Name: El cultivo de Heligmosomoides polygyrus: Un inmunomodulador nematodo parásito y sus productos secretados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Aprende a cultivar el nematodo Heligmosomoides polygyrus en ratones y aisl sus moléculas secretadas con propiedades inmunomoduladoras. Este protocolo permite estudiar mecanismos de supresión inmune y explorar aplicaciones terapéuticas en alergias y enfermedades autoinmunes.

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Los autores están financiados por el Wellcome Trust a través de la Vía Académica Clínica de Edimburgo (C.J.C.J.) y la financiación del Programa de Becas (Y.H., y R.M.M.) y Fellowship (J.R.G.), el BBSRC (G.C.), la Fundación Americana del Asma (E.R., H.J.McS. y R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) y la Fundación Rainin (D.J.S. y R.M.M.).

NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo se realiza de acuerdo con las directrices establecidas por el Reino Interior del Reino y de la Universidad de los Servicios Veterinarios de Edimburgo. 1. La infección de ratones por sonda <ol><li> Tienda Heligmosomoides polygyrus L3 larvas en agua destilada durante un máximo de seis meses a 4 ° C. </li><li> Antes de su uso, lavar larvas L3 tres veces en agua destilada: centrifugar a 300 xg durante 10 min (con freno), pero eliminar todos los 500 l de agua (para evitar larvas L3 granulado perturbador) y resuspender el pellet cada vez. </li><li> Para el tercer lavado, añadir agua a un volumen exacto (típicamente 40 ml) y aspirado de 20 l con un corte de punta de 200 l para ampliar su abertura. Coloque dos 20 muestras mu l sobre la superficie de una placa de cultivo de 60 mm y contar las larvas L3 (generalmente móvil, y el mejor se observa bajo magnificación 50X con un microscopio de disección). Resuspender el sedimento final en agua destilada a una concentration de 2.000 L3 larvas por ml. </li><li> Para la producción del ciclo de vida, infectar F1 (C57BL / 6xCBA) ratones 8 semanas de edad con 400 H. larvas L3 polygyrus en 200 l de agua destilada por sonda oral (restringir ratones en la posición vertical por la piel del cuello y pasar suavemente la aguja de sonda roma a través de la boca y el esófago hasta el estómago). Agitar bien antes de cada infección (larvas depositan rápidamente en agua) y aspirado de 200 l en una jeringa de 1 ml; utilizar una aguja de sonda dedicado con un extremo redondeado. Para la infección experimental de ratones más jóvenes (6-8 semanas de edad), o de otras cepas puras (por ejemplo, C57BL / 6 o BALBc), infectar a los ratones con 200 larvas L3. </li></ol> 2. Propagación y Mantenimiento de H. polygyrus <ol><li> Coloque el carbón en el centro de una gran tina de plástico y deje que el agua fría del grifo corra sobre ella durante un mínimo de 30 min (carbón activado sin lavar es tóxico para las larvas L3). Escurrir el agua de la bañera y colocar el carbón de leña en two capas de papel absorbente, dejándolo expuesto al aire ambiente hasta que esté completamente seco. </li><li> Si se necesitan huevos, raspar heces primero fuera del colon con pinzas y tijeras (si es necesario). Si se necesita un gran número de larvas L3, colocar los ratones en una rejilla de alambre y recoger bolitas fecales durante varios días. </li><li> Mezclar las heces con carbón granulado en una proporción de al menos un 1: 1, para lograr una consistencia humedad suficiente para adherirse a papel de filtro. Unte una capa delgada en el centro de un poco de papel de filtro humedecido en una placa de Petri y colocar esto en una caja húmeda (añadir un poco de toalla de papel húmeda y un plato de agua) en la oscuridad durante 12-14 días. </li><li> Eliminar larvas L3 de día 7 en adelante, y recogerlas en al menos dos ocasiones antes se descarta el papel. Las larvas forman un anillo alrededor del borde del papel de filtro; levantar el papel de filtro fuera de la placa de Petri y enjuagar las larvas que quedaron de la placa (utilizando una pipeta y 5 ml de agua estéril por placa) en un tubo de 50 ml. </li><li> Ascensoren el papel de filtro y la cosecha de las larvas restante dejado en el plato con agua destilada en un tubo de 50 ml. Centrifugar la solución efluente a 300 xg durante 10 min. Lavar las larvas tres veces con agua destilada y luego se almacena a 4 ° C en un máximo de 50 ml de agua destilada hasta que se requiera. NOTA: Las larvas permanecen viables e infecciosos durante al menos 6 meses. </li></ol> 3. Recolección de Adultos H. polygyrus Worms <ol><li> Preparar el aparato de Baermann modificado de antemano como se muestra en la Figura 1. </li><li> Ratones Cull Catorce días después de la infección. </li><li> Lavar el abdomen con etanol al 70%. Cortar la piel sobre el abdomen y tire hacia atrás para revelar la pared abdominal anterior. Haga incisión media para entrar en la cavidad peritoneal. </li><li> Eliminar todo el intestino delgado y grueso (de duodeno proximal al recto distal). Coloque en un plato de Petri seco. </li><li> Enderezar el intestino a lo largo de toda su longitud; extirpar el colon heces que contienen; colocar esto en un plato aparte para los preparados de huevo posteriores. </li><li> Escindir el proximales 20 cm de intestino delgado que contiene los gusanos adultos, identificados por la pared relativamente gruesa del duodeno y con frecuencia una apariencia de color rojo debido a los gusanos intra-luminal. Colocar en una (100 mm de diámetro) placa de Petri con 5 ml de solución de Hanks, se calentó a 37 ° C (dos especímenes por plato). </li><li> Abra la porción proximal del intestino gusano lleno longitudinalmente con tijeras (tijeras ronda terminado son los mejores para esto), y raspar el interior del intestino forro con dos láminas de vidrio para eliminar los gusanos. Luego deseche la pared del tubo digestivo limpio. </li><li> Gusanos punta en