Name: Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprende a evaluar la arborización dendrítica en el giro dentado del hipocampo de ratones mediante trazado manual en tiempo real e imagen de profundidad de campo extendida. Estas técnicas permiten reconstruir y cuantificar la morfología neuronal con precisión.

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Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Fundación LuMind, Research Down Syndrome y la Alzheimer's Association (AS). El CP fue parcialmente apoyado por una beca de desarrollo docente de la Facultad de Enfermería y Profesiones de la Salud de la Universidad Estatal de Arkansas.

NOTA: Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas éticas aprobadas por el Comité de Investigación Animal de la Sistema de Salud de Asuntos de Veteranos de Palo Alto. 1. Golgi-Cox tinción <ol><li> La extracción de cerebro y tinción <ol><li> En la primera jornada, profundamente anestesiar a los ratones con 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina antes de la eutanasia a través desangrado. </li><li> Retire con cuidado la bóveda craneal y diseccionar el cerebro. <ol><li> Primero quitar la piel en la parte superior del cráneo, la colocación de una tijera curvada en la parte superior del cerebelo y suavemente cortar a través de la bóveda craneal paralelo al surco central con la punta de la tijera señalado hacia el exterior, moviéndose en la dirección hacia el bulbo olfatorio. Repita este proceso en ambos lados. </li><li> Use un pincet quirúrgico para levantar la bóveda craneal, mientras que si lo gira hacia los bulbos olfatorios y romper con él. A continuación, dar la vuelta el cráneo al revés y utilizar un pico para cortar a través de la ópticanervios y aflojan el cerebro. Por último, utilice la selección para separar el cerebro desde la médula espinal a nivel del foramen magnum. </li></ol></li><li> Inmediatamente sumerja el cerebro en 15 ml de solución comercialmente disponible de Golgi-Cox, sin diluir. Guarde el cerebro en solución de Golgi en una botella de vidrio de 20 ml tapado a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> En el segundo día, se vierte lentamente la solución y reemplazarla con 15 ml de solución de Golgi-Cox fresco. Vuelva a tapar el frasco que contiene el cerebro y dejar en reposo durante otros 9 días en la oscuridad. </li></ol></li><li> Seccionamiento y empotramiento <ol><li> El día 11, colocar los cerebros en solución de sacarosa al 30%, preparado en ddH2O para la deshidratación. Cambie la solución recién preparada con 30% de sacarosa después de 12 horas. Incubar los cerebros en una solución de sacarosa al 30% durante 3 días a 4 ° C. </li><li> El día 14, llenar el depósito de la vibratome con una solución de sacarosa al 30% hasta que la hoja está cubierta. Ajuste la velocidad de 1 mm / s con una amplitud de 0,95 mm. </li><li> Seque el cerebro con un Kimwipe para eliminar el exceso de humedad y eliminar el cerebelo utilizando una hoja de afeitar para cortar coronal. </li><li> Monte firmemente todo el cerebro a la plataforma vibratome usando pegamento y deje que se seque durante 2-4 min. Inserte la plataforma con el cerebro adherido en el depósito y ajustar la hoja a la parte superior del cerebro. </li><li> Utilizando el vibratome, cortar el cerebro en 150 micras de espesor secciones a temperatura ambiente, recordando que cambiar la hoja después de cada tercera cerebro. </li><li> Recoge las secciones del depósito con un cepillo pequeño de punta y sumergirlos en una placa de Petri que contiene 0,3% de gelatina hecha en ddH 2 O. Mientras que las secciones permanecen en la placa de Petri, añadir 0,5 ml de 0,3% de gelatina en cada diapositiva y utilice un cepillo para difundir y recubrir las Superfrost + diapositivas. </li><li> Recoger suavemente hasta las secciones sumergidas de la placa de Petri y colocarlos sobre los portaobjetos gelatinizados. Oriente las secciones del cerebro portocarlos sólo en sus lados y no en la parte superior. </li><li> Después de unos diez minutos, recubrir las secciones con 30% de sacarosa antes de que el tejido se seque por completo. Luego secar al aire las muestras preparadas en un lugar oscuro en una parrilla corrediza durante 3 días. </li><li> Diluir disponible comercialmente solución Desarrollar 10x a 1x usando ddH2O Sumergir los portaobjetos en solución de revelado para 7-10 min. Enjuague las diapositivas 3 veces en ddH 2 O. </li></ol></li><li> Deshidratación <ol><li> Preparar 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% y