Name: Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a cuantificar cambios rápidos en la adhesión celular de células endoteliales usando impedancia celula-sustrato e imágenes de células vivas. Este método permite analizar dinámicamente la de-adhesión inducida por modificaciones de matriz.

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Este trabajo fue financiado por un 568721 de Subvenciones de Proyecto (SRT) del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (NHMRC) y, en parte, por una Beca de Investigación (MDR) de la Facultad de Medicina de la UNSW.

1. Generalidades de células endoteliales Cultura <ol><li> Células endoteliales aórticas bovinas Cultura (pasajes 4-9) en matraces de cultivo de tejido recubiertos de gelatina (capa de superficie de cultivo de tejidos con 0,1% w / v de gelatina en PBS a temperatura ambiente durante 15 min) en EGM-2 medios de comunicación (con la bala EGM-2 kit que contiene suero bovino fetal al 5%, factores de crecimiento y todos los suplementos proporcionadas por el fabricante, a excepción de hidrocortisona). </li><li> Cuando las células son casi confluente (ca. 3 días después de la siembra después de un 1: split 4), las células de la cosecha mediante el tratamiento con 0,05% w / v de tripsina / 0,02% w / v EDTA en PBS a 37 ° C. Después de la mayoría de las células se han desprendido, añadir completas EGM-2 medios para inactivar la tripsina y después de centrifugación (100 xg, 5 min). </li><li> Preparar las células para estudios sobre la adherencia de novo de las células endoteliales a la fibronectina (Experimento 1: Sección 2) y la posterior de-adhesión de las células endoteliales con la adhesión establecido en este sustrato (Experimento 2: Sección 3). <ol><li> Lave cosechadocélulas una vez con medio libre de suero que contiene 199 1% w / v de albúmina de suero bovino (BSA) y volver a centrifugar (100 xg, 5 min). </li><li> Vuelva a suspender las células en medio libre de suero 199 conteniendo 1% w / v de BSA en 2,5 x 10 5 células / ml (mediciones de impedancia célula-sustrato) o 5 x 10 5 células / ml (análisis de imágenes de células vivas) y mantener a 37 ° C antes de su uso. NOTA: Las respuestas adhesión de las células son muy sensibles a las diferencias de temperatura (por ejemplo, debido a efectos de convección) para todos los equipos y soluciones utilizados para manejar y tratar las células durante los siguientes protocolos deben mantenerse a una temperatura constante de 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Experimento 1: Cuantificación De Novo adhesión endoteliales celular en nativo y oxidado-MPO fibronectina (Impedancia de la célula-sustrato) NOTA: Experimento 1 examina el grado en el que la oxidación mediada por MPO de la fibronectina perjudica su capacidad para soportar de novo </em&gt; Adhesión de las células endoteliales en suspensión. <ol><li> Fibronectina Escudo en 96 pocillos de células-sustrato arrays de microelectrodos impedancia de oro. Añadir 80 l / pocillo de fibronectina bovina purificada a 5 g / ml en PBS, incubar durante 2 horas a 37 ° C y remover la solución. </li><li> Incubar las superficies recubiertas de fibronectina con MPO para permitir la unión de MPO a la fibronectina unida a la superficie. Añadir 80 l / pocillo de purificado MPO de neutrófilos humanos a 20 nM en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y se incuban durante 0,5 horas a 37 ° C. </li><li> Lave las superficies dos veces con HBSS para eliminar cualquier MPO no unido. </li><li> Añadir H 2 O 2 (0-10 mM concentración final) a los pocillos de la placa de matriz de microelectrodos que contiene 80 l / pocillo HBSS para iniciar MPO catalizada, la oxidación dependiente de fibronectina HOCl y se incuba durante otras 0,5 horas a 37 ° C. </li><li> Para examinar el efecto de los inhibidores o moduladores de reacciones catalizadas-MPO pertinentes (por ejemplo, la enzima alternativa MPOsustratos, inhibidores de la enzima o antioxidantes; ver 9 para más detalles), añadirlos a la HBSS inmediatamente antes de H 2 O 2 adición. </li><li> Después de 0,5 horas, el tratamiento de superficies con metionina para saciar las especies oxidantes residuales de la superficie de éste; es decir, las cloraminas unidos a proteínas reactivas, que pueden ejercer las actividades celulares de confusión. Añadir metionina 10 mM en 80 l HBSS por pocillo e incubar durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Bloquear las superficies con BSA. Añadir 80 l / pocillo de BSA al 0,2% w / v en PBS, incubar durante 2 horas a 37 ° C