Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar los cambios rápidos en la adhesión de la matriz celular en células endoteliales expuestas a agentes modificadores de la matriz en tiempo real utilizando impedancia de sustrato celular e imágenes de células vivas. En este experimento, la enzima hemo mieloperoxidasa se emplea como un agente modificador de la matriz fisiopatológicamente relevante. Esto se logra recubriendo primero las superficies con fibronectina para proporcionar un sustrato de matriz adhesiva.

A continuación, se permite que la mioperoxidasa o MPO se una a la fibronectina. A continuación, las células endoteliales suspendidas se asientan en las superficies y se incuban para lograr la máxima adhesión celular y extenderse sobre la fibronectina. Luego, las células se exponen al peróxido de hidrógeno para iniciar la oxidación de fibronectina mediada por NPO.

Los cambios rápidos posteriores en la adhesión de la matriz celular se cuantifican en tiempo real utilizando la impedancia del sustrato celular y el análisis de imágenes de células vivas. Los resultados muestran que las pérdidas rápidas en la adhesión de la matriz celular endotelial desencadenadas por la oxidación de fibronectina mediada por NPO se pueden cuantificar en tiempo real con alta resolución temporal y de manera libre de etiquetas mediante impedancia de sustrato celular e imágenes de células vivas. Bueno, la ventaja de estas técnicas es que pueden cuantificar los cambios en la adhesión de la matriz celular de forma continua con una alta resolución temporal, y esto significa que pueden proporcionar nuevos conocimientos importantes sobre cómo las modificaciones de la matriz impulsan cambios posteriores en la morfología celular y los procesos de señalización dependientes de la adhesión.

Los protocolos son de mayor importancia en el sentido de que pueden adaptarse fácilmente sustituyendo MPO por otros agentes modificadores de la matriz, como la matriz a la compuerta, las proteasas, o mediante el uso de tipos de células adherentes distintas de las células endoteliales, como las células epiteliales. Para comenzar, agregue 80 microlitros por pocillo de fibronectina para recubrir matrices de microelectrodos de oro de 96 pocillos para mediciones de impedancia del sustrato celular, o agregue dos mililitros de fibronectina a placas de cultivo celular con fondo de vidrio para el análisis de imágenes de células vivas. Incubar las matrices y/o las placas de cultivo a 37 grados centígrados durante dos horas.

Luego, para bloquear las superficies, agregue 0.2% BSA e incube a 37 grados Celsius durante dos horas adicionales. A continuación, agregue peroxidasa humana purificada en HBSS e incube durante 30 minutos. A continuación, utilice HBSS para lavar las superficies dos veces y eliminar cualquier MPO suelto.

A continuación, vea 250.000 células por mililitro de células endoteliales suspendidas preparadas según el protocolo de texto En matrices de microelectrodos de impedancia de sustrato de 96 células de pocillos con superficies recubiertas de fibronectina nativas o con MPO. Para las placas de cultivo celular con fondo de vidrio de 35 milímetros, agregue dos mililitros de 500, 000 células por mililitro. Inmediatamente después de la siembra, las celdas montan las placas de la matriz de microelectrodos en el puerto de la incubadora de impedancia del sustrato de la celda a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Y tome lecturas en blanco para iniciar la adquisición continua de datos de índice de celda. Transfiera las placas de cultivo celular con fondo de vidrio de 35 milímetros a una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 35 grados centígrados. Incubar durante dos horas para permitir la máxima adhesión y propagación de las células.

Después de la incubación, detenga las lecturas del índice celular y retire brevemente la placa de la matriz de microelectrodos o retire el plato con fondo de vidrio de la incubadora, aspire el snat y agregue HBSS calentado para examinar los efectos de los inhibidores, moduladores de MPO, reacciones catalizadas o inhibidores de señalización celular. Agréguelos a las referencias culturales. En este punto, vuelva a colocar inmediatamente la placa de matriz en el puerto de la incubadora o la placa con fondo de vidrio en la incubadora y deje que las celdas se equilibren durante 30 minutos.

