Axotomía nervio facial en ratones: un modelo para estudiar las motoneuronas respuesta a la lesión

El objetivo general de este procedimiento es exsudar el nervio facial para estudiar el daño del nervio periférico. El nervio facial se origina en la protuberancia del bulbo raquídeo y sale del cráneo a través del foramen estilomastoideo; luego, el nervio se ramifica en sus componentes principales.

Una vez expuesto, el nervio se autoamputa en su salida por el foramen estilomastoideo. Dos puntos de referencia principales ayudan a localizar el nervio facial. El primero es el conducto auditivo, que está compuesto por placas cartilaginosas de color blanco perlado conectadas por una membrana delgada.

El otro es el vientre anterior del músculo digástrico, que se encuentra encima del nervio y su salida por el foramen estilomastoideo. Después de que el nervio facial sufre una lesión, el científico puede estudiar múltiples factores, como la muerte de motoneuronas o la expresión génica. El modelo de lesión del nervio facial es uno de los modelos de lesión de nervios periféricos más ampliamente caracterizados.

Las ventajas de esta técnica son su simplicidad, alta reproducibilidad y la ausencia de efectos sobre las funciones vitales tras la parálisis facial subsiguiente. Además, debido a la naturaleza altamente simétrica del sistema nervioso, el lado no lesionado puede servir como un control interno apareado para sus experimentos. Para mantener el uso de técnicas asépticas durante todo el procedimiento, asegúrese de que todas las herramientas hayan sido autoclavadas y de tener preparado un esterilizador de perlas de vidrio para esterilizar las herramientas entre operaciones.

Prepare el banco quirúrgico colocando una almohadilla absorbente sobre una almohadilla calefactora, configurando el microscopio y fijando el cono nasal con cinta para que se alinee con el borde del campo visual. Después de anestesiar al ratón, asegúrese de que el animal no presente ninguna respuesta física a las manipulaciones, incluyendo una compresión del dedo del pie. A continuación, transfiera el flujo de gas desde la cámara de anestesia al cono nasal y aplique pomada oftálmica.

Coloque al ratón sobre su lado izquierdo encima de almohadillas quirúrgicas con una almohadilla calentada debajo. Monitoree continuamente la respiración del animal y ajuste el flujo de fluoruro de ISO según sea necesario para mantener la anestesia. A continuación, para exponer el sitio quirúrgico, sujete la oreja derecha al cono nasal con cinta adhesiva.

Se debe observar la vena auricular posterior atravesando la oreja. A continuación, humedezca el pelaje con etanol al 70% y afeite la zona. Después de eliminar el pelaje, limpie la piel con tres frotaciones alternadas de yodo y etanol al 70%, asegurándose de que la zona quede completamente limpia.

Continúe con la cirugía. Asegúrese de colocar la boca perpendicularmente sobre su lado, con la vena auricular desplazándose horizontalmente. Esto facilitará mucho la localización del nervio facial.

Para determinar la ubicación del primer corte, siga la vena auricular posterior desde el lóbulo de la oreja hasta la zona posterior de la protuberancia auricular. Luego, utilizando tijeras de resorte, realice un corte de cuatro milímetros, de dos a tres milímetros posterior a la protuberancia con fines didácticos. Este corte se ampliará para exponer la anatomía subyacente.

Ahora realice una disección roma de la grasa subcutánea y la fascia. Los vasos sanguíneos y el músculo pueden dañarse fácilmente con tijeras. Si ocurre sangrado.

Aplique presión con un hisopo estéril durante al menos 30 segundos. Si se ha producido una pérdida significativa de líquido, inyecte hasta medio mililitro de solución salina por vía intraperitoneal con una aguja de calibre 25 o 27. Ahora localice el nervio facial utilizando los puntos de referencia clave.

El nervio espinal accesorio es superficial con respecto al nervio facial y puede observarse mientras viaja desde la porción coccígea del cráneo. Para inervar el músculo trapecio, identifique el conducto auditivo cartilaginoso. Es de color blanco perlado y puede observarse en posición rostral respecto al nervio facial.

El nervio facial rodea la porción coddle del conducto auditivo. Luego identifique el vientre muscular del músculo digástrico anterior que se encuentra encima y coddle al nervio facial. Diseque por debajo de esta estructura para exponer el nervio facial.

Es una estructura sólida de color blanco que se adhiere a una capa de fascia subyacente. Identifique las ramas principales del nervio facial. Síguelas en dirección dorsal hasta su origen en el foramen estilomastoideo.

