Name: A-crítico tamaño femoral Defecto sencillo modelo en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a crear defectos óseos de tamaño crítico en fémur de ratón usando pines medulares de acero quirúrgico. Este método simplificado permite evaluar la cicatrización ósea mediante radiografía e histología.

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Damos las gracias al personal y los veterinarios en el Departamento de Medicina Comparada, Temple, Texas Scott &amp; White Hospital, por su asesoramiento y ayuda inestimable durante el desarrollo de esta técnica. Este trabajo fue financiado en parte por el Instituto de Medicina Regenerativa de fondos del programa, Scott &amp; White RGP subvención # 90172, NIH 2P40RR017447-07 y NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Se agradece al Dr. Suzanne Zeitouni para las pruebas del manuscrito.

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Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

En este documento, se describe un método simple para generar un defecto crítico tamaño pin-estabilizada del fémur murino utilizando estándar de laboratorio y equipo veterinario. Mientras que el montaje de los pasadores y el procedimiento quirúrgico en sí mismo requiere práctica, está dentro de las capacidades de un científico de investigación biomédica bien entrenado o veterinario. El pasador se coloca en el canal medular sin fijación adicional, haciendo que el procedimiento técnicamente más...

Se estima que la mitad de la población de Estados Unidos experimenta una fractura por la edad de 65 años 1. Para los pacientes con fracturas tratadas quirúrgicamente, 500.000 procedimientos implican el uso de un injerto de hueso 2 y se espera que esta cifra aumente con una población cada vez más envejecida 3 . Aunque el hueso es uno de los pocos órganos que tiene la capacidad para sanar completamente sin dejar cicatriz, hay casos en que el proceso falla 3,4. Dependiendo de las circunstancias y la calidad del tratamiento, 30.2% de las fracturas de huesos largos fallar, lo que resulta en la no unión 3,5. Si bien sigue habiendo cierto debate sobre la definición, pseudoartrosis, lesiones óseas críticos de tamaño o no sindicalizados generalmente se refiere a una lesión que no sana durante toda la vida natural de la materia 6. Para fines experimentales, esta duración se acorta el tiempo promedio requerido para la curación completa de una lesión de tamaño medio hueso. Lesiones óseas no sindicalizados se producen por numrazones erous, pero los principales factores incluyen trauma extremo que resulta en una brecha crítica de tamaño, infección, mala angiogénesis, el consumo de tabaco, o la capacidad de regeneración ósea inhibida debido a la enfermedad o la edad de 7 años. Incluso si no uniones son tratados con éxito, puede costar más de $ 60,000 por procedimiento, dependiendo del tipo de lesión y los enfoques utilizados 8. En casos moderados, se emplea un injerto óseo autólogo. Esta estrategia implica la recuperación del hueso de un sitio donante y la implantación en el sitio de la lesión. Si bien este enfoque es extremadamente eficaz, el volumen de hueso derivado del donante disponible es limitada y el procedimiento implica una cirugía adicional, que se traduce en dolor persistente en muchos pacientes 9,10. Además, la eficacia del injerto de hueso autólogo es dependiente de la salud del paciente. Los sustitutos óseos fabricados con materiales sintéticos o hueso de cadáver procesados ​​son abundantemente disponibles 11-13, pero HÃve limitaciones significativas, incluyendo las propiedades pobres de adhesión de la célula huésped, la reducción de osteoconductividad, y el potencial para el rechazo inmune 14. Por tanto, existe una necesidad urgente de tecnologías de regeneración ósea que son seguros, eficaces y ampliamente disponibles. Nuestra capacidad para mejorar las estrategias de regeneración de hueso depende fundamentalmente de la capacidad de imitar traumatismo óseo grave en animales de laboratorio, pero la generación y la estabilización de las lesiones óseas grandes es técnicamente difícil. En la