Name: Generación de células T CAR para realizar la terapia adoptiva en el contexto de Glioblastoma estándar de cuidado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprende a generar células T CAR específicas para EGFRvIII y evaluar su eficacia en glioblastoma combinadas con radiación cerebral y temozolomide en ratones. Este método mejora la inmunoterapia adoptiva.

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Los autores desean agradecer a la Dra. Laura Johnson y al Dr. Richard Morgan por proporcionar la construcción retroviral CAR. Los autores también agradecen a Giao Ngyuen por su ayuda con la dosimetría para la irradiación de todo el cerebro. Este trabajo fue financiado por una subvención del NCI de los NIH 1R01CA177476-01.

Este protocolo se basa en un diseño experimental donde 10 los ratones se tratan con 10 7 CAR células T cada uno. Esto significa que se necesitarán 10 8 células CAR T; el rendimiento debe ser sobrestimada por 5 x 10 7 -1 x 10 8 a la cuenta de la pérdida de viabilidad. El siguiente protocolo se escala para generar aproximadamente 200 x 10 6 células. Las células se administran por vía intravenosa a la hembra C57BL / 6 ratones con 9 días tumores intracraneales EGFRvIII positivos singénicos establecidos, desarrollado a partir de los astrocitoma KR158B o líneas celulares de melanoma B16 existentes. Concomitantemente con CAR generación de células T, los ratones portadores de tumores se administran dosis clínicamente relevantes de TMZ lymphodepletive (60 mg / kg) y WBI (16,5 Gy). Los ratones fueron mantenidos y criados en condiciones libres de patógenos en Duke University Medical Center (DUMC). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por la Institución Universidad de Dukeal Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). 1. Administración de temozolomida a ratones portadores de tumores Días 0 a 4: <ol><li> Calcular el número total de ratones que será inyectada y multiplicar este por 0,5 para determinar el volumen de solución TMZ sea necesario (por ejemplo, 30 ratones x 0,5 ml = 15 ml TMZ) y añadir 1,5 ml a este volumen para dar cuenta de desbordamiento (16,5 ml TMZ ). </li><li> Multiplique este volumen total de 3 mg / ml para determinar el peso de liofilizado TMZ necesario (por ejemplo, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Pesar esto en un Erlenmeyer de 50 ml. PRECAUCIÓN: TMZ es tóxico por inhalación, ingestión y contacto con los ojos, la piel y las membranas mucosas. Consulte con la seguridad de la institución en el trabajo y / o la salud del medio ambiente y el departamento de salud para obtener recomendaciones sobre la reducción de riesgo de exposición. </li><li> Multiplique el volumen total de 0,15 para determinar el volumen de dimetilsulfóxido (DMSO) necesario (por ejemplo, 16,5 x0,15 = 2,475 ml de DMSO). Filtrar esterilizar este volumen de DMSO (más un adicional de 2 ml para dar cuenta de desbordamiento) a través de un filtro de 0,2 micras en un tubo estéril. Añadir 2,475 ml de DMSO estéril al polvo TMZ. </li><li> Coloque la solución TMZ / DMSO en un vaso de agua sobre una placa caliente a 65 ° C durante 10-15 minutos. Una vez TMZ se haya disuelto completamente, la solución debería ser de color amarillo pálido; Si la solución se vuelve de color rosa, a continuación, la TMZ se degrada, y una nueva solución debe ser preparada con un montón fresco de TMZ. </li><li> Calcular el volumen apropiado de solución salina estéril necesaria multiplicando 0,85 por el volumen total (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml de solución salina). Añadir 15 ml de solución salina estéril a una cónica 50 ml. Mientras TMZ se está disolviendo en el DMSO, solución salina de calor a 65 ° C. </li><li> Vortex la solución / DMSO TMZ para asegurar que el polvo de TMZ se haya disuelto completamente y lentamente añadir solución salina calentada a la solución / DMSO TMZ. </li><li> Inmediatamente después de la preparación, cargue completamente 15 x 1 ml de tuberculina syringí con solución TMZ para la administración a 4 días establecidos ratones con tumor. </li><li> Repita este procedimiento en los días 1 al 4 de un total de cinco administraciones de TMZ. </li></ol> 2. Todo el Cerebro La irradiación de ratones portadores de tumores Días 2 al 4: <ol><li> Encienda el irradiador de rayos X y deje que se caliente hasta el voltaje completo. Asegúrese de que el filtro adecuado está en su lugar y la entrada de la tensión y corriente apropiados (Figura 2A). NOTA: La dosimetría del irradiador debe determinarse con antelación para determinar los valores de voltaje y diseño de la red (Figura 2A, B) correspondiente. </li><li> Calcular la longitud de tiempo que es necesario para dar lugar a 5,5 Gy de irradiación de rayos X. Por ejemplo, si los rayos X se entregan a una velocidad de 2 Gy / min, a continuación, 2,75 min es necesario para entregar un total de 5,5 Gy. Entrada de la duración de tiempo apropiado. NOTA: La Tabla 2 proporciona ratón WBI dosifica unaND sus equivalentes clínicos en seres humanos. En el contexto de los gliomas de alto grado, 60 Gy fraccionó WBI (fracciones de 2 Gy, 5 días / semana durante 6 semanas) es el estándar de la atención clínica, y el equivalente murino utilizado aquí es 16,5 Gy (5,5 Gy x 3). </li><li> Preparar una solución fresca de ketamina / xilazina para la anestesia sistémica mediante la adición de 2 ml de ketamina y xilazina 1 ml a 17 ml de solución salina de tal manera que la solución final es de 10 mg / ml de ketamina y 1 mg / ml de xilazina. </li><li> Pesar los ratones y administrar 10 l de ketamina / xilazina por vía intraperitoneal por gramo de peso corporal de tal manera que los animales reciben una dosis de ketamina a 100 mg / kg y 10 mg / kg de xilazina. Ratones debe estar completamente sedado y visiblemente respirar menos de 2 minutos de la ketamina administración / xilazina. </li><li> Para mantener la humedad oftálmica en animales sedados, frote suavemente una pequeña cantidad de lágrimas artificiales pomada en cada ojo. </li><li> Coloque los ratones sedados en la parrilla de tal manera que las cabezas se colocan en el área que recibe la más alta de rayos X enintensidad (Figura 2B, C). Cuerpos Escudo de cuello para abajo con el tamaño apropiado de tubos de plomo para bloquear la entrega de rayos X sistémica (Figura 2D). </li><li> Coloque los ratones colocados bajo el haz de rayos X de tal manera que el láser que denota el punto focal del haz de rayos X está en la coordenada (0,0) en el diseño de cuadrícula. Comience la entrega de rayos X. </li><li> Cuando la entrega de rayos X, retire los animales del irradiador y colóquela sobre una almohadilla térmica. No albergar animales sedados con animales conscientes hasta que los animales han recuperado el conocimiento suficiente para mantener la posición decúbito esternal. Una vez que los animales pueden mantener decúbito esternal, coloque animales conscientes de vuelta en sus jaulas apropiadas. </li><li> Repita este procedimiento en los días 3 y 4 de un total de tres dosis fraccionadas de radiación. </li></ol> 3. La transfección Día -1: <ol><li> Preparar los medios de comunicación D10 mediante la adición de 50 ml de suero bovino fetal (FBS) a 500 ml de Dulbecco Modified medio Eagle (DMEM). </li><li> Preparar los medios de comunicación de células T (TCM) mediante la adición de 5,5 ml de L-glutamina, piruvato de sodio 5,5 ml, 5,5 ml aminoácidos no esenciales, y 5,5 ml penicilina / estreptomicina (pen / strep) a 500 ml de medio RPMI-1640. A continuación, añadir 550 l de 2-mercaptoetanol y 550 l de gentamicina. Por último, añadir 50 ml de FBS. </li><li> Harvest in vitro células HEK293T cultivadas y llevar a una concentración de 7,5 x 10 6 células / ml en medio D10. </li><li> Placa de 10 ml de medio D10 y añadir 1 ml de suspensión celular HEK293T en cada uno de 16 x 10 cm poli-D-lisina (PDL) placas recubiertas. </li><li> Incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol> Día 0: <ol start="6"><li> Reemplace los medios con 10 ml D10 fresco al menos 30 minutos antes de la transfección de las células. </li><li> Determinar la cantidad de plásmido vector, PCL-Eco vector, y el reactivo de transfección liposomal requerido para la transfección multiplicando el número total de placas + 1 (16 + 1 = 17) por 14,1 gplásmido vector (14,1 x 17 = 239,7 g), 9,9 g PCL-Eco vector (9.9 x 17 = 168,3 g), y 60 l de reactivo de transfección liposomal (60 x 17 = 1020 l). Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de la preparación de soluciones. </li><li> Etiquetar dos tubos A y B. En el tubo A, añadir 239,7 g plásmido vector y 168,3 g PCL-Eco vector a (1,5 x 17) ml de suero reducido medio de Eagle modificado (RS-MEM). En el tubo B, añadir 1.020 l de reactivo de transfección liposomal a (1,5 x 17) ml RS-MEM. </li><li> Incubar A y B por separado durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Mezclar A y B juntos suavemente (vórtex durante 1-2 seg o invertir varias veces) y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente para formar lípido / complejo de ADN. </li><li> Añadir lípido / ADN gota complejo gota a células HEK293T en placa de 10 cm. </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 6-8 horas o durante la noche (no exceda de 24 horas). </li><li> Después de 6-8 horas de incubación, reemplace medio con 12 ml de TCM fresco para la producción viral. Este medio plateadose utilizará en el Día 2 como sobrenadante viral para la transducción de células T. </li></ol> 4. La esplenectomía y T Preparación de la célula Día 0: <ol><li> Verter 10 ml de TCM en un cónico de 50 ml y el lugar en el hielo para la recolección de bazo. </li><li> Sacrificar el número apropiado de animales por asfixia de CO 2 y la decapitación secundario: Coloque los animales en una jaula recibir CO 2 a una velocidad de flujo de 10 a 30% jaula volumen / minuto, según las directrices de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (no más de 5 animales pueden ser sacrificado al mismo tiempo) hasta que termina la respiración y durante dos minutos después. Retire los animales de la cámara de CO 2 y decapitar. NOTA: Una bazo de un 6-12 semanas de edad hembra C57BL / 6 mouse producirá aproximadamente 4,5-5 x 10 7 esplenocitos. Aquí, 4 bazos se cosecharán durante aproximadamente 200 x 10 6 células. </li><li> Coloque el ratón de modo que su lado derecho quede hacia arriba, yrocíe con etanol al 70%. Con las pinzas, tomar un pliegue delgado de piel debajo de la caja torácica izquierda y cortar una ligera incisión con las tijeras. Pele la piel, tomar cuidadosamente un pliegue delgado del peritoneo con una pinza y se corta una pequeña cavidad. </li><li> El bazo es un órgano pequeño alargado de color rojo, y oscuro que se parece a un grano de aplanado; delicadamente agarrar el bazo con las pinzas y especial cortando el tejido conectivo circundante. Coloca los bazos extirpados en la cónica que contiene 10 ml de TCM en el hielo. </li><li> Verter bazos más de un 70 micras filtro de células de malla y desagregar por maceración con el extremo romo de la parte interior de una jeringa de 5 ml para generar una suspensión de una sola célula. Un máximo de dos bazos debe desglosarse por colador de malla. </li><li> Use un pequeño volumen de TCM para lavar cuidadosamente el filtro siguiente desagregación, a percibir los esplenocitos restantes. Piscina todo bazos desglosados ​​en una suspensión de una sola célula. Aumentar el volumen final a 50 ml con TCM para un lavado und girar a 300 xg durante 10 min. </li><li> Preparar una solución de tampón de lisis 1x mediante la adición de 5 ml de 10x tampón de lisis a 45 ml de agua estéril. Para eliminar las células rojas de la sangre, pellet se resuspende en 5 ml de 1x tampón de lisis por bazo en un Erlenmeyer de 50 ml, mezclando bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Si superior a 5 bazos, utilice un tubo de centrífuga de 250 ml. Coloque cónico o tubo de centrífuga en un baño de 37 ° C el agua durante 5 min. </li><li> Retire la reacción de lisis del baño de agua y añadir TCM en una relación 1: 1 con tampón de lisis para neutralizar la reacción. Lavar centrifugando a 300 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y pellet totalmente resuspender en TCM (2 ml / bazo, 8 ml total de 4 bazos) pipeteando arriba y abajo. </li><li> Contar las células mediante la adición de 10 l de suspensión celular a 190 l de azul de tripano (1:20 dilución). Multiplicar el número obtenido en uno de los cuatro cuadrados reticulados por 20 x 10 4 x volumen total (8 ml) para obtener el número total de células (por ejemplo, células 125 x 20 x 10 