soluciones de etanol usando destilada ddH 2 O. </li><li> Remoje las diapositivas de soluciones cada vez más altas de etanol durante 10 minutos cada uno. </li><li> Remojar los portaobjetos en solución de etanol al 100% 3 veces durante 10 min cada vez. </li><li> Remoje las diapositivas en el 100% de xileno 3 veces consecutivas durante 5 minutos cada uno, manteniendo las secciones en la solución final hasta que estén encubrimiento resbaló. </li><li> Coloque una cantidad generosa de DPX (ftalato de di-n-butilo en xileno) medio de montaje (abfuera 1-1,5 ml) en cada diapositiva utilizando una pipeta de plástico. Coloque cuidadosamente cubreobjetos para evitar burbujas. </li><li> Cubierta seca Aire deslizó cerebro secciones horizontalmente durante 3 días. </li></ol></li></ol> 2. Doublecortin tinción <ol><li> Profundamente anestesiar (consulte el paso 1.1.1) a los animales. </li><li> Realizar la perfusión cardíaca con recién preparada 4% de paraformaldehído hecho en tampón fosfato 12. </li><li> Extraer el cerebro (véase 1.1.2) y se guardan en 45 ml de paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante la noche en un agitador de balanceo. </li><li> La transferencia de los cerebros de una solución de sacarosa al 30% y esperar a que la deshidratación completa durante 48 horas a 4 ° C. Retire el cerebro a partir de sacarosa y colocarlos directamente en bloques de cobre colocados en hielo seco. </li><li> Llenar el bloque con la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto y marcar la orientación del cerebro usando el bulbo olfatorio como un hito. </li><li> El uso de un criostato, cortar secciones 70 micras de espesor a -20 ºC y colocarlosen solución crioprotector (25% de glicol de etileno, 25% de glicerol, en tampón de fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,4) y mantener a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Hacer una solución de 50% de metanol crioprotector y 50%. A esta solución añadir peróxido de hidrógeno al 0,5% (vol / vol). Incubar las secciones flotantes de 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Secciones calientes en 37 ºC en TBS (solución salina tamponada con Tris) para 30-40 min colocándolos en un horno histológico. </li><li> Incubar las secciones con 0,3% de Triton y 3% de suero de caballo normal durante 45 min a temperatura ambiente antes de la inmunotinción. Incubar las secciones a 4 ºC durante la noche en 3 ml de solución del anticuerpo DCX diluido 1: 500 en TBS con 0,3% de Triton y 1% de suero de caballo normal. </li><li> Lavar Al día siguiente las secciones 3 veces consecutivas en TBS (10 min cada uno). </li><li> Incubar las secciones con un caballo biotinilado anti-cabra (1: 200 en TBS) durante dos horas a temperatura ambiente. Lávese las secciones 3 veces consecutivas en TBS (10 min cada uno). </li><li> Incubar tdobladillo con ABC Lite (1: 1000) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 5 l de 30% de H 2 O 2 a un comprimido de 10 mg de DAB (3,3 &quot;diaminobenzidine) solución disuelta en 15 ml de 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Incubar las secciones inmediatamente en esta solución durante 5 min. </li><li> Terminar la reacción por lavado con TBS enfriado con hielo tres veces seguido de un lavado en TBS a temperatura ambiente. </li><li> Deshidratar secciones usando una serie de soluciones de etanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min cada uno), aclarar en xileno, y luego cubrir deslizamiento usando DPX como en el paso 1.3. </li></ol> 3. Visualización <ol><li> Tras el secado completo de las secciones, eliminar el exceso de DPX en la parte superior de las diapositivas con una cuchilla afilada, y colocarlos en la etapa de exploración del microscopio. El sistema se compone de un microscopio equipado con la etapa de exploración, palanca de mando, y un color de la cámara 12-bit. </li><li> Inicie el programa. Abra un nuevo archivo de datos. </li><li> Lugarun punto de referencia en la pantalla haciendo clic con el puntero del ratón en cualquier lugar. Esto activará todos los iconos del panel de herramientas de la ventana del programa. </li><li> Haga clic en el icono &quot;Joystick gratis&quot; en la barra de herramientas y luego usar el joystick para localizar el giro dentado del hipocampo en la primera sección. </li><li> En la pestaña &quot;Herramientas&quot; de la ventana del programa, seleccione &quot;Sección Administrador serie&quot;. Haga clic en el icono &quot;Nueva sección&quot; en la esquina inferior izquierda de la ventana. Esto abrirá la