y remover la solución. NOTA: regiones de la superficie sin recubrimiento residual apoyar la adhesión celular y el bloqueo de estos con una proteína no adhesivo (es decir, BSA) asegura que las respuestas de adhesión celular dependen estrictamente de la célula-matriz adhesiva purificado empleado, en este caso fibronectina. </li><li> Lave las superficies dos veces con HBSS. NOTA: Ninguno de los tratamientos de superficie precedentes afecta apreciablemente readin célula-sustratogs. </li><li> Semilla células endoteliales en suspensión (añadir 200 l / pocillo a aproximadamente 2,5 x 10 5 células / ml, preparado en medio libre de suero 199 que contiene 1% de BSA; ver 1.3) sobre las superficies de fibronectina recubierto nativos u oxidadas-MPO. </li><li> Inmediatamente después de la siembra de células (es decir, antes de cualquier fijación de las células y la difusión), montar la placa matriz de microelectrodos en el puerto de incubadora (alojado en una incubadora a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2). <ol><li> Usando el software del instrumento tomar inmediatamente una &quot;en blanco&quot; para normalizar la lectura de impedancia de la célula-sustrato posterior (&quot;índice de teléfono &#39;) valores a los valores de fondo iniciales obtenidos en ausencia de adhesión celular. </li><li> Iniciar adquisición de datos de índice de células continuas (mínimo de una celda índice de lectura / min). </li></ol></li><li> Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2 horas, un período de tiempo durante el cual la unión de células máxima y la difusión que se consigue; esto se refleja porun estancamiento de los valores del índice de células (ver Figura 3A). NOTA: El experimento anterior (Experimento 1) examina cómo oxidación inicial mediada por MPO de la fibronectina limita la capacidad de las células endoteliales para establecer la adhesión celular en este sustrato. El siguiente experimento (Experimento 2) examina la forma en la oxidación mediada por la fibronectina MPO promueve disminuciones en la adhesión célula-matriz (es decir, de-adhesión) en las células endoteliales con la adhesión establecido en este sustrato. Los tratamientos en estos dos experimentos son esencialmente idénticos, salvo en el momento de la oxidación mediada por MPO fibronectina (es decir, antes de la adhesión celular - Experimento 1; después de la adhesión celular - Experimento 2). </li></ol> 3. Experimento 2: Cuantificación de células endoteliales De-adhesión de fibronectina en respuesta a mediada MPO fibronectina Oxidación (Impedancia de la célula-sustrato y imágenes de células vivas) <ol><li> Fibronectina Escudo en 96 pozos de microelectrodos de oro unrrays para mediciones de impedancia célula-sustrato (añadir 80 l / pocillo de fibronectina a 5 g / ml en PBS y se incuba durante 2 horas a 37 ° C) o 35 mm placas de cultivo celular con fondo de cristal para análisis de imágenes de células vivas (añadir 2 ml / plato de la fibronectina a 5 g / ml en PBS y se incuba durante 2 horas a 37 ° C). </li><li> Bloquear las superficies con BSA. Añadir BSA al 0,2% w / v en PBS a los volúmenes indicados en el punto 3.1 y se incuba durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Incubar las superficies con MPO para permitir la unión de MPO a la fibronectina. Añadir 20 nM purificado MPO humana en HBSS a los volúmenes indicados en el punto 3.1 y se incuba durante 0,5 horas a 37 ° C. </li><li> Lave las superficies dos veces con HBSS para eliminar cualquier MPO no unido. </li><li> Semilla células endoteliales en suspensión (preparados en medio libre de suero que contiene 199 1% w / v BSA; véase 1.3) sobre las superficies recubiertas de fibronectina nativas o portadoras de MPO. <ol><li> Añadir 200 l / pocillo en 2,5 x 10 5 células / ml a 96 así célula-sustrato arrays de microelectrodos impedancia. </li> &lt;li&gt; Añadir 2 ml / placa en 5 x 10 5 células / ml a 35 mm con fondo de cristal placas de cultivo celular. </li></ol></li><li> Inmediatamente después de la siembra de células (es decir, antes de cualquier fijación de las células y la difusión): <ol><li> Monte 96 y placas de matriz de microelectrodos en el puerto incubadora impedancia célula-sustrato (guardadas en una incubadora a 37ºC en presencia de CO2 al 5%) y tomar las lecturas &quot;en blanco&quot; para iniciar la adquisición continua de datos de índice de células (véase la Sección 2.10 ). </li><li> Transferencia de 35 mm con fondo de cristal placas de cultivo celular a una incubadora a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante 2 horas para permitir la fijación máxima de células y la difusión (véase la Sección 2.11). </li><li> Eliminar brevemente los (lecturas de índice de células pausa en este punto) 96 y la placa matriz de microelectrodos o 35 mm con fondo de cristal placa de cultivo de células de la incubadora a 37ºC, quite sobrenadante celular y añadir calentado (37 ° C) HBSS (volúmenes como per paso 3.1). NOTA: HBSS se emplea cuando se estudia MPO catalizada por reacciones oxidativas en lugar de medio de cultivo completo ya que éste contiene especies oxidables que interfieren con las reacciones de oxidación. </li><li> Para examinar el efecto de los inhibidores / moduladores de reacciones catalizadas-MPO (sustratos de enzimas, inhibidores de enzimas alternativos o antioxidantes) o inhibidores de la señalización de células (por ejemplo, blebbistatin 40 mM para inhibir la contractilidad actomiosina), añadir estos ahora. </li><li> Colocar inmediatamente la placa matriz de microelectrodos de nuevo en los (las lecturas de índice celular volverá a empezar en este punto) 37 ° C Puerto incubadora o el vidrio de 35 mm de fondo placa de cultivo celular de nuevo en la incubadora a 37ºC, y permitir que las células se equilibren en el HBSS durante 0,5 h. NOTA: Después de equilibrio de 0,5 horas en HBSS, los valores del índice de células se estabilizan en valores ligeramente inferiores; cuando las células pre-incubación con sustratos de enzimas, enzimas e inhibidores de señalización celular o antioxidantes, asegurarse primero de que tstos no afectan significativamente los valores obtenidos después del equilibrio. </li><li> Iniciar catalizada-MPO, oxidación fibronectina HOCl-dependiente y adherencia DE. <ol><li> Para los estudios de impedancia de células usando 96 y placas de matriz de microelectrodos: <ol><li> Retire la placa matriz de microelectrodos de la incubadora y la pausa mediciones del índice de célula. </li><li> Añadir H 2 O 2 (concentración final de 0-10 mM) a la HBSS y mezclar suavemente con la pipeta repetido. </li><li> Inmediatamente, vuelva a montar la matriz de microelectrodos de nuevo en el puerto C incubadora a 37 ° y volver a iniciar la adquisición de lecturas del índice celular. </li></ol></li><li> Para los estudios de imágenes de células vivas utilizando 35 mm plato con fondo de cristal de cultivo celular: <ol><li> Retire la placa de cultivo de la incubadora y su montaje en una etapa C calentada de un microscopio confocal invertido equipado con una lente de objetivo 63X agua con óptica DIC adecuados para la grabación de películas de células vivas 37 °. </li><li> Centrarse en las células yoptimizar DIC óptica (iluminación Köhler, retraso sesgo y el desplazamiento de la cámara / ganancia; para más detalles, véase 13). </li><li> Iniciar película CID y registrar las lecturas iniciales de las células no tratadas durante 1 min. </li><li> Añadir H 2 O 2 (concentración final de 0-10 mM) y mezclar suavemente con la pipeta repetido. Re-enfocar el microscopio (si es necesario) y continuar la grabación de películas DIC de las células tratadas durante el periodo de tiempo requerido. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Análisis de Datos y Presentación <ol><li> Datos de impedancia de la célula-sustrato <ol><li> Exportar datos en bruto (índice frente al tiempo de células) en una hoja de cálculo. </li><li> Para los estudios de células de-adhesión (Experimento 2: Sección 3), normalizar los datos mediante el establecimiento de valores registrados inmediatamente antes de la iniciación de la oxidación fibronectina mediada MPO en un valor de 1 (es decir, inmediatamente antes de la adición de H 2 O 2 en 3.11 .1.1). NOTA: Esto asegura que relativalos cambios en los valores del índice de células producidas por la oxidación fibronectina mediada MPO no están enmascarados por pequeñas diferencias iniciales en los valores del índice de células absolutas entre pozos. <ol><li> Los datos se presentan como diagramas de índice normalizado de células (eje y) frente al tiempo (eje x). </li></ol></li></ol></li><li> Datos de imágenes de células vivas (estudios de células de-adhesión en el Experimento 2: Sección 3) <ol><li> Abra DIC en vivo de imágenes de células películas grabadas inmediatamente antes y después de la iniciación de la oxidación de fibronectina mediada por MPO en un programa de análisis de imagen estándar (por ejemplo, software ImageJ). </li><li> En al menos dos películas separadas DIC seleccionar aleatoriamente varias celdas y medir su área proyectada en fotogramas secuenciales (por ejemplo, a intervalos de 1 min) trazando manualmente su borde de la membrana y cuantificar el número de píxeles cerrados. </li><li> Exportar datos en bruto (área celular proyectado en función del tiempo) a una hoja de cálculo Excel y normalizar los datos del área de células mediante el establecimiento de los valores registrados inmediatamente antesla iniciación de la oxidación de fibronectina mediada por MPO en un valor de 1 (es decir, inmediatamente antes de la adición de H 2 O 2 en 3.11.2.3). </li><li> Los datos actuales como una parcela de área normalizada de células (eje y) frente al tiempo (eje x). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen revelaciones para hacer.

La adhesión célula-matriz y los procesos de-adhesión pueden cuantificarse con precisión en tiempo real con alta resolución temporal utilizando impedancia de la célula-sustrato y análisis de imágenes de células vivas. Estos enfoques en tiempo real proporcionan una gran ventaja sobre los análisis de punto final de la adhesión celular, que proporcionan una pobre resolución temporal. Al cuantificar con precisión rápidas respuestas de-adhesión con alta resolución temporal, estos análisis pueden proporcionar información decis...

Se requieren contactos adhesivas estable entre las células y su matriz extracelular circundante para el mantenimiento de la homeostasis del tejido. Por ejemplo, la adhesión celular endotelial a la matriz subendotelial en los vasos sanguíneos desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la integridad de la capa endotelial y su función homeostática como una barrera vascular reguladora, semi-permeable 1. El citoesqueleto de actina está acoplado mecánicamente al adhesivo moléculas de la matriz en los sitios de adhesión célula-matriz y los contactos de adhesivo en la interfase célula-matriz desempeñar un papel importante en la determinación de la posición de la membrana celular mediante la resistencia a fuerzas de tracción de actomiosina centralmente dirigidas. Estímulos extracelulares que alteran la adhesión célula-matriz alterar necesariamente el equilibrio de fuerzas en la interfase célula-matriz, un evento que es rápidamente &quot;sintieron&quot; por proteínas de señalización mecano-sensible, lo que resulta en la transducción de &quot;afuera hacia adentro de señalización&quot;. Esta apuesta cruzada hablarween células y su matriz extracelular circundante juegan un papel clave en el control de la forma celular, la motilidad, la función, la proliferación y la supervivencia 2. Procesos fisiopatológicos diversos (desarrollo embrionario, la inflamación, la reparación de heridas y la metástasis del cáncer) se caracterizan por la remodelación dinámica de sustratos de matriz adhesiva por oxidantes y / o enzimas que degradan la matriz 3,4. Por ejemplo, adhesivo de proteínas de la matriz subendotelial en los vasos sanguíneos (por ejemplo, fibronectina) están implicados como los principales objetivos para la modificación o degradación en las enfermedades inflamatorias humanos debido a la producción localizada de oxidantes reactivos (por ejemplo, ácido hipocloroso, HOCl) por la enzima derivadas de leucocitos mieloperoxidasa (MPO), que se acumula dentro de la subendotelio vascular durante la enfermedad inflamatoria (Figura 1) 5-9. Los cambios en la adhesión célula-matriz inducidos por oxidantes derivados de MPO y otros estímulos de matriz modificadores son likEly jugar un papel importante en la alteración de la homeostasis vascular durante una variedad de procesos patológicos, por ejemplo, mediante la alteración de la señalización celular endotelial, morfología y viabilidad, que a su vez perturba la función endotelial y la integridad de la barrera. Sin embargo, las respuestas de señalización morfológicos y celulares de las células adherentes a las modificaciones de la matriz extracelular sólo están empezando a ser entendido. Para entender cómo las modificaciones de la matriz coche cambios en la dinámica de adhesión celular y vías de señalización celular de adhesión dependiente, se requieren técnicas que cuantificar con precisión los cambios en la adhesión célula-matriz en tiempo real, con alta resolución temporal. A continuación, describimos impedancia de la célula-sustrato complementaria y técnicas de imágenes de células vivas que cumplen estos criterios y proporcionar una plataforma para cuantificar la adhesión celular y los procesos de-adhesión de una manera no invasiva. Mostramos cómo éstos impedancia célula-sustrato y en directo apro imágenes de célulasdolores