4 </sarriba&gt; x 8 ml = 200 x 10 6 esplenocitos). </li><li> Diluir las células a una concentración de 2 x 10 6 células / ml en TCM, suplementado con 2 mg / ml de concanavalina A (ConA) y 50 UI / ml recombinante humana interleucina-2 (rhIL-2). Por lo tanto, para 200 x 10 6 esplenocitos, añadir 92 ml de medio a 8 ml células, 200 mg ConA y 5.000 UI rhIL-2. </li><li> Añadir 2 ml de células a cada pocillo de placas tratadas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, de tal manera que 4 x 10 6 células están en cada pocillo (por ejemplo, 100 ml de células requerirán aproximadamente 4 placas). </li><li> Incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol> 5. Transducción Día 1: <ol><li> Calcular el número de cultura no tejido tratado placas de 24 pocillos necesarios para la transducción de multiplicar el número de bazos cosechados por 2 (se necesitan 8 platos para 4 bazos). </li><li> A continuación, calcular el volumen requerido de fragmento de fibronectina humana recombinante solución (RHFF)necesaria para placas capa multiplicando (número total de pozos + 3) x 0,5 ml (8 placas x 24 pozos = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml. </li><li> Preparar 97,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene RHFF a una concentración de 25 g / ml multiplicando el volumen total por 25 g (97,5 x 25 = 2437,5 g). Añadir esta cantidad de RHFF a 97,5 ml de PBS. </li><li> Escudo cultura no tejido tratado placas de 24 pocillos añadiendo 0,5 ml de solución de PBS / RHFF por pocillo. </li><li> Incubar toda la noche a 4 ° C. </li></ol> Día 2: <ol start="6"><li> Volcado de solución de PBS / RHFF de cultura no tejido tratado placas de 24 pocillos. </li><li> Añadir 1 ml / pocillo de albúmina de suero bovino al 2% (BSA) en PBS y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Retire BSA por volcar firmemente plato. Lave añadiendo 2 ml de PBS. </li><li> Recoger el líquido sobrenadante viral mediante la transferencia de los medios de comunicación de cada placa PDL HEK293T en un tubo de 250 ml de centrífuga y centrifugar 10 min a 500 x g. </li><li> Transferir cuidadosamente su viralpernatant en un tubo de centrífuga de 250 ml fresca, asegurándose de no perturbar el sedimento de células que puedan haber formado. </li><li> Añadir TCM fresco al sobrenadante viral tal que el volumen final es de 3 ml más de la cantidad necesaria para pocillos recubiertos con RHFF. Por ejemplo, para 192 pocillos recubiertos con RHFF, llevar el volumen de sobrenadante viral a 192 + 3 ml = 195 ml. </li><li> Eliminar esplenocitos cultivados de la incubadora y resuspender pipeteando suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces en cada pocillo. Pasar a un Erlenmeyer de 250 ml. Si se utiliza una pipeta multicanal, utilizando un depósito estéril antes de la transferencia ayudará a agilizar este paso. Count como se describe anteriormente y centrifugado a 300 xg durante 10 min. </li><li> Añadir rhIL-2 de sobrenadante viral a una concentración de 50 UI / ml. Por ejemplo, añadir 50 x 195 = 9750 UI rhIL-2 a 195 ml de sobrenadante viral. </li><li> Resuspender esplenocitos en sobrenadante viral a 1 x 10 6 células / ml </li><li> Añadir 1 ml / pocillo de suspensión de esplenocitos a placas de 24 pocillos recubiertas con RHFF. </li><li>Centrifugado durante 90 minutos de acuerdo a los siguientes valores: 770 × g, aceleración = 4, freno / deceleración = 0, 32 ° C. </li><li> Preparar una solución de TCM con 50 UI / ml de rhIL-2. Por ejemplo, preparar una solución de 200 TCM mediante la adición de 10.000 IU rhIL-2. Añadir 1 ml de rhIL-2 / TCM a cada pocillo después de la centrifugación. </li><li> Cultura durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2. </li></ol> 6. CAR células T cultura y la Cosecha Días 3 y 4: <ol><li> Si las células T a alcanzar&gt; 80% de confluencia, las células se pueden dividir (generalmente, al día 3 o el día 4). Para dividir celdas, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo en cada pocillo 2-3 veces, y pasar 1 ml de cada pocillo en nuevos pozos de una placa de 24 pocillos frescos de cultivo de tejidos tratados. A continuación, añadir 1 ml de TCM fresco con 50 UI / ml de IL-2 a cada pocillo de tal manera que el volumen final es de 2 ml en todos los pocillos. </li><li> Si las células no llegan a&gt; 80% de confluencia, realizar un cambio de medio de comunicación por pipeteando lentamente fuera de 1 ml de medios de comunicación desde la parte superior de cada pocillo. Evite disturbing células asentadas en la parte inferior, mientras que la eliminación de los medios de comunicación. Añadir 1 ml de TCM fresco que contiene 50 IU / ml de rhIL-2. </li></ol> Día 5: <ol start="3"><li> Resuspender las células T CAR pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 3 veces en cada pozo y la transferencia a un tubo de centrífuga de 250 ml. Girar las células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Completamente sobrenadante aspirado sin molestar a pellet. Lavar una vez con PBS, contar las células como se describió anteriormente, y se lava con PBS una segunda vez. Un rendimiento celular CAR T típica es de aproximadamente 1 x 10 6 células por pocillo (8 placas células x 24 pozos = 192 x 10 6 CAR T). </li><li> Resuspender las células en PBS a una concentración de 5 x 10 7 / ml para una inyección de 1 x 10 7 en un volumen de 200 g (por ejemplo, para 192 x 10 6 células T CAR, resuspender lavaron sedimento en 3,84 ml PBS). </li></ol> 7. CAR Administración de células T a ratones portadores de tumores Día 5: <ol><li> Transpocélulas rt sobre hielo para animalario para inyección intravenosa. Cargar 500-1.000 l en jeringa de insulina con 27-31 G aguja, lo que garantiza que todas las burbujas son expulsadas. </li><li> Coge un ratón en la base de la cola y colocar en la traba de tubo. </li><li> Tirar de la cola tensa con la vena hacia arriba, y se deslizan la aguja aproximadamente 1-2 mm debajo de la piel en la vena mediante la inserción paralela a la vena de la cola. Lentamente expulsar a 200 l en la vena. Si la aguja está correctamente insertado en la vena, el volumen fluirá fácilmente en; de lo contrario habrá resistencia y necesitarán la aguja para ser removido de la cola y se vuelven a insertar correctamente. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