ventana &quot;Configuración de la Sección de serie&quot;. </li><li> Seleccione la ventana de la sección de configuración de serie y luego ingrese el número total de secciones que contienen las regiones del hipocampo. Seleccione el intervalo de evaluación. Introduzca el espesor de la sección de corte (70 micras para DCX y 150 m para las secciones teñidas-Golgi). </li><li> Iniciar rastreo de la región giro dentado haciendo clic en el icono &quot;Freehand Diseño de contorno&quot; en la barra de herramientas. Contorno de la capa de células granulares dentadas. &lt;/ Li&gt; <li> Seleccione &quot;100X&quot; en el menú &quot;Ampliación&quot;. Añadir una gota de aceite de inmersión sobre la sección y cambiar el objetivo de 100X. Localice los cuerpos de células granulares dentadas y dendritas marco de este objetivo. </li><li> Centrarse en una neurona seleccionado y haga clic en el icono &quot;Neurona Rastreo&quot; en la barra de herramientas. Trazar la circunferencia del cuerpo de células granulares dentadas. Cuando termine el rastreo, haga clic derecho para seleccionar &quot;Finalizar Cell Cuerpo&quot;. </li><li> Iniciar rastreo de las dendritas manualmente en X, Y y Z y seguir cada rama con el mando joystick y z-motor. En un nodo de bifurcación o trifurcación, seleccione la opción correspondiente en el menú desplegable en el botón derecho. Traza cada una de las ramas que surgen de estos nodos. Al final de cada rama, haga clic derecho y seleccione &quot;Terminar&quot; en el menú desplegable. </li><li> Utilizando los iconos de la tecla de flecha en la ventana del software seleccionar aleatoriamente otra de células granulares dentadas y siga el mismo procedimiento que described en el paso 3.9 a 3.10. Guarde todo el trazado. </li><li> Inicie el software de rastreo neuronal. </li><li> Abra el primer archivo de datos NRX desde el primer ratón del grupo experimental. Anexar el archivo NRX del segundo ratón del grupo experimental. Continúe hasta que se adjuntan todos los archivos NRX de este grupo. </li><li> En la ficha Análisis, seleccione &quot;Fan In-diagrama&quot;. Esto abre el ventilador en-análisis ventana. Marca de verificación &quot;dendritas&quot; y haga clic en Mostrar, que representa a las longitudes y los patrones de ramificación dendrítica para este grupo de ratones (Figura 1). </li></ol> 4. EDFI NOTA: Este método permite al usuario grabar rápidamente un gran número de imágenes a través del eje z de cada campo y generar una imagen 2D que contiene todos los píxeles centrados a lo largo del eje z. El resultado será una imagen compuesta que contiene todos los píxeles enfocados de las imágenes recogidas. <ol><li> Conecte el microscopio a una cámara digitalera. Coloque las secciones primera en la etapa de exploración conectado con el microscopio y luego cambiar a un objetivo de 10X. Mueva el escenario para el área de interés. </li><li> Iniciar un programa de captura de vídeo. </li><li> Pulse el botón de grabación. Tan pronto como se pulsa el botón de grabación, utilice el mando macro de enfoque para pasar de la parte superior a la parte inferior de la sección para un total de 4 seg. Guarde el archivo de vídeo resultante. </li><li> Utilice ImageJ software gratuito para convertir los archivos de vídeo AVI en un formato sin compresión abriendo el archivo y guardarlo en formato de archivo sin comprimir. </li><li> Iniciar un programa de análisis de imagen y abrir el archivo AVI. Ir al menú &quot;Acción&quot; y haga clic en &quot;profundidad de campo&quot;. Seleccione el archivo de vídeo correspondiente. En opciones de &quot;salida&quot;, seleccione &quot;Generar Composite Best-Focus de imagen&quot;. </li><li> En opciones de &quot;Análisis Focus&quot;, seleccione &quot;Normalizado Iluminación&quot; y opciones &quot;Max Contraste Local&quot;. A continuación, seleccione &quot;Crecomió &quot;. La imagen resultante representa todos los píxeles centrados a lo largo del eje z (Figura 2). </li><li> Guarda la imagen resultante. </li></ol> 5. Generar Extremadamente Imágenes de alta resolución NOTA: Este método permite al usuario generar automáticamente bajo aumento y imágenes de muy alta resolución de imágenes de alta magnificación de alta resolución de forma automatizada. <ol><li> Colocar las secciones primera en la etapa de exploración conectado al microscopio. El microscopio está conectado a una cámara digital. Mueva el escenario para el área de interés. </li><li> Iniciar un programa de adquisición de imágenes. </li><li> Utilice un objetivo de 10X y adquirir y guardar imágenes de alta resolución (4076 x 3116) de la región de interés, asegurándose de tener por lo menos 10% de superposición. </li><li> Image Composite Editor Ejecutar a la puntada imágenes. </li><li> Ir al menú Archivo y haga clic en &quot;Nuevo Panorama&quot;. Seleccione la carpeta en la que las imágenes son stORed. Seleccione las imágenes que pertenecen a la misma región y pulse &quot;ok&quot;. </li><li> Pulse el botón &quot;Exportar a disco&quot; y guardar la imagen. Esta imagen representa una imagen de muy alta resolución de la zona de interés que podrían ser utilizados para el análisis y / o demostración (Figura 3). </li></ol>