se pueden emplear fácilmente para (i) controlar la dinámica de la unión celular y la propagación (es decir, de novo de adhesión celular) sobre sustratos de matriz nativos y modificados y (ii) para medir la dinámica de desprendimiento de las células de la matriz (es decir, de-adhesión ) por las células adherentes expuestos a estímulos matriz modificadores. El sistema xCELLigence célula-sustrato impedancia de biosensor proporciona una medición continua de la zona de contacto célula-matriz mediante la cuantificación de impedancia eléctrica en la superficie de 96 pocillos arrays de microelectrodos de oro y expresa estas mediciones de impedancia eléctrica como &quot;índice de célula, un valor adimensional que es en gran parte proporcional al área de contacto célula-sustrato 10 (Figura 2), mientras que también es sensible a los cambios en la distancia media entre la (aislante) membrana celular y la superficie del electrodo 11. También se consigue un aumento adicional de los valores del índice de células en la formación de apretado contactos célula-célula del that restringir los flujos actuales paracelulares, 11 condiciones que no prevalecen dentro de los experimentos descritos en este estudio. Medición del área proyectada de las células individuales en el tiempo por análisis de imágenes de contraste de interferencia diferencial de lapso de tiempo (DIC) películas proporciona una medida complementaria de los cambios en el área de contacto célula-sustrato y proporciona información adicional con respecto a la naturaleza exacta y la dinámica de la cambios morfológicos cuantificados por el enfoque de impedancia de la célula-sustrato. Específicamente, se describe la aplicación de estos enfoques para supervisar cómo oxidación de proteínas de la matriz subendotelial adhesivas (por ejemplo, fibronectina) (i) mediada por MPO reduce la adhesión de novo de las células endoteliales en suspensión en fibronectina purificada y (ii) desencadena célula-matriz de -adhesion en las células endoteliales con la adhesión establecido en la fibronectina. Mediante la realización de la señalización celular paralelo analiza en el tiempo utilizando biochem relevanteensayos de cos (por ejemplo, transferencia de Western), las relaciones temporales y causales entre los procesos de adhesión / DE-adhesión y los cambios asociados en los eventos de señalización celular de adhesión dependiente se puede determinar. Estos enfoques han usado recientemente para demostrar que la oxidación de la matriz extracelular catalizada por depósitos subendoteliales de MPO activa una rápida pérdida en la adhesión célula-matriz de las células endoteliales que es impulsado por las fuerzas de pre-existentes contráctiles actomyosin 9. Es importante destacar que, al permitir que la relación temporal entre cambios tanto en la adhesión celular y la adhesión celular dependiente de señalización que se determine, estos enfoques identificados que modificación de la matriz inducida por MPO y celular de-adhesión desencadena cambios en importantes vías de señalización celular de adhesión dependiente incluyendo Src quinasa fosforilación paxilina -dependiente y cadena ligera de miosina II fosforilación (Figura 1) 9. Este modo de señalización redox dependientes, involving la activación de los eventos de señalización intracelular por reacciones oxidativas extracelulares que romper la adhesión célula-matriz, representa un nuevo modo de señalización celular denomina &quot;fuera-en la señalización redox&quot; (Figura 1) 9. En general, estos complementaria biosensor impedancia de la célula-sustrato y enfoques imágenes de células vivas deben ser valiosa para revelar cómo los diferentes estímulos o agentes modificadores de la matriz coche cambios en la dinámica de adhesión celular, la morfología y la señalización dentro de diferentes tipos de células adherentes sujetos a una amplia variedad de parámetros experimentales. El siguiente protocolo describe cómo cuantificar el impacto de la oxidación matriz mediada por MPO de novo adhesión de células endoteliales (Experimento 1) y la célula procesos de adhesión endotelial (2 Experimento). MPO se une ávidamente a la fibronectina y otras proteínas de la matriz extracelular subendotelial adhesivas y nosotroses peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para convertir los iones de cloruro (Cl -) para el oxidante de cloración ácido hipocloroso altamente reactivo (HOCl), que reacciona localmente con estas proteínas de la matriz y altera sus propiedades adhesivas celular (Figura 1) 8,9, 12.