La línea de tiempo de tratamiento descrito aquí fue diseñado para modelar estándar clínico de atención y potenciar sus efectos para la terapia adoptiva CAR. CAR dosis de células T, los regímenes de TMZ, y la administración de la radioterapia pueden ser modificados para mejorar la actividad in vivo de células T, lymphodepletion, y el asesinato del tumor en. Regímenes de TMZ se puede aumentar para producir mielosupresión de host y una mayor expansión de las células transferidas adoptivamente 30.</su...

El glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral maligno primario más común y es invariablemente fatal. La resección quirúrgica junto con estándar no específica de la quimioterapia y la radioterapia cuidado de no eliminar completamente las células malignas, que resulta en un pronóstico sombrío de menos de 15 meses en los pacientes con esta enfermedad 1. En contraste, la inmunoterapia ofrece un enfoque preciso para apuntar específicamente a las células tumorales, y por lo tanto tiene el potencial para servir como una plataforma de tratamiento altamente eficaz con menor riesgo de toxicidad colateral 2-4. Células T diseñadas ex vivo para expresar receptores de antígenos quiméricos (CAR) ofrecen una estrategia versátil para la inmunoterapia tumoral. CARs se generan mediante la fusión de la región variable extracelular de un anticuerpo con la molécula de señalización de una o más células T intracelular (s), en lugar de una de longitud completa complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) -restringido receptor de la célula T 5. Este modo de recono antígeno-anticuerpo-comoOn permite para las células T específicas de antígeno reactivos para reconocer y responder a los antígenos tumorales en ausencia de MHC y se pueden adaptar para un repertorio de antígeno virtualmente infinito. Células T CAR ingeniería contra una variedad de antígenos tumorales han demostrado eficacia preclínica y la promesa excepcional en la clínica 6-9. En concreto, en el contexto de GBM, una variante de crecimiento epidérmico receptor del factor de CAR plataforma de células T focalización III (EGFRvIII), una mutación específica del tumor expresa en la superficie de la célula 10, se ha demostrado prolongar la supervivencia en los ratones portadores de glioma 11. A pesar de su versatilidad, sin embargo, el beneficio clínico de la terapia adoptiva CAR no se ha realizado plenamente, en parte debido a la inmunosupresión asociada al tumor y la evasión inmune 12-16, así como los desafíos en el establecimiento y mantenimiento de las células T específicas de antígeno in vivo. Aprovechando estándar de cuidado (SOC) con inmunoterapia potencialmente puede superar varios de estos limitaciones, resulta en una mayor eficacia tanto en la configuración preclínica y clínica. SOC para el post-resección GBM consiste en altas dosis de temozolomida (TMZ), un agente alquilante de ADN 17, y la irradiación de todo el cerebro (WBI) 1. Estos tratamientos se presume que en sinergia con vacunas tumorales a través de la regulación positiva de la expresión de MHC tumor 18-20 y el derramamiento de antígenos por las células tumorales muertas 17,19,21,22. De hecho, la adición de TMZ 20,23 o 18,24 WBI conduce a una mayor eficacia antitumoral de los tratamientos de base inmunitaria en el entorno preclínico. Además, como muchos agentes quimioterapéuticos citotóxicos no específicos, TMZ se sabe que causa 25,26 linfopenia sistémica, que puede ser aprovechada como medio de host-acondicionado para las plataformas de terapia adoptiva 27-29. Lymphodepletion mediada por TMZ se ha demostrado para mejorar la frecuencia y la función de las células T específicas de antígeno, lo que aumenta la eficacia de un ADOPplataforma de terapia tiva contra los tumores intracraneales 30. En el contexto de la terapia CAR, lymphodepletion sirve como un medio de host-acondicionado por tanto reducir el número de células T supresoras endógena 31, y la inducción de la proliferación homeostática 32 a través de la competencia reducido para citoquinas 33, mejorando así la actividad antitumoral 11,34. Dada la relación sinérgica entre GBM SOC e inmunoterapia plataformas, evaluar nuevas terapias adoptivas y plataformas de vacunas en el contexto del SOC es crítico para sacar conclusiones significativas respecto a la eficacia. En este protocolo, se describe un método para la generación y administración intravenosa de células T CAR-EGFRvIII murino específico junto a TMZ y WBI en ratones con tumores intracraneales EGFRvIII-positivos (ver Figura 1 para la línea de tiempo de tratamiento). En pocas palabras, se producen las células CAR T ex vivo por transducción retroviral. Riñón embrionario humano (HEK) 293T células se transfectaron usando un complejo de ADN / lípido (que contiene el vector y los plásmidos CAR PCL-Eco) para producir virus, que luego se utiliza para transducir esplenocitos murinos activados que se cosechan y se cultivaron en paralelo. Durante el curso de la generación de CAR, los anfitriones murinos con tumores intracraneales EGFRvIII positivos se administran fraccionado de todo el cerebro de la irradiación de rayos X y el tratamiento sistémico TMZ a dosis comparables a SOC clínica. Las células T CAR se entregan por vía intravenosa a los anfitriones lymphodepleted. El siguiente procedimiento se describe en siete fases separadas: (1) La administración de temozolomida a (3) Transfección Ratones portadores de tumores, (2) la irradiación de todo el cerebro de ratones portadores de tumores,, (4) La esplenectomía y células T Preparación, (5 ) Transducción, (6) Cultura de células T CAR y cosecha, y (7) la administración de células T CAR a ratones portadores de tumores. Estas fases consisten en varias etapas que abarcan 6-7 días y se realizan simultáneamente.