<ol><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).</li>
<li>Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synapse%3A+center+stage+for+many+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The synapse: center stage for many brain diseases.</a> The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).</li>
<li>Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+and+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synapses and Alzheimer’s disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777(2012).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Huttenlocher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+development+in+neocortex+of+children+with+mental+defect+and+infantile+spasms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms.</a> Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+origin+of+the+pericellular+baskets+of+the+pyramidal+cells+of+the+human+motor+cortex%3A+a+Golgi+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study.</a> Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).</li>
<li>Dang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formoterol%2C+a+long-acting+%CE%B22+adrenergic+agonist%2C+improves+cognitive+function+and+promotes+dendritic+complexity+in+a+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome.</a> Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).</li>
<li>Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+morphology+and+spine+density+is+not+altered+in+motor+cortex+and+dentate+granular+cells+in+mice+lacking+the+ganglioside+biosynthetic+gene+B4galnt1+A+quantitative+Golgi+cox+study%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study.</a> Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).</li>
<li>Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+doublecortin+gene+family+and+disorders+of+neuronal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Nerv+Syst+Agents+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure.</a> Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).</li>
<li>Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis.</a> Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).</li>
<li>Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+of+notch+signaling+in+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi-Cox+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Juraska, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+developmental+plasticity+in+the+visual+cortex+and+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).</li>
<li>Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+traumatic+brain+injury+causes+acute+dendritic+and+synaptic+degeneration+in+the+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (9), e24566(2011).</li>
<li>Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+CA+field+neurogenesis+after+pilocarpine+insult%3A+The+hippocampal+fissure+as+a+neurogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche.</a> J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).</li>
<li>Merz, K., Lie, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+Doublecortin+is+dispensable+for+the+development+of+adult+born+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice.</a> PLoS One. 8 (5), e62693(2013).</li>
<li>Hussaini, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
</ol>

Las tasas de publicación para este artículo son patrocinados por MBF Bioscience.

Aquí, dos métodos se describieron para cuantificar el grado de arborización dendrítica en las neuronas maduras y recién nacidos utilizando métodos de tinción convencionales en conjunción con RTI y EDFI. La adquisición de imágenes de alta resolución de las neuronas proporciona un método extremadamente útil para probar los efectos perjudiciales de los trastornos neurodegenerativos y, a su vez, proporciona un medio para evaluar las estrategias terapéuticas que se dirigen a las neuronas del hipocampo. <p class="jove_con...