mayoría de los casos, grave trauma hueso largo es imitado experimentalmente mediante el establecimiento de un defecto que no se cura de forma natural. Aunque puede variar con la especie 15, esto se logra mediante la eliminación completa de un segmento de hueso que es mayor que 1,5 veces el diámetro de la sección transversal del hueso 16. El hueso se estabiliza luego con un implante metálico para mantener la orientación correcta de los bordes de la fractura y permitir la movilidad. Debido a su pequeño tamaño y la fragilidad desus huesos largos, el establecimiento de este tipo de lesiones en los ratones están más allá de las capacidades de la mayoría de los grupos de investigación. Como tal, los modelos de defectos de huesos largos se limitan a ratas y animales más grandes. Sin embargo, los ratones ofrecen ventajas significativas en investigación que pueden ser modificados y criados como cepas inmunocomprometidos que no rechazan las células y tejidos humanos genéticamente. Para las aplicaciones basadas en células humanas, los ratones inmunodeprimidos son atractivas para trabajar con ellos porque son fisiológicamente bien caracterizados, fácil de casa, rentables y de fácil analizaron radiográfica como microscópicamente. De suma importancia es que los ratones inmunodeprimidos no rechazan las células de diferentes especies, incluyendo los seres humanos. Su pequeño tamaño también permite el ensayo de un número muy pequeño de células o volúmenes de andamios experimentales en aplicaciones ortopédicas. Se han descrito varios modelos murinos ortopédicos que permitirse diversos grados de estabilidad ósea 17,18. Aquellos systems que resultan en niveles muy altos de estabilidad, tales como fijadores externos y las placas de bloqueo se curan predominantemente por la osificación endocondral intramembranous aunque la curación ha sido reportado 19. Por el contrario, las que permiten algunos micro y / o macro-movimiento, como las que emplean pasadores medulares no fijadas o parcialmente fijos, por lo general se curan con un predominio de la osificación endocondral 20,21. Unión retardada o defectos no sindicalizados de los huesos largos son particularmente difíciles de lograr en los ratones debido al nivel adicional de estabilización requerida. Sin embargo, se ha informado de una serie de enfoques, incluyendo pasadores medulares con clavos entrelazados, placas de bloqueo y fijadores externos 22. Estos sistemas generalmente funcionan bien, pero teniendo en cuenta su diseño complicado que puede ser técnicamente difícil de instalar. Por ejemplo, García et al. 23 ideó un sistema de pasador de enclavamiento elegante para su uso en ratones, pero el procedimiento implica incisiones en dos sitios separadoss y una amplia modificación del fémur para acomodar los pasadores. Estos procedimientos se realizaron bajo un microscopio de disección. En este documento, se describe un sencillo pasador medular femoral con un collar central diseñado para evitar el cierre de un déficit óseo 3 mm y también delinear los bordes originales del defecto. Mientras que el pasador no se fija en el hueso, el tamaño preciso de pasador y el diámetro de escariado de los resultados cavidad medular en la interferencia suficiente para minimizar el movimiento de torsión (Figura 1). Con una cuidadosa selección de edad endogámica, género y ratones de la cepa emparejados, el resultado es un no-uniondefect hipertrófica altamente reproducible 22 que puede ser fácilmente evaluada radiológicamente. Además regiones de interés pueden ser definidos de forma reproducible después de micro-tomografía computarizada (μCT) para la medición de la formación de hueso de novo y los parámetros histomorphological. Los pasadores se prototipos en nuestro laboratorio utilizando herramientas disponibles.<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig1highres.jpg" /> Figura 1: Principio Experimental resumen esquemática del modelo de defecto segmentario.. El segmento central 3 mm de un fémur murino 9-10 mm se extirpa quirúrgicamente (izquierda). Un tubo de acero quirúrgico de calibre 19 de 3 mm de largo se pasa más de un 9 mm de largo, 22 G tubo de acero inoxidable y se fija con adhesivo en el centro exacto (derecha). El pasador resultante se encaja en los canales medulares de las porciones proximal y distal restantes del fémur con el collar 19 G sustituyendo el segmento de 3 mm de hueso (por debajo de, centro).