Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en

El objetivo general de este procedimiento es identificar proteínas de membrana expresadas en SIA coli para análisis estructurales y funcionales. Primero, las bacterias se cosechan, lisaron y analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS para la visualización de las proteínas GFP correctamente plegadas mediante fluorescencia en gel. En el segundo paso, la producción de la e coli determinada para expresar las proteínas de membrana de interés se amplía y se prepara una fracción total de membranas a partir de las células tras la inducción de la expresión proteica.

Finalmente, la fracción de membrana total se solubiliza en cuatro detergentes diferentes y se analiza la monodispersidad de las proteínas GFP solubilizadas con detergentes mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En última instancia, las proteínas se pueden monitorear mediante fluorescencia y los perfiles de elución se grafican para evaluar la agregación, la monodispersidad y la presencia de GFP libre en las muestras.

La producción de proteínas de membrana recombinantes para estudios estructurales y funcionales sigue siendo técnicamente difícil debido a su baja solubilidad y a su inestabilidad inherente una vez extraídas en detergentes. La experiencia ha demostrado que el análisis de múltiples variantes de proteínas de membrana, como ortólogos de diferentes especies, puede mejorar la tasa de éxito en la expresión de proteínas de membrana. La fusión con proteínas verdes fluorescentes se utiliza para informar sobre el plegamiento auténtico.

El primer paso en nuestro protocolo basado en GFP para la selección de expresión de proteínas de membrana y E. coli utiliza la fluorescencia en gel de lisados con detergentes a partir de células completas para identificar los constructos de proteínas de membrana para análisis posteriores, basándose en el nivel de expresión en la prueba. A continuación, se evalúa el comportamiento de las proteínas de membrana con diferentes detergentes mediante detección de fluorescencia acoplada a cromatografía de exclusión por tamaño. Esto proporciona información sobre la monodispersidad de los complejos proteína-detergente. Para analizar la expresión bacteriana inducida por IPTG, comience transfiriendo un mililitro de cultivo de E. coli tratado con IPTG en duplicado desde placas de cultivo nocturno de 24 pozos profundos a placas de 96 pozos profundos, selle las placas y luego centrifugue las células durante 10 minutos a 6.000 × g a temperatura ambiente.

Posteriormente, invierta el bloque para decantar el medio, golpeando suavemente sobre una toalla de papel para drenar cualquier líquido restante. Vuelva a sellar la placa y almacene las células a menos 80 grados Celsius durante al menos 20 minutos. Desele las pastillas durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego use una pipeta multicanal para resuspender completamente las células en 200 microlitros de tampón de lisis.

Trate las células con 20 microlitros de solución DLPI agitando a 1000 RPM y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Luego, agregue 25 microlitros de doda multiside al 10 % a cada pocillo e incube las células durante otros 60 minutos con agitación. Después del tratamiento con DDM, centrifugue el bloque de pocillos profundos y luego transfiera 10 microlitros del lisado clarificado a una placa de microtitulación y agregue 10 microlitros de tampón de carga para geles SDS-PAGE.

Ahora cargue el gel con 10 microlitros de la solución tampón de lisado por pocillo y corra el gel a voltaje constante entre 100 y 120 voltios en una cámara fría durante dos a 2,5 horas, cuando el diafragma alcance la parte inferior. Coloque el gel sobre un sistema de imagen con filtro de luz azul para detectar las proteínas de fusión y escalar las culturas celulares. Después de transformar un Eloqua de E. coli competente, seleccione una colonia e introdúzcala en 10 mililitros de caldo power para crecimiento nocturno a 37 grados Celsius.

La mañana siguiente, diluya cinco mililitros de la cultivo nocturno en 500 mililitros de caldo power y continúe cultivando las muestras con agitación a 250 RPM y 37 grados Celsius. Cuando la DO a 595 nanómetros sea aproximadamente 0,5, induzca la expresión añadiendo IPTG hasta una concentración final de un milimolar, y luego coloque el cultivo de nuevo en el agitador durante la noche, esta vez a 20 grados Celsius. La mañana siguiente, recoja las células por centrifugación y almacene los pellet a menos 80 grados Celsius.