Utilice pinzas finas para mantener abierta la zona mientras usa la punta de las tijeras de resorte para disecar a lo largo del trayecto del nervio facial. El asta ósea sutil del mastoideo para Raymond puede percibirse con las pinzas. Ahora, identifique el tronco del nervio facial para aplastar el nervio.

Comprímalo con pinzas finas durante 30 segundos con presión constante. Esto seccionará todos los axones. Luego, repita la compresión en un ángulo perpendicular durante otros 30 segundos.

Mantenga la presión constante entre experimentos. Ahora que se han identificado los puntos de referencia anatómicos relevantes, demostraré la técnica quirúrgica más refinada. Utilizando una incisión más pequeña, siga la vena auricular posterior desde el pabellón auricular hasta la zona posterior de la protuberancia auricular, y realice una incisión de cuatro milímetros, de dos a tres milímetros posterior a la protuberancia.

Ahora, disecar directamente a través de la grasa subcutánea y la fascia utilizando los tres puntos de referencia: el nervio espinal accesorio, el conducto auditivo externo y el vientre anterior del músculo digástrico. Exponer el nervio facial. Seguir el nervio facial hacia el foramen estilomastoideo para alcanzar el tronco del nervio facial, seccionar el nervio, estabilizarlo suavemente con pinzas finas y cortarlo con tijeras.

Evite aplicar demasiada tracción sobre el nervio, ya que podría desgarrarse desde el tronco encefálico. Luego, separe los muñones o retire un segmento del nervio asegurándose de que no pueda producirse ninguna reconexión. Por último, inspeccione cuidadosamente el nervio y confirme que ha sido seccionado por completo.

Después de la exsanguinación, devuelva toda la grasa y los músculos a sus posiciones aproximadas. Luego cierre la herida con grapas quirúrgicas de 7,5 milímetros o con adhesivo de cianoacrilato. Si es necesario, administre analgésicos en este momento, apague la anestesia y devuelva al ratón a una jaula vacía sin lecho.

Mientras el animal se recupera, examínelo en busca de signos de parálisis facial; los bigotes están paralizados. Si están orientados hacia atrás, en dirección a la mejilla, la nariz parecerá desviada y el ojo no parpadeará en respuesta a una ráfaga de aire. Ahora, si el animal es hembra, colóquela con otra hembra.

Pero si el macho lo alberga solo hasta que la función de parpadeo del ojo se recupere, aplique pomada tálamica diariamente para prevenir complicaciones corneales. Mientras tanto, supervise al ratón en busca de signos de infección u otras complicaciones hasta que el sitio quirúrgico sane. Existe una variación significativa en la pérdida de neuronas motoras tras la ex sodomía, dependiendo de la edad y del fondo genético de los ratones; en animales de tipo silvestre que reciben una sección del nervio facial a las ocho semanas de edad.

Aproximadamente el 86 % de las neuronas motoras sobreviven a los 28 días. Postexotomía. Se observó una pérdida celular significativamente mayor en el modelo murino SOD1 de esclerosis lateral amiotrófica, así como en el láser de captura por microdesecación del gen de activación de recombinación dos knockout inmunodeficiente.

Se utilizó microdisección para aislar material del núcleo motor facial. Se pudo capturar todo el núcleo motor facial. Alternativamente, los subnúcleos pudieron recogerse por separado.

La técnica tiene una gran precisión. Se pueden capturar individualmente las neuronas motoras y el resto de la pastilla neural también se puede recoger para su análisis posterior. Se utilizó PCR cuantitativa para examinar la expresión génica en las muestras subnucleares del subnúcleo ventromedial, indicado como la línea punteada, y del subnúcleo ventrolateral, indicado como la línea continua; se midió la expresión de cuatro genes asociados con la respuesta de regeneración nerviosa.

Se encontraron algunas diferencias entre los subnúcleos de estos. La expresión de Gap 43 mostró la mayor diferencia entre los subnúcleos. Una vez dominada esta técnica, la cirugía puede completarse en solo unos minutos.

Es importante recordar colocar correctamente al animal, realizar la incisión en el lugar adecuado y utilizar los puntos de referencia anatómicos para localizar el nervio facial. Es fácil desorientarse en la región de la cabeza y el cuello, por lo que si se siente desorientado, simplemente localice el conducto auditivo cartilaginoso y sígalo en dirección posterior para encontrar el nervio facial.