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Conjunto de pines</fuerte></td></tr><tr><td>Herramienta rotativa Dremel</td><td>8220</td><td>o equivalente</td><td></td></tr><tr><td>Disco de corte de alta resistencia</td><td>Dremel</td><td>420</td> Tubo quirúrgico Dremel 420 <td></td></tr><tr><td>19&nbsp; G</td><td>Piezas pequeñas (Amazon)</td><td>B000FMZ8LY</td><td>OD 1.07&nbsp; mm, ID 0.889&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Tubo quirúrgico 21&nbsp; G</td><td>Piezas pequeñas (Amazon)</td><td>B000FMZ8YQ</td><td>OD 0.82&nbsp; mm, ID 0.635&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Tubo quirúrgico 22&nbsp; G</td><td>Piezas pequeñas (Amazon)</td><td>B000FMYLZS</td><td>OD 0.719&nbsp; mm, ID 0.502&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Tubo quirúrgico 23&nbsp; G</td><td>Piezas pequeñas (Amazon)</td><td>B000FN0SY0</td><td>OD 0,643&nbsp; mm, ID 0.444&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Adhesivo de cianoacrilato</td><td>Loctite 1365882</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disco de esmeril</td><td>Dremel</td><td>413</td><td></td></tr><tr><td>Punta de pulido de goma</td><td>Dremel</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Disco de pulido de fieltro</td><td>Dremel</td><td>414</td><td></td></tr><tr><td>Esponja de gelatina</td><td>Surgifoam/Ethicon</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de biopsia con punzón</td><td>Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cirugía/postoperatorio</fuerte></td></tr><tr><td>Bomba circuladora y almohadilla caliente</td><td>Stryker/Thermocare</td><td>TP700, TP700C, TPP722</td><td></td></tr><tr><td>Spray cuaternario de cobertura</td><td>Steris</td><td>1429-77</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas</td><td>Germinator/CellPoint Scentific Germinator</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia</td><td>VetEquip Inc</td><td>901806 o 901807/901809</td><td></td></tr><tr><td>Anestésico isofluorano</td><td>VETone/MWI</td><td>501017, 502017</td><td></td></tr><tr><td>Desinfectante quirúrgico</td><td>Chloraprep/CareFusion</td><td>260449</td><td></td></tr><tr><td>Herramientas quirúrgicas</td><td>Fine Science Tools</td><td>varios</td><td>recomiendan Fabricación alemana</td></tr><tr><td>Protección facial</td><td>Splash Shield</td><td>4505</td><td></td></tr><tr><td>Taladro de alta velocidad recargable</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td></td></tr><tr><td>Disco de corte de diamante</td><td>Strauss Diaiond</td><td>361.514.080HP</td><td></td></tr><tr><td>Suturas absorbibles&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>UM-213</td><td></td></tr><tr><td>Suturas exteriores</td><td>Ethicon</td><td>668G</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Gel de hidratación</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-1082</td><td></td></tr><tr><td>Gel dietético</td><td>Clear H2O</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Reckitt and Benckser</td><td>12496-0757-01</td><td>sustancia controlada</td></tr><tr><td>Iglús de ratón</td><td>Bio Serv</td><td>K3328, 3570,3327</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de eutanasia</td><td>Euthasol/Virbac</td><td>710101</td><td>sustancia</td></tr><tr> controlada<td colspan="4">Análisis</td></tr><tr><td>Imágenes de animales vivos&nbsp;</td><td>Orthoscan</td><td>FD Pulse</td><td>o unidad Micro-CT equivalente</td></tr><tr><td>y software</td><td>Bruker</td><td>Skyscan1174</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Película de sellado/Parafilm M</td><td>VWR o Fisher</td><td>100501-338, S37441</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Las fuentes genéricas son adecuadas para todos los demás artículos, como gasas, cortinas, ropa de protección, equipos de cuidado de animales.</td></tr></tbody></table>