<table><tbody><tr><td>Vector de empaquetado de retrovirus pCL-Eco</td><td>Imgenex</td><td>10045P</td><td>Vector auxiliar para generar retrovirus CAR</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2010</td><td>Mitógeno no específico para inducir la proliferación de células T y la transducción viral</td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>ClonTech/Takara</td><td>T100B</td><td>Facilita la transducción retroviral de células T</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>DMEM, alta glucosa, piruvato</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>HEK293 medio de cultivo</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Medios de cultivo de células T</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td> Life <td>technologies</td><td>11058-021 Medios de</td><td>transfección</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamina</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td>suplemento de medios para cultivo de células T</td></tr><tr><td>100 mM Piruvato de sodio</td><td>Life technologies</td><td>11360-070 Suplemento de</td><td>medios para cultivo de células T</td></tr><tr><td>100X MEM Solución de aminoácidos no esenciales</td><td>Life technologies</td><td>11140-050</td><td>Suplemento de medios para cultivo de células T</td></tr><tr><td>55 mM 2-Mercaptoetanol</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td>Agente reductor para eliminar los radicales libres</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122 Suplemento de medios de</td><td>cultivo de células T</td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15750-060 Suplemento de medios de</td><td>cultivo de células T</td></tr><tr><td>GemCell Suero bovina fetal de origen estadounidense</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Proporciona factores de crecimiento y nutrientes para el crecimiento celular in vitro</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA), fracción V&ndash; Productos</td><td>Gemini Bio de</td> grado estándar <td>700-100P</td><td>Bloquea la unión no específica del retrovirus a placas recubiertas de retronectina</td></tr><tr><td>Pharm Lyse (concentrado 10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Lisa los glóbulos rojos durante el procesamiento de los esplenocitos</td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtros de células estériles</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Filtra las partículas de tejido grandes durante el procesamiento de esplenocitos</td></tr><tr><td>Placas de cultivo BioCoat de 100 mm con Poly-D-Lisina</td><td>Corning</td><td>356469</td><td>Promueve la adhesión de las células HEK293 para maximizar la proliferación después de la transfección</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Temozolomida</td><td>Best Pharmatech</td><td>N/A</td><td>Polvo liofilizado preparado el día de la administración</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td>Life Sciences</td><td>D2650</td><td>Necesario para la disolución completa de la temozolomida</td></tr><tr><td>Salina</td><td>Hospira</td><td>IM 0132 (5/04)</td><td>Disolvente para temozolomida y ketamina/xilacina</td></tr><tr><td>Ketathesia HCl</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>11695-0701-1</td><td>Solución de ketamina</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Lloyd Inc</td><td>N/A</td><td>Solución estéril de xilacina 100 mg/ml</td></tr></tbody></table>