pequeñas bolsas de muselina, grapa cerradas y seguras con clips alrededor del borde del embudo de vidrio (Figura 1). </li><li> Llenar el embudo con la solución de Hanks y añadir aproximadamente 4 placas de Petri de gusanos en cada embudo. </li><li> Coloque el aparato en incubadora a 37ºC durante 1-2 horas, agitando suavemente a medio camino para desalojarresiduos de la preparación intestinal que puede ocluir el filtro de muselina. Tenga cuidado para evitar vertidos de escombros fuera de la bolsa de muselina - esto hará que la contaminación de la preparación final HES. Los gusanos adultos deberían haber emigrado lentamente a través de la tela de muselina y se instaló en la parte inferior del tubo de ensayo de vidrio. Cuidadosamente separe el tubo de ensayo de la manguera de caucho de conexión sobre el fregadero (teniendo cuidado de evitar la pérdida de gusanos en este punto). </li><li> Con una pipeta de plástico, transferir los gusanos en un tubo de 50 ml y lavar seis veces con Hanks &#39;solución (permiten gusanos se asienten con la gravedad, extraiga el soporte con un stripette, agregar 40 ml de Hanks&#39; solución y repita cinco veces). NOTA: lombricultura debe mantenerse estéril desde este punto en adelante. <ol><li> Mover a una campana de flujo laminar y lavar otras seis veces en solución estéril de Hank suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, listo para el cultivo in vitro. </li></ol></li><li> Cuente elgusanos adultos recuperados por la toma de dos muestras de 20 l tomadas con un corte de punta amarilla para ampliar su apertura; esperar que aproximadamente el 50% de la cantidad de larvas inoculado. </li></ol> 4. Configuración de las Culturas de HES: Preparación mediana, Lavado gusanos adultos <ol><li> Remojar los gusanos de 3,11 en aproximadamente 10 ml de RPMI suplementado con 10% de gentamicina durante 20 min, dejando el tubo de reposo en un ángulo para asegurar gusanos están completamente cubiertos. </li><li> Realice esto en una campana de flujo laminar: lavar de nuevo seis veces con solución de Hanks (suplementado con 5 U / ml de penicilina y 5 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Preparar H. medios polygrus. </li><li> El mantenimiento de la esterilidad en una campana de flujo laminar, a 500 ml de RPMI1640, añadir 11,1 ml de 45% de glucosa (concentración final 1,2% como RPMI1640 contiene 0,2% de glucosa), 5 ml de 100x Peniclllin-estreptomicina (concentración final 5 U / ml de penicilina, 5 mg / ml de estreptomicina), 5 ml de L-glutamina (concentración final 2 mM), y5 ml de Gentamicina (concentración final 1%). No agregue FCS. </li><li> Gusanos alícuotas en frascos T25 ventilados, aprox. 1.000 gusanos en 15 ml H. polygyrus medios de comunicación por matraz, y el lugar en posición vertical en 37 ° C incubadora (5% CO 2) durante 3 semanas. </li></ol> 5. Preparación de HES <ol><li> Recoger HES contienen medios de cultivo a partir de cultivos a intervalos de no más de dos veces por semana, dejando de lado la primera colección después de 24 horas de cultivo (debido a los altos niveles de contaminación por LPS y proteínas del huésped - se puede procesar por separado o se descarta). Mantenga cada recogida selectiva y claramente etiquetado con la fecha y número de lote. Reemplace con un volumen igual de H. polygyrus medios en cada ocasión. </li><li> Centrifugar HES que contiene el medio a 400 x g durante 5 min. Luego filtrar esterilizar a través de 0,2 micras filtros baja en proteínas de unión en tubos de 50 ml. Conservar en el congelador a -20ºC claramente etiquetado con la fecha de la cosecha de gusano y la fecha de HES collection. </li><li> Después de 21 días de recolección de HES de la cultura, deseche gusanos. </li><li> Piscina 500-1.000 ml de HES sobrenadante (por lo general de madre congelada, y no como la recogida primeras 24 h) y concentrarse sobre un filtro de 3.000 MWCO en el dispositivo de ultrafiltración bajo presión de nitrógeno. NOTA: Tenga mucho cuidado de no dejar correr el filtro seco. <ol><li> Para configurar el dispositivo de filtro, lavar primero el lado brillante de la membrana 3 kDa abajo en un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada durante 3 x 20 min mientras se agitaba. Montar el dispositivo de ultrafiltración según las instrucciones del fabricante con membrana de filtro lado brillante hacia arriba. Lugar en el gabinete a 4 ° C y pasar 50 ml de agua destilada a través antes de comenzar a concentrarse HES agrupados. </li><li> Añadir cada tubo de HES en el dispositivo de filtración según sea necesario (100-140 ml por día), hasta que el volumen se concentró hasta 2-5 ml. </li></ol></li><li> Con el fin de eliminar los contaminantes de los medios de cultivo que contienen HES, añadir 50 ml de pyrfibrinógeno libre de PBS para el dispositivo de filtración y a continuación concentrar hasta aproximadamente 2 ml. Repita este paso dos veces (150 ml de PBS en total). Transferencia de HES en un tubo de 15 ml, esterilizar filtro (con un filtro de 0,2 micras) en una campana de flujo laminar y medir la concentración de proteína usando un espectrofotómetro (E 280 = 10) o por el ensayo de Bradford. </li><li> Alícuota, etiqueta con el número de lote y la fecha, y la congelación a -80 ° C. </li><li> Realizar un ensayo LAL cromogénico de acuerdo con los protocolos del fabricante en cada lote de HES antes de su uso. Si los niveles de LPS son mayores que 1 U LPS por 1 g de proteína, considere no utilizar este lote para experimentos in vivo o en cultivos in vitro. </li><li> Procesar las HES recogidos a las 24 horas por separado de la misma manera; Contendrá LPS y algunas proteínas del huésped y, aunque no es adecuado para experimentos funcionales, es una fuente útil de moléculas individuales que pueden ser aislados mediante purificación por afinidad de anticuerpos monoclonales. </li></ol&gt;