a-crítico tamaño femoral defecto sencillo modelo en ratones

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

Si bien el hueso tiene una notable capacidad de regeneración, un traumatismo óseo grave a menudo resulta en daños que no se curan adecuadamente. De hecho, una décima parte de todas las fracturas óseas de las extremidades no se curan por completo debido a la extensión del traumatismo, la enfermedad o la edad del paciente. Nuestra capacidad para mejorar las estrategias de regeneración ósea depende fundamentalmente de la capacidad de imitar un traumatismo óseo grave en animales de experimentación, pero la generación y estabilización de lesiones óseas grandes es un desafío técnico. En la mayoría de los casos, el traumatismo grave de huesos largos se imita experimentalmente mediante el establecimiento de un defecto que no se curará de forma natural. Esto se logra mediante la extirpación completa de un segmento óseo que es mayor de 1,5 veces el diámetro de la sección transversal del hueso. Luego, el hueso se estabiliza con un implante de metal para mantener la orientación adecuada de los bordes de la fractura y permitir la movilidad. 
Debido a su pequeño tamaño y a la fragilidad de sus huesos largos, el establecimiento de tales lesiones en ratones está más allá de las capacidades de la mayoría de los grupos de investigación. Como tal, los modelos de defectos de huesos largos se limitan a ratas y animales más grandes. Sin embargo, los ratones ofrecen importantes ventajas en la investigación, ya que pueden ser modificados genéticamente y criados como cepas inmunocomprometidas que no rechazan las células y los tejidos humanos.
En este artículo, demostramos una técnica que facilita la generación de un defecto segmentario en el fémur del ratón utilizando equipos veterinarios y de laboratorio estándar. Con la práctica, la fabricación del dispositivo de fijación y la implantación quirúrgica es factible para la mayoría de los veterinarios capacitados y el personal de investigación con animales. Utilizando datos de ejemplo, también proporcionamos metodologías para el análisis cuantitativo de la cicatrización ósea para el modelo.

Los ratones se recuperan la conciencia y de las extremidades posteriores movilidad 5-10 minutos después de la retirada de la anestesia. Durante los primeros 5 días, es aconsejable para albergar a los ratones individualmente e introducir el enriquecimiento ambiental para evitar el exceso de uso de la extremidad. Para este propósito, los nidos de tipo iglú reducen la necesidad de la construcción del nido y animan descanso. También hemos observado que la provisión de alimentos y de hidrogel en el suelo de la jaula reduce l...

Los modelos animales se emplean con frecuencia para imitar lesiones óseas graves en la investigación biomédica. Debido a su pequeño tamaño, el establecimiento de lesiones óseas estabilizadas en ratones está más allá de las capacidades de la mayoría de los grupos de investigación. En este trabajo, describimos un método simple para establecer y analizar defectos femorales experimentales en ratones.

