Name: Cuantificación del inmunosupresor tacrolimus en gotas de sangre seca mediante LC-MS/MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprende a cuantificar tacrolimus en gotas de sangre seca mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem. Este método permite el monitoreo terapéutico de drogas de forma mínimamente invasiva.

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Este trabajo fue apoyado por la HHSF223201310224C de contratos de la Administración Federal de Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) y la subvención 1U01FD004573-01 de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos/FDA.

Las muestras de sangre desidentificadas de individuos sanos procedían del Hospital de la Universidad de Colorado (Aurora, Colorado). El uso de muestras de banco de sangre no identificadas para estudios de validación, así como para la preparación de calibradores y muestras de control de calidad, fue considerado "exento" por la Junta de Revisión Multiinstitucional de Colorado (COMIRB, Aurora, Colorado).
1. Preparación de referencias y soluciones
<ol>
	<li>Compre tacrolimus y el estándar interno D2,13 C-tacrolimus de los proveedores enumerados en la Lista de materiales.
	<ol>
		<li>Preparar soluciones madre en metanol puro a una concentración de 1 mg/ml para el tacrolimus y de 10 μg/ml para el C-tacrolimusD2,13. Elabore soluciones madre de materiales de referencia basadas en tres ponderaciones independientes. Soluciones madre alícuotas y almacene a -70 °C o menos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparar la solución para precipitar proteínas y extraer tacrolimus utilizando metanol / 0,2 MZnSO4 en agua (7:3, v:v). Esta solución también contiene el patrón interno D2,13 C-tacrolimus a una concentración de 2,5 ng/ml y se utiliza para la extracción de todas las muestras, excepto para la extracción de muestras en blanco (véase 1.3.3).
	<ol>
		<li>Prepare esta solución de precipitación de proteínas fresca en cada día de extracción y establezca la caducidad de la solución en 12 horas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de muestras de curva de calibración y control de calidad (QC)
	<ol>
		<li>Prepare las soluciones madre de tacrolimus realizando diluciones adecuadas de la solución madre utilizando metanol puro.</li>
		<li>Para preparar las muestras de los calibradores y del control de calidad, se añadan 20 μl de solución madre adecuadamente diluida en sangre total con EDTA, se incubará a 37 °C bajo una suave agitación en un baño de agua para permitir la distribución homogénea de tacrolimus en los componentes sanguíneos celulares durante 20 min y se colocará una alícuota en tubos de polipropileno de 1,5 ml con fondo cónico y tapas a presión. Asegúrese de que el volumen relativo de solvente orgánico no exceda el 5%.</li>
		<li>Coloque 50 μl de sangre entera enriquecida en el centro de cada círculo en las tarjetas de filtro con una pipeta.</li>
		<li>Seque las manchas de sangre en las tarjetas de filtro en RT durante 3 horas.</li>
		<li>Prepare patrones de calibración de tacrolimus en sangre total humana con EDTA a concentraciones de tacrolimus de 1, 2,5, 5, 10, 25 y 50 ng/ml. Prepare una muestra en blanco para la extracción como los patrones de calibración con la solución de precipitación de proteínas que contiene el patrón interno D2,13 C-tacrolimus ("muestra cero").</li>
		<li>Prepare muestras de control de calidad en sangre total con EDTA humano a concentraciones de 0, 2, 4, 20, 40 ng/ml. Prepare una muestra en blanco. A diferencia de las muestras de control de calidad que se extraen con precipitación que contiene el estándar interno D2,13 C-tacrolimus, extraiga esta muestra en blanco con una solución de precipitación de proteínas que no contenga el patrón interno D2,13 C-tacrolimus ("muestra en blanco").</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Recogida de muestras clínicas
	<ol>
		<li>Recoja las gotas de sangre seca como se describe en43,44.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Extracción de muestras de manchas de sangre seca de tacrolimus
<ol>
	<li>Inspeccione visualmente la muestra de sangre seca para garantizar una calidad y un volumen de muestra aceptables45.</li>
	<li>Perfore el centro de la mancha de sangre en la tarjeta de filtro con un perforador de 6 mm. 
	Nota: La calidad de los punzones puede controlarse mediante pesaje. Un disco de filtro saturado perforado pesa en promedio 5,02 mg ± 0,09 mg (rango: 4,83- 5,14 mg, n = 12).</li>
	<li>Coloque los discos en tubos de polipropileno de 1,5 ml con fondo cónico y tapas a presión.</li>
	<li>Añade de 20 a 30 balas a cada tubo.</li>
	<li>Añadir 500 μl de la solución de precipitación de proteínas (metanol: 0,2 M ZnSO4, 7:3, v:v con patrón interno de 2,5 ng/ml) en cada tubo. Para la extracción de muestras en blanco, utilice una solución de precipitación de proteínas sin el patrón interno.</li>
	<li>Homogeneizar los discos en el mezclador de balas durante 1 min (velocidad máxima, ajuste "10").</li>
	<li>Agite las muestras a RT en un vórtice multitubo (velocidad máxima, ajuste "10") durante 10 min.</li>
	<li>Centrifugar muestras a 16.000 x g y 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Transfiera los sobrenadantes a viales de HPLC de vidrio equipados con un inserto de 300 μl. Utilice sellos de teflón precortados. 