generación de células t car para realizar la terapia adoptiva en el contexto de glioblastoma estándar de cuidado

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

La inmunoterapia adoptiva de células T ofrece una estrategia prometedora para atacar y eliminar específicamente los gliomas malignos. Los linfocitos T pueden modificarse ex vivo para expresar receptores de antígenos quiméricos específicos para los antígenos del glioma (linfocitos T con CAR). La expansión y la función de las células CAR-T transferidas por adopción pueden verse potenciadas por los efectos linfodepletivos y tumoricidas de la quimioterapia y la radioterapia de tratamiento estándar. Describimos un método para generar células T con CAR dirigidas a EGFRvIII, un antígeno específico del glioma, y evaluamos su eficacia cuando se combinan con un modelo murino de tratamiento estándar para el glioblastoma. Las células T se modifican mediante transducción con un vector retroviral que contiene el gen CAR anti-EGFRvIII. Los animales portadores de tumores se someten al condicionamiento del huésped mediante un ciclo de temozolomida e irradiación de todo el cerebro a regímenes de dosis diseñados para modelar el estándar clínico de atención. A continuación, las células CAR-T se administran por vía intravenosa a los huéspedes preparados. Este método se puede utilizar para evaluar la eficacia antitumoral de las células T con CAR en el contexto del tratamiento estándar.

Las células T CAR son generados por la transducción con el vector retroviral EGFRvIII CAR 11. Este vector, MSGV1, se desarrolló a partir del vector SFGtcLuc_ITE4 35, que contiene el virus de células madre murinas (MSCV) repeticiones terminales largas, la extendida región gag y sitio de empalme sobre (donador de empalme, sd, y aceptor de empalme, sa), y viral señal de empaquetamiento (ψ). El CAR EGFRvIII que contiene el fragmento humano anti-EGFRvIII de una sola cadena variable (scFv) 139, en tándem...

Los efectos linfodepletorios e inmunomoduladores de la quimioterapia y la radiación estándar pueden aprovecharse para mejorar la eficacia antitumoral de la inmunoterapia con células T. Describimos un método para generar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas de EGFRvIII y administrarlas en el contexto del tratamiento estándar del glioblastoma.

Generación de células T CAR para realizar la terapia adoptiva en el contexto de Glioblastoma estándar de cuidado