Para preparar las membranas celulares, re suspenda los terceros pellet a temperatura ambiente en cinco mililitros de PBS por gramo de pellet celular, aumentando el volumen según sea necesario hasta que la viscosidad disminuya a una consistencia fluida. Luego, añada cloruro de magnesio hasta una concentración final de un milimolar, ADN hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro y una tableta de inhibidor de proteasas preempaquetada por cada 20 gramos de pellet celular a las células.

A continuación, rompa las células utilizando un disruptor celular enfriado a una presión de 30 KPSI y luego centrifugue para obtener el pellet de células no rotas y restos celulares durante 15 minutos a 30.000 ×g y cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga y recoja la fracción total de membranas centrifugando el sobrenadante durante una hora a 200.000 ×g y cuatro grados Celsius. A continuación, use el homogenizador celular para resuspender el pellet de membranas en 10 mililitros de PBS frío con hielo, con el fin de solubilizar las membranas para cada detergente que se vaya a utilizar.

Aliquotar 900 microlitros de la suspensión de membranas en un tubo de centrífuga de polipropileno de 1,5 mililitro. A continuación, añadir 100 microlitros de cada detergente recién preparado a los tubos de 1,5 mililitros correspondientes e incubar las mezclas a cuatro grados Celsius con agitación suave. Tras una hora, centrifugar para obtener el pellet de las fracciones detergente y soluble mediante una ultracentrífuga de sobremesa, asegurándose de que los tubos estén al menos medio llenos, y conservar el sobrenadante para análisis por cromatografía de exclusión por tamaño con detección de fluorescencia o análisis FEC.

A continuación, utilice una columna de exclusión por tamaño de rango fraccionador amplio con tampón de flujo a una velocidad de 0,3 mililitros por minuto. Luego, inyecte 100 microlitros de una muestra de membrana solubilizada en la columna a la misma velocidad de flujo y supervise el perfil de elución mediante óptica de fluorescencia. Finalmente, importe los datos de volumen de elución e intensidad de fluorescencia a un programa de hoja de cálculo para su representación gráfica y analice el material de membrana solubilizado restante mediante fluorescencia en gel.

Como se demostró anteriormente, la familia mencionada de proteínas es esencial para la división celular bacteriana. En estas imágenes, se muestra una representación de la visualización por fluorescencia en gel de 24 de los 47 constructos mencionados. La intensidad de las bandas da una indicación del nivel de expresión.

Por ejemplo, la proteína de fusión en la banda escena cuatro se expresa bien en ambas cepas. Sin embargo, las bandas adicionales de menor peso molecular sugieren que la proteína está parcialmente degradada en muchas bandas. Hay una banda que corresponde en tamaño a GFP solo.

Por ejemplo, G cuatro y H cuatro se descomponen completamente en GFP libre en la cepa C 41 DE tres P lys S. En cambio, en la LEMO 21 DE tres, hay algo de proteína intacta en estos gráficos. El análisis de dos constructos que tuvieron buen desempeño en la pantalla primaria mediante exclusión por tamaño con detección de fluorescencia demuestra cómo las proteínas se comportan de manera diferente dependiendo de cuál de los cuatro detergentes se probó.

Por ejemplo, esta proteína produjo solo un pico simétrico sin agregación en Dool Multiside, lo que lo convierte en el detergente de elección para la purificación subsiguiente. En contraste, la otra proteína de fusión exhibió un perfil similar en todos los detergentes probados. Este protocolo puede ampliarse fácilmente para incluir, por ejemplo, diferentes cepas de e coli cultivadas bajo distintas condiciones de expresión y detergentes adicionales tanto en las pantallas primarias como secundarias.

En resumen, el objetivo principal de este protocolo es permitir la evaluación de un gran número de proteínas de membrana en cuanto a su expresión y solubilización con detergentes, con el fin de identificar candidatos para análisis posteriores.