<table><tbody><tr><td>Matriz de microelectrodos de impedancia de sustrato-celda de oro de 96 pocillos</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td>E-Plate 96</td><td>placa de un solo uso utilizada para realizar ensayos basados en células en el sistema xCELLigence</td></tr><tr><td>blebbistatina</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td>inhibidor selectivo de</td></tr><tr><td>células endoteliales aórticas bovinas con miosina II no muscular, criopreservadas&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW-6001</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162 Kit de</td><td>medios de crecimiento de células endoteliales</td></tr><tr><td>Fibronectina, polvo liofilizado</td><td>Sigma</td><td>F-4759</td><td>de plasma bovino</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular con fondo de vidrio fluorado de 35 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Plato de curura celular con fondo de vidrio de calidad óptica para imágenes Gelatina</td></tr><tr><td>de piel bovina Sustrato de</td><td>cultivo celular</td><td>Sigma</td><td>G9391</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank</td><td></td> Peróxido de hidrógeno de <td>Life Technologies</td> 14025076 <td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno Merck</td><td></td><td>107298</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>Medios celulares sin suero</td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Sigma</td><td>M9500</td><td>apaga los oxidantes clurantes generados por la mieloperoxidasa</td></tr><tr><td>Mieloperoxidasa, leucocitos polimorfonucleares humanos</td><td>Millipore</td><td>475911</td> Instrumento RTCA MP / xCELListema <td></td></tr> de <tr><td>impedancia de sustrato celular</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td></td><td>consta de analizador RTCA, estación MP RTCA (placa múltiple) y unidad de control RTCA</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando impedancia cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y de-adhesión inducidas por matrix modificación

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

La adhesión célula-matriz desempeña un papel clave en el control de la morfología celular y la señalización. Los estímulos que interrumpen la adhesión célula-matriz (por ejemplo, mieloperoxidasa y otros oxidantes matriz modificar / enzimas liberadas durante la inflamación) están implicados en el desencadenamiento de cambios patológicos en la función celular, el fenotipo y la viabilidad en un número de enfermedades. Aquí se describe cómo impedancia de la célula-sustrato y enfoques imágenes de células vivas se pueden emplear fácilmente para cuantificar con precisión los cambios en tiempo real en la adhesión celular y de-la adhesión inducida por la modificación de la matriz (utilizando células endoteliales y la mieloperoxidasa como un estímulo matriz de modificadores de fisiopatológico) con alta resolución temporal y de una manera no invasiva. El sistema de impedancia de la célula-sustrato xCELLigence cuantifica de forma continua el área de la adhesión célula-matriz mediante la medición de la impedancia eléctrica en la interfase célula-sustrato en las células cultivadas sobre matrices de microelectrodos de oro. Análisis de imágenes de time-lapse diferencial películas de contraste de interferencia cuantifica los cambios en el área proyectada de las células individuales en el tiempo, que representa los cambios en el área de contacto célula-matriz. Ambas técnicas cuantificar con precisión los cambios rápidos en los procesos de adhesión celular y de-adhesión. Impedancia de la célula-sustrato sobre biochips microelectrodos proporciona una plataforma para mediciones robusto, de alto rendimiento. Imágenes de células vivas analiza proporcionar detalles adicionales con respecto a la naturaleza y la dinámica de los cambios morfológicos cuantificados mediante mediciones de impedancia célula-sustrato. Estos enfoques complementarios proporcionan valiosos nuevos conocimientos sobre cómo la modificación oxidativa catalizada por mieloperoxidasa de los componentes de la matriz extracelular subcelulares provoca cambios rápidos en la adhesión celular, la morfología y señalización en las células endoteliales. Estos enfoques son también aplicables para el estudio de la dinámica de adhesión celular en respuesta a otros estímulos matriz modificar y en células adherentes relacionados (por ejemplo, células epiteliales).

