La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la diferenciación de micro ARN, el perfil y la validación de Mr.NA objetivo de una línea de células madre neurales humanas. Esto se logra cultivando primero células madre neurales humanas en un sistema de cultivo tridimensional para inducir la diferenciación celular. El segundo paso es cuantificar la diferenciación midiendo el crecimiento del proceso axónico.

A continuación, los cambios en la expresión de micro ARN se evalúan mediante una matriz micro R-N-A-P-C-R. A continuación, se realiza un análisis computacional de microARN seleccionados expresados diferencialmente para identificar un conjunto de ARNm diana putativos. En última instancia, los ARNm diana se validan mediante plásmido reportero, transfección y un ensayo de luciferasa dual.

Por lo tanto, el método que se presentará aquí puede ayudar a responder problemas clave en el campo de las células madre neurales, como la caracterización de los microARN expresados, y se dirigen a los ARN mensajeros en las células madre neurales humanas cuando están en proceso de diferenciación. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la biología de las células madre neurales. También se puede aplicar a otros sistemas de células madre, como las células madre mesenquimales, las células madre pluripotentes inducidas u otros sistemas que requieren inducción de diferenciación y caracterización molecular.

La demostración visual de este método desglosa los pasos críticos en la diferenciación de una línea de células madre neuros humanas y la investigación del perfil de microARN y la validación del ARNm objetivo demuestra que parte del procedimiento será lavania, un científico de mi laboratorio. Todo este procedimiento debe realizarse en una cabina de seguridad biológica utilizando técnicas asépticas. Rehidrate los andamios añadiéndolos a cada pozo del AL VX 12.

Plato de pozo de dos mililitros de etanol al 70% preparado con agua para riego. Evite tocar los andamios dispensando el etanol al 70% por la pared de cada uno. Aspire cuidadosamente el etanol al 70% e inmediatamente lave los andamios con dos mililitros por pocillo de D-M-E-M-F 12 durante un minuto.

Repita el procedimiento de lavado dos veces, aspire cuidadosamente el D-M-E-M-F 12 después del lavado final. Cubra los andamios añadiendo dos mililitros de laminina en D-M-E-M-F 12 a cada uno. Incubar bien la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% durante un mínimo de dos horas.

A continuación, lave el plato con D-M-E-M-F 12 semillas tibias en cada andamio con aproximadamente 500.000 células madre neurales humanas o H nscs en un volumen de 150 microlitros de medio RMM con factores de crecimiento. Incube la placa durante tres horas para permitir que las células se asienten en los andamios después de tres horas. Agregue 3,5 mililitros de RMM a cada pocillo, teniendo cuidado de no desalojar las células de los andamios.

Incubar la placa durante siete o 21 días. Reemplace el medio RMM después de un día, que es la primera alimentación, y reemplace el medio nuevamente dos o tres días después de la primera alimentación. Siete y 21 días después de la cultura 3D de H nscs.

Retire el medio RMM y fije las celdas diferenciadas con 4% de aldehído paraformado. A continuación, las células fijas se tiñen utilizando un anticuerpo primario de tubulina beta tres detectado con un fluorocromo conjugado. Los núcleos de las células de anticuerpos secundarios se contratiñen con ganchos.

Captura imágenes representativas de las células teñidas con beta tres tubulina. Con un microscopio fluorescente, guarde las imágenes en formato TIFF o JPEG. La medición del crecimiento del proceso axónico se realiza utilizando la herramienta de medición del software image PRO plus seven.

Para comenzar a abrir la imagen, seleccione la opción de medición en la barra de herramientas y seleccione la función de rastreo. Para iniciar el trazado, seleccione el punto de inicio en la excrecencia del axón haciendo clic con el botón del ratón trazar a lo largo de toda la longitud de la excrecencia del axón, haga clic con el botón derecho para finalizar cada trazo. De esta manera, mida todas las excrecencias de los axones dentro del campo de visión exprese medidas como píxeles o micrómetros.

Exporte las mediciones de longitud a un programa de hoja de cálculo para el análisis comparativo y estadístico de muestras para evaluar los cambios en la expresión de micro ARN de las HSC cultivadas tridimensionalmente. En primer lugar, realice la extracción de micro ARN y la preparación de micro ARN CD NA como se describe en el protocolo adjunto. Texto inmediatamente después de obtener el micro ARN CD, NA.

