de fluorescencia demuestra cómo las proteínas se comportan de manera diferente dependiendo de cuál de los cuatro detergentes se probó.Por ejemplo, esta proteína produjo solo un pico simétrico sin agregación en Dool Multiside, lo que lo convierte en el detergente de elección para la purificación subsiguiente. En contraste, la otra proteína de fusión exhibió un perfil similar en todos los detergentes probados. Este protocolo puede ampliarse fácilmente para incluir, por ejemplo, diferentes cepas de e coli cultivadas bajo distintas condiciones de expresión y detergentes adicionales tanto en las pantallas primarias como secundarias.En resumen, el objetivo principal de este protocolo es permitir la evaluación de un gran número de proteínas de membrana en cuanto a su expresión y solubilización con detergentes, con el fin de identificar candidatos para análisis posteriores.

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Biología

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