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

El objetivo general de este procedimiento es generar linfocitos T murinos modificados genéticamente con receptores de antígeno quiméricos y evaluar su eficacia en el contexto del tratamiento estándar. Para el glioma de alto grado, esto se logra primero iniciando el tratamiento estándar, que incluye radiación cerebral total y administración de temozolomida a ratones. A continuación, se produce un retrovirus que expresa el vector car, y luego los linfocitos T murinos se transducen con el retrovirus car.Finalmente, las células CAR T se administran a ratones tratados con la terapia estándar, con la entrega final de células CAR T en combinación con irradiación cerebral completa y temozolomida. Esta administración se utiliza para evaluar si la preparación del huésped mediante la terapia estándar mejora la eficacia de una plataforma de linfocitos T adoptiva. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunoterapia de tumores cerebrales, como la eficacia antitumoral de nuevas inmunoterapias en el contexto del tratamiento estándar para gliomas de alto grado.Aunque este método puede proporcionar información sobre la eficacia de los linfocitos T y mi modificados genéticamente frente a gliomas de alto grado, también puede aplicarse a otros sistemas, como la evaluación de la terapia con linfocitos T contra modelos de tumores de melanoma, pulmón y otras metástasis cerebrales. En general, las personas nuevas en este método podrían tener dificultades, ya que este procedimiento requiere que se realicen varios pasos en paralelo.Por lo tanto, planificar y organizar las tareas es fundamental. La demostración del procedimiento estará a cargo de Catherine Uni y Carter s Deva, ambos estudiantes de posgrado talentosos de mi laboratorio. Después de preparar tres miligramos por mililitro de temozolomida o TMZ en DMSO, coloque la solución en un vaso de precipitados con agua sobre una placa calefactora a 65 grados Celsius durante 10 a 15 minutos.Una vez que el TMZ se haya disuelto completamente, la solución deberá adquirir un color amarillo pálido. Llene completamente 15 jeringas de un mililitro con la solución de TMZ. El TMZ debe administrarse dentro de los 90 minutos posteriores a su preparación para asegurar que no se produzca precipitación del TMZ en la solución; encienda la fuente de irradiación de cerebro completo en el irradiador de rayos X y permita que se caliente, asegúrese de que el filtro adecuado esté colocado e introduzca los ajustes correctos de voltaje y corriente.Una vez que los ratones hayan sido sedados, según el protocolo descrito, coloque los ratones sedados sobre la rejilla con sus cabezas posicionadas en el área que recibe la mayor intensidad de rayos X. Utilice tubos de plomo para proteger los cuerpos desde el cuello hacia abajo, bloqueando así la exposición sistémica a los rayos X. Coloque los ratones dentro de la máquina de rayos X cuando finalice la administración de rayos X.Retire los animales del irradiador. Cuando los animales recuperen suficiente conciencia y mantengan una posición esternal recostada, colóquelos de nuevo en sus jaulas correspondientes. Después de preparar el medio D 10 y cosechar las células HEC 293T según el protocolo descrito en el texto, agregue un mililitro de suspensión celular a 7,5 × 10⁶ células por mililitro en cada placa de 10 centímetros recubierta con poli-L-lisina que contenga 10 mililitros de medio D 10, e incube durante la noche. Al día siguiente, continúe con el procedimiento.Y tras preparar el plásmido de carro y el reactivo de transfección según se describe en el protocolo escrito, añada la complejo de lípidos y ADN gota a gota a las células T HEC 2 93 e incube durante seis a ocho horas. Luego, sustituya el medio por 12 mililitros de medio fresco para células T o TCM. A continuación, vierta un bazo sobre un colador celular de malla de 70 micrómetros y desagregue utilizando el extremo romo del interior de una jeringa de cinco mililitros para obtener una suspensión de células individuales.Después de preparar un nuevo grupo de MTC, disocie el bazo en un tubo cónico de 50 mililitros en MTC y centrifugue para obtener el pellet. Elimine los glóbulos rojos utilizando cinco mililitros de tampón de lisis 1x por bazo, resuspendiendo las células mediante pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo. Coloque la suspensión celular en un baño de agua a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Retire la reacción de lisis del baño de agua y agregue MTC en una proporción uno a uno respecto al tampón de lisis para neutralizar la reacción. Lave mediante centrifugación a 300 Gs durante 10 minutos.Después de aspirar el sobrenadante, use dos mililitros por bazo de MCT para resuspender el sedimento. Para contar las células, agregue 10 microlitros de suspensión celular a 190 microlitros de azul de tripano. Una vez calculado el número total de células, use MCT suplementado con dos microgramos por mililitro de concanavalina A y 50 unidades internacionales por mililitro de interleucina-2 humana recombinante para diluir las células hasta una concentración de dos por 10 a la sexta células por mililitro. Agregue dos mililitros o cuatro por 10 a la sexta células a cada pocillo de una placa de cultivo celular tratada de 24 pocillos e incube durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono al día siguiente de la esplenectomía.Prepare PBS que contenga 25 microgramos por mililitro del fragmento recombinante de fibronectina humana o RHFF y recubra placas de 24 pocillos no tratadas para cultivo de tejidos, añadiendo 0,5 mililitros de la solución a cada pocillo al día siguiente. Retire la solución de los pocillos y añada un mililitro por pocillo de BSA al 2% en PBS e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.Luego, elimine la BSA invirtiendo firmemente la placa antes de agregar dos mililitros de PBS para lavar. Después de recolectar el sobrenadante viral de las células HEC 2 93 T, agregue TCM fresco hasta un volumen final en mililitros igual al número de pozos recubiertos con RHFF, más tres mililitros adicionales. Retire los citoesplénicos cultivados del incubador y resuspenda mediante pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo de dos a tres veces en cada uno.Transferiremos las suspensiones celulares a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, resuspenda las células en el sobrenadante viral hasta alcanzar una concentración de un por diez a la seis células por mililitro. Luego, añada un mililitro por pocillo de la suspensión celular a los pocillos de las placas recubiertas con RHFF.Ahora centrifugue las placas durante 90 minutos a 32 grados Celsius y 770 GS con una aceleración de cuatro y un frenado de cero durante la centrifugación. Prepare 50 unidades internacionales por mililitro de IL-2 humana recombinante en TCM. Después de la centrifugación, agregue un mililitro del medio a cada pocillo de las placas e incube durante la noche.Si las células T alcanzan una confluencia mayor al 80 %, divida las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo en cada pocillo dos o tres veces. Luego, transfiera un mililitro de cada pocillo a nuevos pocillos de una placa fresca de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Añada un mililitro de TCM fresco con 50 unidades internacionales por mililitro de IL-2 a cada pocillo; si las células no alcanzan una confluencia mayor al 80 %, cambie la mitad del medio pipeteando lentamente un mililitro de medio desde la parte superior de cada pocillo y reemplazándolo con un mililitro de TCM fresco que contenga 50 unidades internacionales por mililitro de IL-2 recombinante humana. Re_suspenda las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces en cada pocillo y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 250 mililitros.Centrifugar las células a 300 GS durante 10 minutos. A continuación, aspirar completamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado. Usar PBS para lavar las células, luego contarlas antes de lavarlas por segunda vez.Un rendimiento típico de células T con CAR es aproximadamente una vez 10 a la sexta células por pocillo con PBS Resus. Suspender las células a una concentración de cinco veces 10 a la séptima por mililitro para una inyección de una vez 10 a la séptima en un volumen de 200 microlitros para inyectar en ratones con tumores; utilizar una aguja de calibre 27 a 31 para cargar de 500 a 1000 microlitros en una jeringa de insulina asegurándose de que se expulsen todas las burbujas. Las células T con CAR se generaron mediante transducción con el vector retroviral CAR E GFR V tres, que contiene repeticiones terminales largas del virus de la leucemia de ratón o del virus de células madre murinas (MSCV).La región gag extendida, el sitio de empalme del envoltorio y una señal de empaquetamiento viral. El EG FFR V tres car que contiene el fragmento variable de cadena sencilla humano anti EEG FRV tres 1 39 se clonó en el vector retroviral en tándem con las regiones intracelulares del CD ocho murino, tm CD 28 4 1 BBB y CD tres zeta. Tras la transducción, las células T con CAR EG FFR V tres pueden cuantificarse y fenotiparse mediante citometría de flujo con un panel de dos colores compuesto por una multiera derivada de EG FFR V tres biotinilada conjugada a estreptavidina bico rina y anti CD tres fit C. Utilizando el protocolo descrito en este video, la expresión de CAR se observa habitualmente en un 55 a 70 % de las células T murinas positivas para CD tres.Las células T con CAR pueden caracterizarse fenotípicamente aún más mediante la adición de otros anticuerpos marcados con fluorocromo al panel de dos colores para CAR, como se observa en este ejemplo: la tinción para CD8 y CD4 muestra que el 70 % de los CAR transducidos son linfocitos T positivos para CD8, mientras que el 20 % son linfocitos T positivos para CD4. Una vez dominada esta técnica, puede realizarse en 12 horas distribuidas a lo largo de un período de una semana, si se lleva a cabo correctamente siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como ELISA, ELISPOT y/o tinción de citocinas intracelulares, pueden realizarse para responder preguntas adicionales.Por ejemplo, ¿sus linfocitos T transducidos con receptores de antígeno quiméricos responden funcionalmente al reconocimiento del antígeno y es su funcionalidad específica para el antígeno? No olvide que trabajar con retrovirus, temozolomida y radiación de rayos X puede ser extremadamente peligroso, y que existen consecuencias como la necesidad de operar bajo condiciones de BSL-2, usar equipo de protección personal, realizar experimentos en áreas designadas y obtener la capacitación adecuada para el manejo de animales.Y siempre se debe tener en cuenta el uso de equipos de rayos X al realizar estos procedimientos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica para la generación ex vivo de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de antígeno tumoral. Los vectores retrovirales portadores de ARN transgénico se mezclan con células de bazo en un medio suplementado con interleucina-2 para promover la supervivencia y proliferación de las células T. A continuación, la mezcla se transfiere a una placa recubierta con fragmentos de fibronectina humana recombinante y se centrifuga para facilitar la fusión del...