A-crítico tamaño femoral Defecto sencillo modelo en ratones

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

El objetivo general de este procedimiento es generar un defecto experimental simple de tamaño crítico en el fémur de un ratón. Esto se logra primero fabricando un pasador medular a partir de un tubo de acero quirúrgico. En el segundo paso, se genera un defecto de tamaño crítico en el fémur de un ratón anestesiado.El clavo se implanta entonces para estabilizar el hueso. En última instancia, la radiografía y la histología pueden utilizarse para evaluar el grado de curación ósea. Al intentar este procedimiento, es importante recordar fijar el hueso únicamente con la pinza actual y asegurarse de que el collar esté al ras con el borde del hueso seccionado.Comience colocando 10 microlitros de adhesivo de cianoacrilato en la parte media del eje de un trozo de tubo hipodérmico de acero inoxidable de calibre 22 y nueve milímetros de longitud. Pase un collar de tres milímetros sobre el eje hasta que alcance el centro, y luego gírelo para distribuir uniformemente el pegamento entre el collar y el eje, como se ilustra aquí. Se pueden prototipar varias configuraciones de pasadores según los objetivos específicos del estudio y del receptor.A continuación, mida las dimensiones del pasador con un par de calibradores digitales. Cada sección debe tener aproximadamente tres milímetros de longitud. Deje que el collar se endurezca durante al menos 15 horas y luego utilice dos discos impregnados con Emory de grano 20 para eliminar cualquier rebaba o exceso de pegamento.A continuación, utilice una herramienta rotativa para pulir el pasador con un disco de fieltro para pulido, luego enjuague el pasador con agua desionizada y séquelo con aire comprimido. Ahora, compruebe la integridad colocando una aguja hipodérmica roma de calibre 19 sobre el vástago del pasador y empuje la aguja contra el collar para confirmar que el collar pueda resistir aproximadamente 25 gramos de peso. A continuación, enjuague el pasador en PBS estéril filtrado y compruebe el ajuste introduciendo el pasador en la cavidad medular del fémur de una muestra ósea, asegurándose de que el vástago encaje firmemente y el collar quede al ras con los bordes del hueso cortado.Asegúrese de que el extremo del pasador penetre también en el hueso trabecular de la diáfisis, para maximizar la fijación y mejorar el ajuste por interferencia. Extraiga un cilindro de espuma de gel de tres milímetros con un cuchillo para biopsia de piel y perfore el centro con una aguja de calibre 21. A continuación, pase el cilindro de espuma de gelatina y alínelo con el collar.Finalmente, esterilice la aguja en un ciclo seco a 120 grados Celsius y 15 PSI. La espuma se secará y oscurecerá en color. Tras confirmar la sedación mediante el método aprobado institucionalmente adecuado, comience el procedimiento quirúrgico colocando un animal anestesiado con las extremidades posteriores orientadas hacia arriba sobre un campo estéril.Aplique pomada oftálmica al animal y, después de retirar el vello, cúbralo con una campana quirúrgica limpia con abertura y localice la lente proximal y distal del fémur. Incise la piel cinco a diez milímetros a lo largo del eje longitudinal. Luego use un escalpelo número 15 para separar la capa de la piel de la fascia, exponiendo un acceso lateral al fémur a través del bíceps femoral para los MAs y el vasto lateral.Localice dónde se encuentran los septos de ambos músculos. Trace una línea de tejido blanco frente a la coloración rosada del músculo y disecque cuidadosamente con el bisturí a lo largo de este límite intermuscular hasta que sea visible el fémur. A continuación, utilice un elevador periosteo romo para ampliar la incisión y exponer así toda la diáfisis.Luego, exponga adicionalmente los dos tercios centrales del fémur teniendo cuidado de preservar el haz neurovascular posterior en el lado medial. Utilice un escalpelo para raspar suavemente los tejidos blandos del hueso y luego seque el hueso con un aplicador estéril con punta de algodón. Ahora, use una regla estéril o un calibrador para localizar el centro del fémur y marque el hueso aproximadamente a 1,5 milímetros proximal y distalmente desde el centro.Luego, sujete suavemente el fémur con un par de pinzas de punta fina previamente moldeadas según el estilo actual, y utilice un taladro fino equipado con una rueda de corte recubierta de gránulos de diamante para realizar el primer corte con el elevador en su lugar para proteger el tejido. A continuación, eleve el fémur cortado a 45 grados mientras sostiene firmemente el extremo de la diáfisis. Realice el segundo corte eliminando un segmento de tres milímetros con el hueso inmovilizado mediante pinzas.Amplíe cuidadosamente las cavidades medulares de cada extremo con una aguja hipodérmica roma de calibre 23. Luego, utilizando un