Alteraciones dinámicas en el número y la estructura de las sinapsis son características de desarrollo, el envejecimiento, y numerosos trastornos neurodegenerativos 1-3. La capacidad de las neuronas para recibir e integrar la información sináptica depende de la morfología dendrítica y alteraciones dinámicas en las conexiones sinápticas. De hecho, existe una correlación positiva entre la espina dendrítica y el número de sinapsis, que tanto el impacto de la función cognitiva 4. Por lo tanto, no es sorprendente que decrementos en número de la espina dendrítica se han asociado con la disfunción cognitiva en un número de trastornos neurológicos 5-7, lo que provocó un gran interés en la cuantificación de la espina dendrítica. Sin embargo, la cuantificación de la densidad de la espina sigue siendo un tiempo y tarea tediosa, que no genera información útil con respecto a la topografía y la distribución de las sinapsis en todo el árbol dendrítico. Afortunadamente, los métodos de tinción (por ejemplo, Golgi-Cox y doublecortin (DCX)), en relacióncon sofisticadas técnicas de imagen se puede utilizar para superar las barreras actuales y producir imágenes de alta resolución de la arborización dendrítica de una manera fiable y rápida. Si bien el método de tinción de Golgi-Cox se puede implementar para evaluar el estado de la arborización dendrítica en todas las neuronas 8, DCX puede desplegarse para etiquetar las neuronas recién nacidas en particular en el giro dentado y la zona subventricular 9, una consideración importante dado que la neurogénesis ocurre tanto estas regiones a lo largo de la vida útil 10,11. Después de la tinción, dos métodos de imagen fueron desplegados para evaluar las características dendríticas: i) una imagen en tiempo real (RTI) y ii) de profundidad ampliada de la imagen de campo (EDFI). La técnica de RTI proporciona un medio para rastrear y cuantificar la longitud y orden de arborización largo de los segmentos y ramas dendríticas individuales. Por lo tanto, le permite a uno para estimar el área total y el volumen ocupado por cada árbol dendrítico. Más specifically, en el método RTI el usuario identifica continuamente los segmentos y reenfoca iterativamente como la neurona software de rastreo recoge las x, y, z y las coordenadas de la estructura dendrítica y reconstruye la trayectoria de la estructura dendrítica en 3D. Comparativamente, el método EDFI proporciona un medio más bien simples y rápidos para evaluar la densidad dendríticas en muestras de tejido en lugar de espesor mediante la generación de una imagen compuesta, proporcionando información sobre todo el eje z. Para ello, el usuario registra los archivos de vídeo de alta definición de todo el espesor de la sección y, a continuación utiliza el software para buscar los fotogramas de vídeo para identificar los puntos en el que un píxel es completamente enfocado. Posteriormente, los píxeles enfocados se fusionan e integran en una alta resolución, imagen 2D compuesta. Esta imagen compuesta contiene todos los píxeles que eran de enfoque, independientemente de su posición en el eje z. Análisis cualitativo y cuantitativo de estas imágenes en 2D se puede utilizar posteriormente para determinar la densidadde ramificación dendrítica en cada campo. Por último, se presenta un método panorámica para generar imágenes de muy alta resolución para el análisis y evaluación de las dendritas en toda una región de interés. Esta técnica se puede implementar para superar la falta de acceso a muy alta resolución y cámaras digitales caras. Usando este método, uno capta imágenes en serie en diferentes lugares a lo largo de los ejes x e y ejes y luego automáticamente puntadas juntos usando un programa gratuito (por ejemplo, Imagen Composite Editor). En particular, este método se puede utilizar para la evaluación cualitativa y cuantitativa de arborización dendrítica en una zona bastante amplia.