Una técnica ex vivo para generar células T receptoras de antígenos quiméricos específicos de tumores

Una metodología novedosa que se emplea para el tratamiento de glioblastomas recurrentes se describe. Este enfoque de tratamiento emplea la aplicación de tumor eléctrica alterna tratamiento de campos (TTFields), conocido como terapia TTF en combinación con bevacizumab, un agente vectorizado que está actualmente aprobado por la FDA como monoterapia.

Tumor Tratamiento Terapia del Campo en combinación con bevacizumab para el tratamiento de glioblastoma recurrente

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.

Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

Aquí, presentamos un protocolo para la producción y los ensayos preclínicos murinas CD19 coche de células de T por transducción retroviral y utilización como terapia contra establecido syngeneic A20 linfoma en ratones BALB/c con o sin lymphodepleting acondicionamiento previo.

Un modelo con ratones Syngeneic células B linfoma de evaluación preclínica de las células de T automóvil CD19

Aquí, describimos un método de cultivo in vitro de co para recurrentemente desafío orientada a tumor las células T, que permite el análisis fenotípico y funcional de la actividad de las células T antitumorales.

En Vitro Tumor celular Rechallenge de evaluación predictiva de antígeno quimérico del Receptor de la célula T función antitumoral

Describimos un enfoque para generar de forma fiable células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) y probar su diferenciación y función in vitro e in vivo.

Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

Los tumores del sistema nervioso central (SNC) son la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en los niños, y las terapias locorregionales basadas en el sistema inmunitario se están probando cada vez más para pacientes en ensayos clínicos. Este protocolo describe métodos para la implantación de cánulas locorregionales en ratones para la evaluación preclínica de infusiones inmunoterapéuticas dirigidas a tumores del SNC.

Implantación de cánula intracraneal para infusiones seriadas de células T con receptor de antígeno quimérico locorregional (CAR) en ratones

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Este protocolo describe un procedimiento detallado para generar células T con receptor de antígeno quimérico transitorio (CAR) utilizando ARNm no integrador para la inmunoterapia contra el cáncer y proporciona métodos confiables para evaluar las células CAR-T y su función citotóxica.

Un enfoque no viral para generar células T receptoras de antígenos quiméricos transitorios mediante ARNm para la inmunoterapia contra el cáncer

Aprende a generar células T CAR específicas para EGFRvIII y evaluar su eficacia en glioblastoma combinadas con radiación cerebral y temozolomide en ratones. Este método mejora la inmunoterapia adoptiva.

Generación de células T CAR para realizar la terapia adoptiva en el contexto de Glioblastoma estándar de cuidado

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