Los autores no tienen conflictos de intereses.

El ciclo de vida de H. polygyrus procede de una manera fiable consistente. Después de la ingestión natural o sonda oral de larvas L3 en el día 0, los quistes empiezan a formarse debajo de la serosa duodenal por día 5, progresando a mudas larvarias y luego emergiendo como gusanos adultos en el lumen intestinal a partir de 10 días, los huevos se pueden ver en las heces de días 14 y granulomas son visibles en la superficie serosa duodenal de día 21. El protocolo descrito anteriormente (y que se resumen en la Figura 6) permite la producción de alto rendimiento de H. productos polygyrus excreción-secreción (HES), además de la recuperación fiable de larvas L3 viable para futuras infecciones experimentales y su duración máxima. Infección por H. polygyrus ha demostrado ser protectora en modelos de asma dependientes de OVA o Der p 1 (ácaros del polvo doméstico alergeno) 14. Además, la supresión de la inflamación de las vías respiratorias puede ser transferido con CD4 + CD25 + </sup&gt; células T reguladoras 14 o CD19 + CD23 hi células B reguladoras 24 de no sensibilizados, H. polygyrus infectados ratones. En los modelos de autoinmunidad, H. infección polygyrus ha demostrado ser supresivo en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) de la esclerosis múltiple 9, y la supresión puede ser transferida con células T CD4 + CD19 + o células B de ratones infectados 24. Heligmosomoides polygyrus productos de excreción-secreción (HES) modulan la respuesta inmune del huésped y suprimir la inflamación mediada por Th2 por una serie de mecanismos (descritas en la Figura 7), incluyendo: a) La inhibición de la respuesta de las células dendríticas a la estimulación 25, b) la inducción de CD4 Las células T reguladoras Foxp3 + + 18. y c) el bloqueo de IL-33 de producción 20. HES ha demostrado ser protectora cuando se administra unat sensibilización o desafío en el modelo OVA-alumbre de asma 19 y también cuando se administra por vía intranasal con alérgeno extracto de Alternaria 20, a través de la supresión de la primera liberación de IL-33. Evitar la contaminación LPS de HES es a menudo crucial para el éxito de los futuros experimentos inmunológicos. En el protocolo descrito aquí, los pasos críticos en el logro de este son asegurar que los desechos contenidos en las bolsas de muselina del Aparato Baermann no entre en la preparación HES final (véase 2.10) y dejar de lado la solución ES de las primeras 24 horas de cultivo (ver 5.1). En los últimos años, HES se ha caracterizado a fondo en el nivel proteómico con más de 370 proteínas distintas identificadas 26,27. Además, ES larvas de la cuarta etapa ha sido sometido a análisis proteómico 28. El trabajo en curso incluye la caracterización de los principales componentes de glicanos de HES, se sabe que son fuertemente inmunogénico 3, y se secreta micro-RNComo que están encapsulados en vesículas 50-100 nm o exosomas (Buck et al., Presentado para su publicación). Con el establecimiento de protocolos reproducibles para la recogida de ES de este parásito altamente inmunomodulador, y con gran cantidad de datos proteómicos que identifican los componentes moleculares de HES, el escenario está listo para la identificación y prueba terapéutica de las moléculas individuales de H. polygyrus que pueden mediar efectos fundamentales sobre el sistema inmune del huésped.