<table><tbody><tr><td>Solución de tinción de Golgi-cox modificada&nbsp;</td><td>Tienda Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>en 4&deg; C hasta el uso</td></tr><tr><td>de 1x Solución de desarrollo (stock 10x)</td><td>Tienda Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>a 4&deg; C hasta usar</td></tr><tr><td>30% de sacarosa,</td> <td>Sigma</td><td>CAS # 57-50-1</td><td>hacer fresco &nbsp; en ddH2O</td></tr><tr><td>0.3% Gelatina</td><td>Sigma</td><td>CAS # 9000-70-8</td><td>NA</td></tr><tr><td>Soluciones de etanol graduadas (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td><td>Sigma</td><td>CAS 603-003-00-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma</td><td>CAS # 1330-20-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>DPX Medio</td><td>EMS&nbsp;</td><td>#13510</td><td>NA</td></tr><tr><td>Superfrost (+) blanco</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>71869-10</td><td></td></tr><tr><td>NA Cubreobjetos 22x50mm (VWR #48393-059)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#4811-703</td><td>NA</td></tr><tr><td>DCX Anticuerpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8066</td><td>4 C</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>Número CAS 91-95-2 &nbsp;</td><td>-20</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-tek</td><td>4583</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>Número CAS 77-86-1 &nbsp;</td><td>Na</td></tr><tr><td>Microscopio ABC Lite</td><td>Vector</td><td>PK4000</td><td>NA</td></tr><tr><td></td><td>Cámara digital Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Cámara Nikon</td><td></td><td>DS-Ri1</td><td></td></tr><tr><td>de 12 bits&nbsp;</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>01 MBF2000RF-CLR-12</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Neurolucida</td><td>MBF Bioscience</td><td>V.10</td><td></td></tr><tr><td>Editor de Composición de Imágenes Microsoft</td><td></td><td>1.4.4.0</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>F 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td>Mediacy</td><td>Versin 7.00</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Se ha demostrado que la arborización dendrítica es un marcador fiable para el examen de la integridad estructural y funcional de las neuronas. De hecho, la complejidad y el alcance de la arborización dendrítica se correlacionan bien con la plasticidad sináptica en estas células. Se necesita un método fiable para la evaluación de la arborización dendrítica para caracterizar los efectos deletéreos de los trastornos neurológicos sobre estas estructuras y determinar los efectos de las intervenciones terapéuticas. Sin embargo, la cuantificación de estas estructuras ha demostrado ser una tarea formidable dada su naturaleza compleja y dinámica. Afortunadamente, las técnicas de imagen sofisticadas se pueden combinar con los métodos de tinción convencionales para evaluar el estado de la arborización dendrítica, proporcionando un medio de evaluación más confiable y rápido. A continuación se muestra un ejemplo de cómo estas técnicas de imagen se combinaron con métodos de tinción para caracterizar la arborización dendrítica en ratones de tipo salvaje. Estos métodos de imagen complementarios se pueden utilizar para evaluar cualitativa y cuantitativamente la arborización dendrítica que abarca un área bastante amplia dentro de la región del hipocampo.

La extensión de la arborización derivada de células granulares dentadas existentes y recién nacidos se analizó en ratones de tipo salvaje utilizando Golgi-Cox o tinción DCX (Figura 1). Se encontraron segmentos dendríticos de células DCX-positivas que ser 13 a 36 micras de largo. La distribución normal de la longitud dendrítica se probó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p &lt;0,01, Liliefors p &lt;0,001; las figuras 4 y 5). <p class="jove_content"...

Describimos dos métodos para la visualización y cuantificación de la arborización dendrítica en el hipocampo de modelos de ratón: imágenes en tiempo real y de profundidad de campo extendida. Mientras que el primer método permite un sofisticado trazado topográfico y la cuantificación de la extensión de la ramificación, el segundo permite una visualización rápida del árbol dendrítico.

Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar el grado de arborización dendrítica en el hipocampo de un modelo murino. Esto se logra mediante dos métodos diferentes. En el primer método, las dendritas se trazan manualmente en tiempo real a través de todo el espesor de cada sección.Después del trazado, se puede reconstruir y analizar todo el árbol dendrítico. El análisis del diagrama de abanico permite utilizar varios diagramas obtenidos de diferentes ratones como un medio objetivo de comparación. El segundo método consiste en visualizar la arborización dendrítica mediante imágenes con profundidad de campo extendida.Finalmente, se utiliza un método panorámico para unir múltiples imágenes de alta magnificación y obtener una única imagen compuesta de alta resolución para la evaluación cualitativa y cuantitativa de las dendritas en toda la región de interés. Y demostrará este procedimiento GI mobi. Los flujos de investigación AMI de mi laboratorio. La principal ventaja de estas técnicas frente a los métodos existentes es la facilidad de uso y la rapidez en la adquisición y recopilación de datos.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como la evaluación de la dendritización en regiones cerebrales afectadas y la valoración de los efectos de diferentes terapias sobre las dendritas. En este procedimiento, un día después de que el cerebro del ratón se haya fijado en paraformaldehído al 4%, colóquelo en solución de sacarosa para la deshidratación durante 48 horas a cuatro grados Celsius. Retire los cerebros de la sacarosa y colóquelos directamente sobre bloques de cobre situados en hielo seco.Rellene el bloque con OCT y marque la orientación del cerebro utilizando el bulbo olfatorio como punto de referencia. Corte secciones de 70 micrones de grosor a menos 20 grados Celsius utilizando un criostato y colóquelas en solución crioprotectora, manteniéndolas a menos 20 grados Celsius hasta su uso. Incube las secciones en peróxido de hidrógeno en metanol durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de un calentamiento a 37 grados Celsius en TBS durante media hora.Incube los cortes con Tritón al 0,3 % y suero de caballo normal durante 45 minutos a temperatura ambiente antes de la tinción con el anticuerpo anti-DCX al día siguiente. Lave los cortes tres veces consecutivas en TBS e incube los cortes con un anticuerpo secundario biotinilado de caballo durante dos horas a temperatura ambiente. Lave los cortes tres veces consecutivas en TBS durante 10 minutos cada vez e incube con una luz B, C durante 1,5 horas.A temperatura ambiente, añada peróxido de hidrógeno a la solución de DAB e incube inmediatamente las secciones en esta solución durante cinco minutos, y detenga la reacción lavándolas tres veces con TBS frío con hielo seguido de un solo lavado. Lave en TTBS a temperatura ambiente. Deshidrate las secciones utilizando una serie de soluciones de etanol.Cinco minutos cada uno, con limpieza y xileno, y luego cubrir con DPX. Una vez que los cortes se hayan secado completamente, limpie el exceso de DPX en las superficies del portaobjetos con una cuchilla afilada y colóquelos en la platina de escaneo del microscopio uno por uno. El sistema de visualización consta de un microscopio equipado con una palanca joystick para la platina de escaneo y una cámara de color de 12 bits.A continuación, inicie el programa Neuro Lucita y abra un archivo de datos nuevo. Coloque un punto de referencia en la pantalla haciendo clic en cualquier lugar con el puntero del mouse para activar todos los iconos del panel de herramientas de la ventana del programa. Luego, haga clic en el icono de joystick libre en la barra de herramientas y utilice el joystick para localizar el giro dentado del hipocampo.En la primera sección de la pestaña de herramientas de la ventana del programa, seleccione el administrador de secciones seriadas. Haga clic en el icono de nueva sección en la esquina inferior izquierda de la ventana para abrir la ventana de configuración de secciones seriadas. Posteriormente, seleccione la ventana de configuración de secciones seriadas e ingrese el número total de secciones que contienen regiones del hipocampo.Luego seleccione el intervalo de evaluación e ingrese el grosor de la sección. Comience a trazar la región del giro dentado haciendo clic en el icono de dibujo de contorno libre en la barra de herramientas. Posteriormente, delimite la capa de células granulares del giro dentado.Seleccione 100 x en el menú de aumento. A continuación, agregue una gota de aceite de inmersión sobre la sección y cambie el objetivo a 100 x. Localice los cuerpos celulares y las dendritas de las células granulares del giro dentado con este objetivo.A continuación, enfoque una neurona seleccionada y haga clic en el icono de trazado de neurona. En la barra de herramientas, trace la circunferencia del cuerpo celular de la célula granular del giro dentado. Al finalizar el trazado, haga clic derecho para seleccionar finalizar cuerpo celular.Ahora comience a trazar manualmente las