calibrador de profundidad previamente preparado, hecho de un trozo de tubo de calibre 22 colocado dentro de un tubo de calibre 19, confirme que la profundidad de la cavidad sea de tres milímetros. Cuando el hueso esté listo, inserte el pasador preparado en las cavidades medulares proximal y luego distal para devolver al fémur su longitud original y establecer una brecha estable de tres milímetros.Confirme que el pasador encaje firmemente en ambas cavidades medulares y que los bordes del hueso cortado estén alineados con el collar. Luego, reposicione el músculo y el tejido periférico sobre el pasador y cierre con una sutura continua absorbible de cinco ceros. Cierre la piel con nylon de cinco siete nudos cuadrados, suturas de cinco ceros, y selle la incisión con adhesivo quirúrgico en los animales.Fueron sacrificados de acuerdo con las guías de la AVMA y también bajo un protocolo aprobado por el IACUC. Después de dos a cinco semanas, exponga el fémur proximal y la pelvis desde el lado medial del animal para diseccionar cuidadosamente la extremidad trasera. Luego, presione suavemente la articulación hacia adentro desde el lado lateral de la extremidad mientras utiliza el bisturí para separar la cabeza del fémur del acetábulo.Utilice un escalpelo afilado para cortar el músculo y la piel restantes, liberando así la extremidad completa de la pelvis. Luego, elimine el tejido excesivo y la porción distal de la extremidad trasera aproximadamente cinco milímetros por debajo de la articulación de la rodilla, y retire la piel, dejando el músculo en su lugar. A continuación, fije el tejido en formaldehído amortiguado al 10 % suplementado con un fijador de cloruro de calcio 10 milimolar durante una semana, seguido de almacenamiento en PBS suplementado con cloruro de calcio 10 milimolar hasta un mes antes de la obtención de imágenes.Para analizar las muestras, envuelva los tejidos en una capa delgada de plástico para cielos rasos. Colóquelos verticalmente uno por uno en la cámara de imagenología de micro-TC y configure la exploración con los siguientes parámetros.Voltaje a 29 kilovoltios, corriente a 661 miliamperios, potencia a 19 vatios. Tamaño de píxel de la imagen a 21 micrones. Rotación de 360 grados a sí, promedio de cuadros a encendido, paso de rotación a un grado y movimiento aleatorio a encendido.A medida que se adquiere cada imagen, guárdelas como archivos jpeg en una carpeta de destino única por escaneo. Luego, utilizando las imágenes axiales y el software analítico para cada archivo, seleccione las secciones que incluyan únicamente el collar para establecer los bordes proximal y distal del defecto original y definir la región de interés. Finalmente, dibuje una zona de exclusión con un margen de 100 micrones alrededor del collar para excluirlo de los cálculos, y luego transfiera esta zona a cada una de las secciones dentro de la región de interés.Sin intervención terapéutica, los bordes del defecto suelen extenderse 0,5 milímetros durante los primeros 21 días posteriores a la cirugía. Después de 14 a 21 días de cicatrización, el volumen del hueso de novo puede determinarse fácilmente a partir de las imágenes axiales generadas por el escaneo de micro-TC. El volumen del hueso nuevo generado aumenta con el tiempo, pero generalmente no supera un total de un milímetro cúbico.En ausencia de intervención terapéutica después de 21 días, el momento polar de inercia del hueso de novo a 0,25 milímetros de los bordes de la lesión varía entre 0,05 y 0,35 milímetros a la cuarta, en comparación con 0,02 y 0,08 milímetros a la cuarta en el centro de la lesión. Esto confirma además la presencia de una seudartrosis en los casos no tratados, como se muestra en esta imagen representativa; la tinción tricrómica de Mason en secciones longitudinales descalcificadas permite visualizar el crecimiento óseo endocondral, con el borde delantero de cartílago seguido por hueso esponjoso. Aunque inevitablemente ocurrirá algún daño durante la disección, si el pasador se retira cuidadosamente, la estructura histológica del hueso y del tejido conectivo permanecerá clara.Alternativamente, puede realizarse la inclusión en metilmetacrilato y el corte de secciones no desmineralizadas con el dolor presente. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en 30 minutos. Tras este procedimiento, se pueden realizar métodos como CAR TPCR, microarrays o inmunotransferencia sobre el tejido recuperado para responder preguntas adicionales, tales como: ¿cómo afectan ciertas células de un genotipo determinado, proteínas o incluso compuestos a la reparación ósea? En nuestros estudios, utilizamos células humanas y proteínas humanas en ratones inmunodeprimidos.

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Investigación

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Medicine

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