Heligmosomoides polygyrus es un helminto gastrointestinal murino natural que está estrechamente relacionado con altamente prevalentes nematodos parásitos humanos 1. En contraste con otros modelos de nematodos tales como Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus establece consistentemente infección crónica en ratones como un resultado directo de múltiples mecanismos potentes inmunomoduladores que emplea para suprimir la respuesta inmune 2 host. H. polygyrus tiene un ciclo de vida directo: larvas L3 infectivas son ingeridas por la transmisión de FECO oral (o se administra por sonda oral en el laboratorio), con lo cual migran a la capa subserosa del duodeno y se enquistan antes de regresar a la luz intestinal como gusanos adultos aproximadamente ocho días después de la infección inicial. El apareamiento y producción de huevos se produce a los 10 días y es posible cosechar los gusanos adultos para la cultura y la recolección de productos de excreción-secreción de day 14 en adelante 3. H. polygyrus también interactúa con la microflora comensal, con un aumento de lactobacilos presentes en ratones susceptibles infectados 4-6, y el aumento de los niveles de H. infección polygyrus tras la exposición de ratones a los lactobacilos 6. La infección activa por H. polygyrus se ha demostrado que protege contra la inmunopatología en muchos modelos animales de autoinmunidad 7-10, colitis 11,12 y alergia 13-16. No ha habido en consecuencia un gran interés en el potencial de las moléculas excretor-secretoras de este parásito (&quot;HES&quot;) para abajo-modulan patología en vivo 17,18. De hecho, los efectos protectores se ven después del tratamiento de ratones con productos de HES 19 a través de vías que están siendo identificados 18,20. Aquí se describe un protocolo para la producción fiable de Heligmosomoides polygyrus y la recuperación de sus productos secretadosque pueden ser utilizados adicionalmente para una serie de investigaciones bioquímicas e inmunológicas funcionales.

<table><tbody><tr><td>Concentrador de amicon</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Modelo 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada de Hanks</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Carbón activado</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Solución de glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solución http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Tubos Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>Matraces T25</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&nbsp;</td><td>Matraz ventilado de 25cm http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Ensayo cromogénico LAL</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 ensayo http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; sin L-glutamina http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

el cultivo de<em&gt; heligmosomoides polygyrus:</em&gt; un inmunomodulador nematodo parásito y sus productos secretados

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (anteriormente conocido como Nematospiroides dubius, y también referido por algunos como H. bakeri) es un helminto gastrointestinal que emplea varios mecanismos inmunomoduladores para establecer la infección crónica en ratones y se parece bastante infecciones por helmintos humanos prevalentes. H. polygyrus se ha estudiado ampliamente en el campo de la regulación inmune helmintos derivados y se ha encontrado para suprimir potentemente modelos experimentales de alergia y autoinmunidad (ambos con infección activa y productos secretados aislados). El protocolo se describe en este documento se describen la gestión de la H. ciclo de vida polygyrus para la producción constante de larvas L3, la recuperación de los parásitos adultos, y la recolección de sus productos de excreción-secreción (HES).