La cuantificación en tiempo real de células endoteliales de adhesión de fibronectina en respuesta a la oxidación mediada por la fibronectina MPO (Experimento 2). La siembra de las suspensiones de células endoteliales en nativo (MPO libre) de fibronectina o MPO-cojinete resultados de fibronectina en la unión celular máxima y la difusión dentro de 2 h, según se juzga por un estancamiento de valores de índice celular en las mediciones de impedancia sustrato de células (Figura 3A). Esta fas...

A continuación, presentamos un protocolo para cuantificar de forma continua adhesión celular y de-adhesión procesos con alta resolución temporal de una manera no invasiva por impedancia célula-sustrato y análisis de imágenes de células vivas. Estos enfoques revelan la dinámica de los procesos de adhesión celular / DE-adhesión desencadenados por modificación de la matriz y su relación temporal de los eventos de señalización de adhesión dependiente.

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en cuantificar cambios rápidos en la adhesión célula-matriz en células endoteliales expuestas a agentes modificadores de la matriz en tiempo real, utilizando impedancia célula-sustrato e imágenes de células vivas. En este experimento, se emplea la enzima hémica mieloperoxidasa como agente modificador de la matriz con relevancia fisiopatológica. Esto se logra primero recubriendo las superficies con fibronectina para proporcionar un sustrato matricial adhesivo.Se permite entonces que la mieloperoxidasa o MPO se una a la fibronectina. A continuación, se siembran células endoteliales en suspensión sobre las superficies y se incuban para lograr la máxima adhesión y expansión celular sobre la fibronectina. Luego, las células se exponen a peróxido de hidrógeno con el fin de iniciar la oxidación de la fibronectina mediada por MPO.Los cambios rápidos subsiguientes en la adhesión celular a la matriz se cuantifican entonces en tiempo real mediante análisis de impedancia célula-sustrato y de imágenes de células vivas. Los resultados muestran que las pérdidas rápidas en la adhesión de células endoteliales a la matriz, desencadenadas por la oxidación de fibronectina mediada por NPO, pueden cuantificarse en tiempo real con alta resolución temporal y de manera libre de marcadores mediante la impedancia célula-sustrato y el análisis de imágenes de células vivas. La ventaja de estas técnicas es que pueden cuantificar continuamente los cambios en la adhesión celular a la matriz con alta resolución temporal, lo que significa que pueden proporcionar nuevas perspectivas importantes sobre cómo las modificaciones de la matriz inducen cambios descendentes en la morfología celular y en los procesos de señalización dependientes de la adhesión.Los protocolos tienen una importancia más amplia en el sentido de que pueden adaptarse fácilmente sustituyendo la MPO por otros agentes modificadores de la matriz, como la matriz para compuertas, proteasas, o utilizando tipos celulares adherentes distintos de las células endoteliales, como las células epiteliales. Para comenzar, añada 80 microlitros por pocillo de fibronectina para recubrir matrices microelectroquímicas de oro de 96 pocillos para mediciones de impedancia celular en sustratos, o añada dos mililitros de fibronectina a placas de cultivo celular con fondo de vidrio para análisis de imágenes de células vivas. Incube las matrices y/o las placas de cultivo a 37 grados Celsius durante dos horas.Luego, para bloquear las superficies, agregue BSA al 0,2 % e incube a 37 grados Celsius durante dos horas adicionales. A continuación, agregue mieloperoxidasa humana purificada en HBSS e incube durante 30 minutos. Luego, use HBSS para lavar las superficies dos veces y eliminar cualquier MPO no unida.A continuación, siembre 250.000 células por mililitro de células endoteliales en suspensión preparadas según el protocolo descrito en el texto, sobre matrices microelectrodo de impedancia para sustrato celular de 96 pocillos con superficies recubiertas de fibronectina nativa o que presente MPO. Para los platos de cultivo celular de 35 milímetros con fondo de vidrio, agregue dos mililitros de una suspensión con 500.000 células por mililitro. Inmediatamente después de sembrar las células, coloque las placas con matrices microelectrodo sobre el puerto del incubador de impedancia para sustrato celular a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.Y tome lecturas en blanco para iniciar la adquisición continua de datos de índice celular. Transfiera las placas de cultivo celular de 35 milímetros con fondo de vidrio a un incubador con 5% de dióxido de carbono a 35 grados Celsius. Incube durante dos horas para permitir la máxima adhesión y expansión celular.Después de la incubación, detenga temporalmente las