Prepare la mezcla de componentes de PCR para la PCR en tiempo real en un tubo de 15 mililitros. Agregue 1375 microlitros de una mezcla maestra verde de dos X-S-Y-B-R. 100 microlitros de micro RNA CD NA, 275 microlitros del cebador universal y 1000 microlitros de RNAs de transferencia de agua libre.

Los componentes de PCR se mezclan en un depósito de carga de PCR. Retire con cuidado la matriz de PCR de placa de 96 pocillos de su bolsa sellada. Con una pipeta multicanal, agregue 25 microlitros de los componentes de PCR.

Mezcle en cada pocillo de la matriz de PCR. Cambie las puntas de las pipetas después de cada paso de pipeteo para evitar la contaminación cruzada entre el sello de los pocillos. La placa de 96 pocillos con película adhesiva óptica y centrífuga durante un minuto a 1000 GS a temperatura ambiente para eliminar las burbujas, inspeccione visualmente la placa para asegurarse de que no haya burbujas en el lugar de los pocillos.

La matriz de PCR de placa de 96 pocillos en el programa de ciclador en tiempo real. El ciclador en tiempo real en consecuencia. Posteriormente, exporte los valores de CT para todos los pocillos a una hoja de cálculo de Excel en blanco para el análisis de datos de matriz de PCR, un algoritmo que está disponible en línea PIC ktar se utiliza para la identificación de objetivos de micro ARN predichos.

Haga clic en, haga clic aquí para la predicción de pic ktar en vertebrados para abrir una nueva página en la interfaz web de PIC KTAR. Elija la especie en el menú desplegable e inserte el micro ARN de interés en el cuadro de identificación de micro ARN. Haga clic en la búsqueda de objetivos de un micro ARN.

Se presentará una lista de ARNm diana clasificados por una puntuación PIC KTAR. Las clasificaciones obtenidas se utilizan para compilar una tabla comparativa de microARN. Se utiliza un plásmido indicador de luciferasa dual como herramienta para validar las actividades de luciferasa y luciferasa renal de los ARNm diana 24 horas después de la transfección de las células hela.

Prepare la solución de trabajo uno agregando 50 microlitros de sustrato, uno en 10 mililitros de solución uno y mezclando bien, elimine el medio de crecimiento celular de cada pocillo de la placa de 24 pocillos y agregue 300 microlitros de solución de trabajo uno a cada uno. Transfiera el pozo 100 microlitros del contenido de cada pocillo. De la placa de 24 pocillos a tres pocillos de una placa de 96 pocillos, espere 10 minutos y luego mida la actividad de la luciferasa de luciferasa luciérnaga en un luminómetro para la adquisición de luminiscencia.

Prepare la solución de trabajo dos agregando 50 microlitros de sustrato, de dos a 10 mililitros de solución dos y mezclando bien. Agregue 100 microlitros de solución de trabajo, dos en cada pocillo de la placa de 96 pocillos que ya contiene 100 microlitros de solución de trabajo. Se espera 10 minutos y luego se mide la actividad de la luciferasa renal.

Posteriormente, se calcula la relación entre la luminiscencia de la luciferasa luciérnaga y la luciferasa renal. Se adquirieron microfotografías representativas de H NSCS en andamios 3D después de la tinción inmunoquímica para beta tres tubulina mostrada en verde y la tinción de contador de núcleos con ganchos mostrada en azul La medición de los procesos axónicos se realizó con la ayuda de software de análisis de imágenes. Una comparación del crecimiento del proceso axónico entre las H nsc cultivadas con andamios 3D y con los cultivos tradicionales de superficie plana o 2D muestra que en una o tres semanas las HSC diferenciadas en 3D exhibieron un mayor crecimiento del proceso axónico.

El análisis computacional para la predicción de objetivos dio como resultado la información que se presenta aquí: una lista de microARN, genes objetivo predichos y precisión, puntuación y valores agregados. SOX cinco y NR cuatro A tres fueron identificados como genes diana putativos. Se utilizó un ensayo indicador de luciferasa dual para validar los objetivos de los microARN, como se muestra aquí.

La actividad relativa de la luciferasa de los tres reporteros UTR principales humanos de los genes SOX cinco y NR cuatro A tres se redujo significativamente en presencia de los microARN indicados. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diferenciarlo en células madre neurales e investigar la expresión de micro ARN y la validación de Messenger.RNA objetivo.