dendritas en las direcciones X, Y y Z, y siga cada rama utilizando el joystick y el botón del motor Z. En un nodo de bifurcación o trifurcación, seleccione la opción correspondiente. Desde el menú desplegable, trace cada una de las ramas que surgen de estos nodos al final de cada rama. Haga clic con el botón derecho y seleccione finalización en el menú desplegable.Utilizando los iconos de las teclas de flecha en la ventana del software. Seleccione aleatoriamente otra célula granular dentada y repita el procedimiento de trazado tal como se acaba de demostrar. Guarde todo el trazado.Ahora inicie Neuro Lucita Explorer para el análisis de neuronas. Abra el primer archivo de datos NRX del primer ratón del grupo experimental. Agregue el archivo NRX del segundo ratón del grupo experimental y continúe hasta que todos los archivos NRX de este grupo hayan sido agregados.Bajo la pestaña de análisis, seleccione el ventilador en el diagrama para abrir la ventana de análisis del ventilador, marque con una palomita las dendritas y haga clic en mostrar para visualizar los enlaces y los patrones de ramificación de las dendritas de este grupo de ratones. En este procedimiento, conecte el microscopio a una cámara digital. Coloque una sección en la plataforma de escaneo conectada al microscopio y cambie a un objetivo de 10 x.A continuación, mueva la platina a la zona de interés. Inicie un programa de captura de video y presione el botón de grabación. En cuanto se presione el botón de grabación, utilice el mando de enfoque macro para desplazarse desde la parte superior hasta la inferior de la sección durante un total de cuatro segundos. Antes de guardar el archivo de video resultante, utilice ahora el software gratuito Image J para convertir los archivos de video AVI en un formato sin compresión.Inicie un programa de análisis de imágenes y abra el archivo VI. Vaya al menú de procesamiento y haga clic en profundidad de campo extendida. Seleccione el archivo de video correspondiente en las opciones de salida.Seleccione generar imagen compuesta con mejor enfoque en las opciones de análisis de enfoque. Seleccione las opciones de iluminación normalizada y máximo contraste local. Luego, haga clic en crear para generar una imagen resultante, que representa todos los píxeles enfocados a lo largo del eje Z.A continuación, guarde la imagen resultante. En este paso, coloque una sección sobre la plataforma de escaneo conectada al microscopio. Mueva la plataforma hacia la zona de interés.Luego, inicie el programa de adquisición de imágenes utilizando un objetivo de 10x, adquiera y guarde imágenes de alta resolución de la región de interés, asegurándose de tener al menos un 10 % de superposición entre las imágenes. A continuación, ejecute el editor de composición de imágenes para unirlas posteriormente. Vaya al menú archivo y haga clic en nueva panorámica.Seleccione la carpeta en la que se almacenan las imágenes. A continuación, seleccione las imágenes que pertenecen a la misma región y presione Aceptar. Pulse el botón exportar a disco y guarde la imagen.Esta imagen representa una imagen de resolución extremadamente alta del área de interés que podría utilizarse para análisis. Esta figura muestra la visualización de la arborización dendrítica con y sin métodos EDFI. Se comparó el método tradicional de encontrar el plano de enfoque óptimo con EDFI, obteniendo valores significativamente más altos del área dendrítica.Se encontraron utilizando el método EDFI. Aquí se muestra la cuantificación de la longitud y el volumen ocupado por las dendritas en diferentes órdenes de ramificación. La máxima longitud y volumen se alcanzaron en el primer orden.Aquí hay un histograma de la longitud dendrítica de las células granulares del giro dentado. La mayoría de los segmentos dendríticos de las DDRs marcadas con DCX tenían una longitud de 13 a 26. Esta línea punteada roja representa la distribución normal de los datos presentados tras seguir este procedimiento.Otros métodos clásicos como NeuroLucid podrían utilizarse para responder preguntas adicionales sobre el volumen y el área ocupados por las dendritas. Esta técnica que les hemos mostrado aquí ayudará enormemente a los investigadores en el campo de la neurobiología a evaluar no solo la morfología de las estructuras neuronales, sino también estructuras pequeñas no neuronales como la microglía en secciones cerebrales gruesas. Después de ver este video, deberían tener una buena comprensión de cómo evaluar el grado de proyecciones neuronales en un período de tiempo relativamente corto.

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Investigación

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Aprende a evaluar la arborización dendrítica en el giro dentado del hipocampo de ratones mediante trazado manual en tiempo real e imagen de profundidad de campo extendida. Estas técnicas permiten reconstruir y cuantificar la morfología neuronal con precisión.

Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

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