Para iniciar la oxidación y dehesión de fibronectina dependiente del ácido hipocloroso catalizada por NPO para estudios de impedancia celular, retire la placa de la matriz de microelectrodos de la incubadora y detenga las mediciones del índice celular. Agregue peróxido de hidrógeno al HBSS y mezcle suavemente mediante pipeteo repetido, vuelva a montarlo inmediatamente en la matriz de microelectrodos nuevamente en el puerto de la incubadora y reinicie las lecturas del índice celular para estudios de imágenes de células vivas utilizando placas con fondo de vidrio de 35 milímetros. Después de retirar la placa de la incubadora, montada en una platina calentada a 37 grados centígrados de un microscopio confocal invertido, equipado con una lente de objetivo de agua de 63x.

Y óptica DIC Para grabar películas de células en directo, concéntrese en las células y optimice la óptica DIC de acuerdo con las directrices a las que se hace referencia aquí. Inicie la película DIC y registre las lecturas de referencia de las células no tratadas durante un minuto, luego agregue peróxido de hidrógeno y mezcle suavemente mediante pipeteo repetido, vuelva a enfocar el microscopio y continúe grabando películas DIC de las células tratadas durante el período de tiempo requerido. Para analizar los datos de impedancia del sustrato de la celda, comience exportando los datos a una hoja de cálculo para la adhesión de la celda d.

Los estudios normalizan los datos estableciendo los valores registrados inmediatamente antes del inicio de la oxidación de fibronectina mediada por NPO para presentar los datos como gráficos de índice celular normalizado en comparación con el tiempo para analizar los datos de imágenes de células vivas. Las películas abiertas de imágenes de células vivas DIC grabadas inmediatamente antes y después del inicio de la oxidación de fibronectina mediada por MPO en un programa de análisis de imágenes como la Imagen J en al menos dos películas DIC separadas, seleccionan aleatoriamente varias células y miden su área proyectada en fotogramas secuenciales trazando manualmente el borde de su membrana y cuantificando el número de píxeles encerrados. Finalmente, presente los datos como un gráfico del área celular normalizada en comparación con el tiempo: el asentamiento de las suspensiones de células endoteliales en fibronectina o MPO que contiene fibronectina da como resultado una adhesión y propagación celular máximas dentro de dos horas, a juzgar por un mesetazo de los valores del índice celular en el sustrato celular.

Las mediciones de impedancia, una vez que se establece la adhesión celular máxima en fibronectina nativa o portadora de NPO, la oxidación de fibronectina dirigida mediada por ácido hipocloroso catalizado por NPO e iniciada por la adición de NPO como sustrato El peróxido de hidrógeno provoca una rápida disminución en el área de superficie de contacto de la matriz celular medida por la impedancia del sustrato celular y por imágenes de células vivas como se muestra aquí, la rápida dehesión celular aparente en las células endoteliales unidas a NPO que contienen fibronectina en respuesta al tratamiento con peróxido de hidrógeno está ausente en las células tratadas solo con peróxido de hidrógeno. La inhibición de la función motora de la miosina dos con estatinas BLE inhibe la tasa de desadhesión de las células endoteliales medida por la impedancia del sustrato celular y por imágenes de células vivas que identifican que la deadhesión y contracción celular en respuesta a la oxidación de la matriz subcelular catalizada por MPO es impulsada por las fuerzas de tracción de la miosina de la OTAC. Dado que estos métodos pueden medir con precisión cambios muy rápidos en la adhesión celular, pueden proporcionar información crítica sobre las relaciones causales entre los cambios de adhesión y los cambios posteriores en los procesos de señalización dependientes de la adhesión, como la fosforilación SARK o la señalización de adhesión focal, que se pueden medir fácilmente en experimentos paralelos a lo largo del tiempo utilizando Western blot.