La susceptibilidad a la infección con H. polygyrus es controlada en gran medida por el fondo genético de la cepa de ratón (Tabla 1); Ratones C57BL / 6 y CBA son altamente susceptibles 21,22. Para el mantenimiento del ciclo de vida del parásito, el híbrido F1 entre estas dos cepas ha sido elegido por su capacidad para soportar cargas de gusano mucho más altas sin la morbilidad (daño epitelial intestinal excesiva) en comparación con cualquiera cepa parental. Sonda oral de 400 larvas L3 se utiliza para mantener el ciclo de vida en ratones F1 (que resulta en la carga de helmintos adultos que se muestran en la Figura 2), mientras que una dosis de 200 larvas L3 se utiliza generalmente para los experimentos en cepas puras homocigotos (por ejemplo, C57BL / 6 o BALBc). Sin embargo, puede ser necesario reducir la función de co-factores ambientales que pueden diferir entre las instalaciones de animales, tales como las variaciones en la flora intestinal esta dosis. Los lotes de HES han demostrado efi reproduciblecacia en ensayos funcionales y en la composición de proteína; Además, cuando se analizaron los sobrenadantes de cada semana sucesiva de cultivo y hasta un total de 4 semanas, se encontró que los perfiles de proteínas a ser muy similares (Figura 3). Cuando la concentración de HES se mide mediante el ensayo de Bradford (véase 5.5), el total proteína es generalmente aproximadamente 1 mg / ml (Figura 4). Un método alternativo de la concentración de HES es con un concentrador centrífugo (por ejemplo Vivaspin membrana de corte de 3 kDa), en el que las muestras se centrifugaron a 4000 g hasta en un rotor de la centrifugadora swing-out, la eliminación de las sales tampón y componentes de bajo peso molecular. Concentración centrífuga es el más adecuado para los volúmenes de procesamiento pequeños (1-10 ml) y se limita a un factor de concentración máximo de aproximadamente 30x. Cuando la recogida de HES, la evitación de la contaminación es crítica. Para evitar la contaminación con moléculas huésped, descartamos HES-containing medios de cultivo de las primeras 24 horas después de la cosecha gusano adulto en el intestino del ratón. También cuantificar el nivel de contaminación LPS en cada lote de HES con un ensayo cromogénico LAL (ver 5.7). 1 U de LPS equivale a ~ 100 pg LPS y niveles por debajo de esta se considera despreciable 23. En nuestras manos, la mayoría de los lotes de HES están significativamente por debajo de este límite, la concentración media de LPS en HES ser 0,23 U / mg (Figura 5). Los efectos de LPS en modelos in vivo de la patología (por ejemplo, la supresión de las respuestas asmáticas) requiere al menos 10 ng de LPS 23. De ahí que la administración in vivo de 5 mg HES de un lote con 100 pg LPS / g HES incluirá 500 LPS PG, muy por debajo de la concentración efectiva donde LPS se convierte en un problema. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figura 1: Aparato Baermann Baerconfiguración Aparato mann para la recolección de adultos H. polygyrus (como se describe en la sección 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figura 2: La media de Gusano Carga 14 días después de la infección con 400 larvas L3 Mean gusano agobia 14 días después de la infección con 400 larvas L3. Los puntos de datos que se muestran son de 19 rondas de infección de ratones C57BL / 6xCBA. Media ± SEM muestra. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figura 3: Perfiles proteicos de HES de las semanas sucesivas de Cultura perfil de SDS-PAGE de las proteínas de HES recogidos en sucesivas semanas de cultivo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; Cantidad final de HES de 500 ml ES que contiene el medio de rendimiento de proteína HES de 11 lotes diferentes derivados de aproximadamente 500 ml de sobrenadante de cultivo. Media ± SEM muestra. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figura 5: LPS contaminación de niveles de HES de contaminación LPS en 41 lotes de HES medidos por el ensayo de Limulus ameobocyte. LPS concentración mediana = 86 U por mg de HES. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figura 6: Animación esquemática de H. polygyrus Ciclo de Vida Resumen de las etapas clave del ciclo de vida de una sonda nasogástrica de larvas L3, a través de la recuperación de larvas y gusanos adultos al aislamiento de HES. Figura 7: Animación esquemática de SUH y sus Funciones efectos inmunomoduladores clave de mediadores solubles y exosomas contenidas dentro de HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotipo (y la tensión de fondo) </td><td> Fenotipo La infección primaria </td><td> Referencia </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Puras cepas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Altamente susceptible </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 y ratones C57BL / 10 </td><td> Susceptible </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermedio </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Inmune </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénicos para citocinas o receptores de citocinas </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Más susceptibles </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Menos susceptible (a); ningún cambio en la susceptibilidad, pero el aumento de granulomas (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ transgénicos (C57BL / 6) </td><td> Resistente </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Fecundidad Superior </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 o ratones BALB / c) </td><td> Altamente susceptible </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c o C57BL / 6) </td><td> Altamente Resistente </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgénico(FVB) </td><td> Resistente </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Deficiente Th2, disminución de gormation granuloma </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Más susceptibles </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> No hay cambios en la susceptibilidad </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Alta Th1, Aumento de la susceptibilidad </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénicos para marcadores de células T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Marginalmente superior fecundidad </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Fecundidad Superior </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Fecundidad y Superior# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénicos para loci inmune innata </td><td></td></tr><tr><td> Interferón de tipo 1 receptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Fecundidad más alta, más granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Más resistentes, más granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Más susceptibles </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Las infecciones primarias con H. polygyrus en genéticamente diferentes y de genes targetted cepas de ratón.

Heligmosomoides polygyrus es un nematodo murino con potentes capacidades inmunomoduladoras que se asemejan mucho a los de la infección por helmintos humano altamente prevalente. Aquí se describe un protocolo para el mantenimiento a largo plazo de la H. ciclo de vida polygyrus.

El cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un inmunomodulador nematodo parásito y sus productos secretados

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

El objetivo general de este procedimiento es recolectar y analizar las moléculas secretadas por parásitos helmintos de larga vida que desregulan las respuestas inmunitarias del huésped, permitiendo así la supervivencia de los parásitos. Esto se logra primero cultivando los parásitos en su hábitat natural, el tracto intestinal de ratones. El segundo paso consiste en aislar los parásitos maduros de los ratones tras la eutanasia.A continuación, los parásitos Helmuth se cultivan en cultivo de tejidos, en medio eruptivo durante tres semanas, período durante el cual liberan grandes cantidades de moléculas excretoras, secretoras o de tipo ES. El paso final consiste en recuperar y concentrar las moléculas liberadas a partir de los sobrenadantes del cultivo, obteniendo lotes de ES para pruebas biológicas y bioquímicas. En última instancia, los sobrenadantes concentrados pueden probarse directamente sobre tipos celulares específicos in vitro para estudiar cambios en la función de las células inmunitarias, o administrarse a ratones para evaluar su capacidad de suprimir alergias y otros trastornos.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos que la supresión inmunitaria estaba relacionada con la infección por parásitos vivos, lo que indica una liberación activa y continua de moléculas inmunosupresoras por parte de parásitos vivos. Aunque este método puede proporcionar información sobre las infecciones parasitarias, las moléculas que descubrimos que suprimen la inmunidad probablemente sean muy eficaces para tratar enfermedades clave del mundo occidental, como alergias, autoinmunidad y enfermedad inflamatoria intestinal. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para recuperar y procesar parásitos helmintos son bastante especializados y requieren una atención particular a la técnica de cultivo aséptico.Se infectarán ratones F1 de ocho semanas de edad con larvas de H polyus mediante gavaje oral para la producción del ciclo vital de H polyus. Prepare larvas L3 de H polyus a 2000 por mililitro de agua destilada según se describe en el protocolo adjunto. Ajuste para administrar 400 larvas L3 por ratón en 200 microlitros antes de cada infección.Agregue la suspensión de larvas invirtiendo cinco veces usando una jeringa de un mililitro con una aguja de gavaje dedicada con extremo redondeado; aspire 200 microlitros de la suspensión de larvas. Para realizar el gavaje oral, sujete al ratón en posición vertical por la piel del cuello y pase suavemente la aguja de gavaje roma a través de la boca y el esófago hasta el estómago. Se recuperarán gusanos adultos y huevos del parásito del ratón.14 días después de la infección, 14 días después de la infección. Se recolectan gusanos adultos de h polyus de los ratones utilizando un aparato bayamon modificado preparado como se muestra aquí. Para comenzar este procedimiento, lave el abdomen del animal eutanasiado con etanol al 70 %.Corte la piel sobre el abdomen y retire hacia atrás para exponer la pared abdominal anterior. Realice una incisión en la línea media para acceder a la cavidad peritoneal. Retire todo el intestino delgado y el intestino grueso, desde el duodeno proximal hasta el recto distal.Colóquelo en una placa de Petri seca. Enderece el intestino a lo largo de toda su longitud, extirpe el colon que contiene las heces y coloque este último en un recipiente aparte para recuperar los huevos posteriormente. A continuación, identifique los 20 centímetros proximales del intestino delgado que contienen los gusanos adultos.Se caracteriza por la pared relativamente gruesa del duodeno y a menudo tiene un aspecto rojizo debido a los gusanos intraluminales. Extirpe esta porción del intestino delgado y colóquela en una placa de Petri con cinco mililitros de solución de Hank. Caliente a 37 grados Celsius utilizando tijeras de puntas redondeadas.Abrir longitudinalmente la porción proximal del intestino llena de gusanos y raspar el interior del revestimiento intestinal con dos portaobjetos de vidrio. Para eliminar los gusanos, desechar la pared intestinal limpia. Preparar el embudo con solución de Hank's.Selle una pequeña bolsa de muselina y vierta los gusanos de dos placas de Petri dentro de ella. Coloque dos bolsas de muselina en cada embudo de vidrio y sujete las bolsas con clips de papel alrededor del borde del embudo. Coloque el aparato en un incubador a 37 grados Celsius durante una a dos horas.A mitad del periodo de incubación, agite suavemente el aparato para desprender los restos del preparado intestinal que podrían obstruir el filtro de gasa. Tenga cuidado de evitar el derrame de residuos fuera de la bolsa de gasa, ya que esto causaría contaminación en el preparado final de HES. Al final de la incubación, retire cuidadosamente el tubo de recolección de la manguera de goma sobre un fregadero utilizando una pipeta de plástico, transfiera los gusanos a un tubo de 50 mililitros y permita que los gusanos sedimenten por gravedad.Retire el medio con una pipeta Pasteur. Añada 40 mililitros de solución de Hank y deje asentar a los gusanos. Repita cinco veces para un total de seis lavados. Evitar la contaminación de la cultura turbia es fundamental para el éxito de este protocolo.El cultivo de gusanos debe mantenerse estéril a partir de este momento. Trasládese a una cabina de flujo laminar y lave el cultivo de gusanos otras seis veces con solución estéril de Hank, suplementada con antibióticos, utilizando una pipeta, y recoja dos muestras de 20 microlitros para contar los gusanos adultos recuperados. Se espera que aproximadamente el 50 % de la cantidad de larvas inoculadas recoja huevos al día 14 de infección para raspar las heces del colon previamente extirpado con pinzas.A