lecturas del índice celular y retire brevemente la placa de matriz de microelectrodos o retire el recipiente con fondo de vidrio del incubador, aspire el sobrenadante y agregue HBSS tibio para examinar los efectos de inhibidores, moduladores de MPO, reacciones catalizadas o inhibidores de la señalización celular. Añádalos a los cultivos. En este momento, coloque inmediatamente la placa de matriz de nuevo en el puerto del incubador o el recipiente con fondo de vidrio en el incubador, y permita que las células se equilibren durante 30 minutos.Para iniciar la oxidación de fibronectina y la desadhesión celular dependiente de ácido hipocloroso catalizada por NPO para estudios de impedancia celular, retire la placa de matriz de microelectrodos del incubador y detenga las mediciones del índice celular. Añada peróxido de hidrógeno al HBSS y mezcle suavemente mediante pipeteo repetido; inmediatamente, vuelva a colocar la matriz de microelectrodos en el puerto del incubador y reinicie las lecturas del índice celular para estudios de imágenes en células vivas utilizando placas de vidrio de 35 milímetros de fondo. Tras retirar la placa del incubador, colóquela sobre una platina calentada a 37 grados Celsius de un microscopio confocal invertido, equipado con un objetivo acuático de 63 x.Y óptica DIC Para grabar películas de células vivas, enfoque las células y optimice la óptica DIC según las pautas referenciadas aquí. Inicie la película DIC y registre lecturas basales de células no tratadas durante un minuto; luego agregue peróxido de hidrógeno y mezcle suavemente mediante pipeteo repetido, vuelva a enfocar el microscopio y continúe grabando películas DIC de las células tratadas durante el período de tiempo requerido. Para analizar los datos de impedancia célula-sustrato, comience exportando los datos a una hoja de cálculo para la adhesión celular.Los estudios normalizan los datos estableciendo en uno los valores registrados inmediatamente antes del inicio de la oxidación de fibronectina mediada por MPO, y presentan los datos como gráficas del índice celular normalizado frente al tiempo para analizar los datos de imágenes de células vivas. Abra películas de imágenes de células vivas en contraste de interferencia diferencial (DIC) grabadas inmediatamente antes y después del inicio de la oxidación de fibronectina mediada por MPO en un programa de análisis de imágenes como ImageJ, utilizando al menos dos películas DIC independientes; seleccione aleatoriamente múltiples células y mida su área proyectada en cuadros secuenciales trazando manualmente el borde de su membrana y cuantificando el número de píxeles encerrados. Finalmente, presente los datos como una gráfica del área celular normalizada frente al tiempo. La adhesión de suspensiones de células endoteliales sobre fibronectina o fibronectina portadora de MPO da como resultado una adhesión y expansión celular máxima dentro de dos horas, según lo indicado por la estabilización de los valores del índice celular en el sustrato celular.Las mediciones de impedancia, una vez establecida la adhesión celular máxima sobre fibronectina nativa o portadora de NPO, muestran que la oxidación dirigida de la fibronectina mediada por el ácido hipocloroso catalizado por NPO y desencadenada por la adición del sustrato coadyuvante de NPO, peróxido de hidrógeno, provoca una disminución rápida del área de contacto entre la célula y la matriz, medida mediante la impedancia célula-sustrato y mediante imágenes de células vivas. Como se muestra aquí, la desadhesión celular rápida evidente en las células endoteliales unidas a fibronectina portadora de NPO en respuesta al tratamiento con peróxido de hidrógeno no se observa en células tratadas únicamente con peróxido de hidrógeno. La inhibición de la función del motor de miosina II con la estatina BLE inhibe la velocidad de desadhesión celular endotelial medida por la impedancia célula-sustrato y mediante imágenes de células vivas, lo que indica que la desadhesión celular y la contracción en respuesta a la oxidación matricial subcelular catalizada por MPO están impulsadas por fuerzas tensiles de acto-miosina. Dado que estos métodos pueden medir con precisión cambios muy rápidos en la adhesión celular, pueden proporcionar información crítica sobre las relaciones causales entre los cambios en la adhesión y los cambios posteriores en los procesos de señalización dependientes de la adhesión, como la fosforilación de SARK o la señalización en las adhesiones focales, que pueden medirse fácilmente en experimentos paralelos a lo largo del tiempo mediante inmunotransferencia (Western blotting).

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Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

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