continuación, mezcle las heces con carbón activado granulado en una proporción de al menos uno a uno. Para lograr una consistencia apenas suficiente como para adherirse y llenar un papel. Extienda una capa delgada en el centro de un trozo de papel filtro humedecido dentro de una placa de Petri y coloque esto en una caja húmeda opaca a la luz para mantenerlo en la oscuridad durante 12 a 14 días.A partir del día siete, comience a recolectar larvas L3. Forme un anillo alrededor del borde del papel filtro. Levante el papel filtro del plato de Petri y use una pipeta para agregar cinco mililitros de agua estéril por placa y enjuagar las larvas que quedan en la placa.Transfiera las larvas a un tubo de 50 mililitros. Devuelva el papel de filtro al recipiente y repita la recogida de larvas semanalmente durante hasta un mes, manteniendo el recipiente en la oscuridad. Luego, las larvas recolectadas se lavan según se describe en el texto del protocolo y se almacenan a cuatro grados Celsius en agua destilada.Para comenzar este procedimiento, sumerja los gusanos en aproximadamente 10 mililitros de solución de Hank, suplementada con 10% de gentamicina durante 20 minutos, dejando el tubo en posición inclinada para asegurar que los gusanos queden completamente cubiertos tras 20 minutos. Lave los gusanos seis veces con solución de Hank, suplementada con antibióticos, e inocule los gusanos en matraces T 25 ventilados. Coloque los matraces en posición vertical en un incubador a 37 grados Celsius durante tres semanas, como preparación de productos excretores-secretorios o HES a partir de los gusanos.Cultivo que contiene HES. El medio se recoge de los cultivos a intervalos de no más de dos veces por semana, reemplazándose cada vez con un volumen igual de medio h polyus. Mantenga cada recolección separada y claramente etiquetada con la fecha y el número de lote debido al mayor riesgo de contaminación con LPS y proteínas del huésped.La primera recopilación tras 24 horas de cultivo debe separarse y procesarse por separado o desecharse. Centrifugar el HES que contiene el medio a 400 × g durante cinco minutos. Luego, aspirar el medio con una jeringa de 50 mililitros y pasar a través de un filtro de baja unión a proteínas de 0,2 micrones hacia tubos de 50 mililitros. Posteriormente, el sobrenadante de HES reunido se concentra mediante un filtro con corte de peso molecular de 3000 en un dispositivo de ultrafiltración bajo presión de nitrógeno. Para preparar primero el dispositivo de filtración, lavar la membrana de tres kilodaltons con el lado brillante hacia abajo en un vaso de precipitados de un litro con agua destilada mientras se agita.Arme el dispositivo de ultrafiltración según las instrucciones del fabricante, colocando la membrana de filtro con el lado brillante hacia arriba, introdúzcalo en un gabinete a cuatro grados Celsius y haga pasar 50 mililitros de agua destilada antes de comenzar a concentrar el HES vertido. Tenga mucho cuidado de no dejar que el filtro se seque. Añada cada tubo de HES al dispositivo de filtración según sea necesario, hasta que el volumen se concentre entre dos y cinco mililitros, con el fin de eliminar los aminoácidos y otros componentes del medio de cultivo tisular.De la preparación de HES, añada 50 mililitros de PBS libre de pirogénos al dispositivo de filtración y luego concentre hasta aproximadamente dos mililitros. Repita este paso dos veces. Utilizando un total de 150 mililitros de PBS, transfiera un ES a una jeringa y filtre esterilice con un filtro de 0,2 micrones.Después de medir la concentración de proteína, etiquete la alícuota con el número de lote y la fecha, y congele a menos 80 grados Celsius. Se utiliza la gavaje oral de 400 L a tres larvas para mantener el ciclo vital de H polygyrus en ratones F1. Las cargas de gusanos adultos resultantes se muestran aquí.Se ha demostrado que los lotes de HES tienen una eficacia reproducible en ensayos funcionales y en composición proteica. Además, cuando se analizaron los sobrenadantes de cada semana sucesiva de cultivo, se encontró que los perfiles proteicos eran muy similares durante un total de hasta cuatro semanas. Cuando se mide la concentración de TS mediante el ensayo de Bradford, la proteína total suele ser aproximadamente un miligramo por mililitro.Se muestra el rendimiento de la proteína HES obtenido de 11 lotes diferentes derivados de aproximadamente 500 mililitros de sobrenadante de cultivo. Es fundamental evitar la contaminación durante la recolección de HES, cuando se midieron los niveles de contaminación por LPS en 41 lotes de HES mediante el ensayo limbo AAMI CYTE. Se encontró que la mayoría de los lotes de HES estaban significativamente por debajo del umbral de contaminación recomendado.Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar mantener una técnica estéril cuidadosa al preparar los cultivos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres a cuatro horas si se realiza adecuadamente siguiendo este procedimiento. Otros métodos como proteómica, fraccionamiento de proteínas y análisis de glicanos, lípidos y microARNs pueden realizarse con el fin de comprender completamente el espectro de productos moleculares liberados por estos parásitos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo propagar Poly limus. El cultivo es Polyus y se recolectan los productos DS de los gusanos adultos cultivados para evaluar sus efectos sobre el sistema inmunológico. Aunque este parásito no es patógeno para los humanos, es importante seguir las precauciones de seguridad y adherirse al protocolo especificado para garantizar la reproducibilidad entre lotes de Hess.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Trichuris muris infección intestinal es un modelo de la inmunidad Th2 en ratones resistentes al generar una respuesta Th2 protección y ratones susceptibles de generar una respuesta Th1 patológicos.

Trichuris muris infección: un modelo de tipo 2 inmunidad y la inflamación en el intestino

El objetivo de esta presentación es demostrar en vivo y en técnicas in vitro para la crianza de los nematodos entomopatógenos. Métodos in vivo consideran la crianza de estos nematodos con un insecto huésped, mientras que los métodos in vitro utilizan rich media agar.

In vivo e in vitro Crianza de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae)

Los nematodos de Caenorhabditis silvestre están asociados con muchos microbios, a menudo en la luz intestinal o infectando el intestino. Este protocolo detalla un método para enriquecer microbios inculturables que colonizan el intestino, aprovechando la resistencia de la cutícula dauer.

Limpieza selectiva de nematodos silvestres de Caenorhabditis para enriquecer las bacterias del microbioma intestinal

La infección de Caenorhabditis elegans por el parásito microsporidio Nematocida parisii permite a los gusanos producir descendencia que es altamente resistente al mismo patógeno. Este es un ejemplo de inmunidad hereditaria, un fenómeno epigenético poco conocido. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de gusano genéticamente tratable.

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Los nematodos entomopatógenos viven en simbiosis con las bacterias y juntos infectan con éxito a los insectos al socavar su sistema inmunológico innato. Para promover la investigación sobre la base genética de la infección por nematodos, se describen métodos para mantener y manipular genéticamente los nematodos entomopatógenos.

Cultivo y manipulación genética de nematodos entomopatógenos

Las células T e ILC2 que expresan IL-9 se inducen durante la infección por N. brasiliensis , sin embargo, su caracterización se ha pasado por alto en gran medida en el intestino infectado debido a su baja frecuencia y cinética diferencial. Este protocolo describe el aislamiento de estas células de diferentes órganos diana y la confirmación de su identidad mediante citometría de flujo en diferentes etapas de infección.

Una estrategia para el estudio de células linfoides productoras de IL-9 en el modelo de infección por Nippostrongylus brasiliensis

Caenorhabditis elegans es una de las principales especies modelo en biología, sin embargo, casi todas las investigaciones se realizan en ausencia de sus microbios naturalmente asociados. Los métodos descritos aquí ayudarán a mejorar nuestra comprensión de la diversidad de microbios asociados como base para futuras investigaciones funcionales de C. elegans.

Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans

Strongyloides ratti es un nematodo parásito que causa infecciones transitorias en ratones de laboratorio, mostrando etapas de migración de tejidos y vida intestinal. Aquí, presentamos un protocolo para el mantenimiento del ciclo del parásito en ratas y la infección experimental de ratones, incluyendo la cuantificación del parásito en la cabeza, el pulmón y el intestino.

Infección experimental de ratones con el nematodo parásito Strongyloides ratti

Aquí, describimos las condiciones de cultivo in vitro , el aislamiento y el aumento de la generación de vesículas extracelulares (EV) de Echinococcus granulosus. Los pequeños vehículos eléctricos se caracterizaron mediante dispersión dinámica de la luz y microscopía electrónica de transmisión. La captación por las células dendríticas derivadas de la médula ósea y su modulación fenotípica se estudiaron mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

Aislamiento y absorción de células dendríticas de pequeñas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Presentamos dos métodos para que los agricultores propaguen en masa nematodos entomopatógenos como bioinsecticidas. El primer método utiliza gel de poliacrilamida como sustrato de cultivo del nematodo, mientras que el segundo emplea algodón recubierto de polímero como sustrato de cultivo. Ambos métodos dependen de la propagación in vivo de nematodos dentro de cadáveres de insectos.

Propagación in vivo basada en cultivadores de nematodos entomopatógenos

Aprende a cultivar el nematodo Heligmosomoides polygyrus en ratones y aisl sus moléculas secretadas con propiedades inmunomoduladoras. Este protocolo permite estudiar mecanismos de supresión inmune y explorar aplicaciones terapéuticas en alergias y enfermedades autoinmunes.

El cultivo de

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