	Nota: Las muestras extraídas pueden almacenarse a -20 °C o menos hasta el análisis LC-MS/MS.</li>
</ol>
3. Análisis LC-MS/MS
<ol>
	<li>Cargue 100 μl del sobrenadante de la muestra extraída en la columna de extracción del cartucho C8 y lave con una proporción de 7:3 de ácido fórmico al 0,1% en agua: acetonitrilo a un caudal de 5 ml/min durante 1 min. Las conexiones de la válvula de conmutación se muestran en la Figura 2 y el gradiente recorrido por la bomba de extracción en la Tabla 1.</li>
	<li>A continuación, active la válvula de conmutación, lo que da lugar a un retrolavado de los analitos de la precolumna a la columna analítica.</li>
	<li>Ajuste el termostato de columna a 65 °C.</li>
	<li>Eluir los analitos de la columna analítica utilizando los caudales y el gradiente que se muestran en la Tabla 1.</li>
	<li>Conecte la columna analítica a un espectrómetro de masas en tándem a través de la fuente de ionización de electrospray turbo. Ajuste los parámetros clave del espectrómetro de masas de acuerdo con la Tabla 2.</li>
	<li>Detecta iones positivos ([M+Na]+) en el modo de reacción múltiple (MRM). Utilice las siguientes transiciones iónicas para la cuantificación: tacrolimus: m/z (masa/carga) = 826,6 → 616,2 y D 2,13C-tacrolimus: m/z= 829,6 → 619,2. 
	Nota: El tiempo total de ejecución es de 4,6 min.</li>
</ol>
4. Cuantificación
<ol>
	<li>Para cada corrida, genere una curva de calibración basada en los calibradores preparados en 1.3.5 e insúyela en cada corrida analítica.
	<ol>
		<li>Genere una curva de calibración trazando las concentraciones nominales frente al factor de respuesta del analito (Área de pico [analito] / Área de pico [estándar interno]) utilizando el software del espectrómetro de masas.</li>
		<li>Ajuste los calibradores utilizando un ajuste cuadrático en combinación con una ponderación 1/X.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para cuantificar tacrolimus en las gotas de sangre seca, integre el tacrolimus y los picos estándar internos en los cromatogramas MRM extraídos. Calcule el factor de respuesta para tacrolimus (Área de pico [analito] / Área de pico [estándar interno]) y compárelo con la curva de calibración utilizando el software de espectrometría de masas.</li>
</ol>
5. Procedimientos de validación
<ol>
	<li>Límite inferior de detección (LLOD) y límite inferior de cuantificación (LLOQ).
	<ol>
		<li>Considere la concentración más baja de tacrolimus con una relación pico-ruido de 4:1 como el límite inferior de detección (LLOD). Defina el límite inferior de cuantificación (LLOQ) como la concentración más baja de la curva de calibración con una precisión igual o mejor que ± desviación del 20% de la concentración nominal y una precisión igual o superior al 20% (coeficiente de varianza).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Exactitudes y precisiones intra e inter-día.
	<ol>
		<li>Pruebe la exactitud y precisión en cuatro niveles de concentración de 2 ng/ml (QC1), 4 ng/ml (QC2), 20 ng/ml (QC3) y 40 ng/ml (QC4).</li>
		<li>Prepare las muestras de control de calidad en cada día de validación en sangre total humana con EDTA, séquelas en tarjetas de filtro, extráigalas y analícelas como se describe anteriormente.</li>
		<li>Determine la exactitud y precisión intradía con 6 muestras por nivel de concentración de control de calidad.</li>
		<li>Evalúe la exactitud y precisión entre días durante 20 días. Mida cada nivel de control de calidad con 4 muestras cada día.</li>
		<li>Analice dos curvas de calibración junto con las muestras de control de calidad cada día.</li>
		<li>Calcule la precisión intradiaria como el % de la concentración nominal (seis muestras por nivel de concentración, véase el punto 5.2.2). Calcule la precisión como el coeficiente de varianza (CV%).</li>
		<li>Considere aceptable la precisión intradía si se encuentra dentro de los límites de aceptación del 85% al 115% de la concentración nominal. Considerar aceptable la precisión intradía si es igual o mejor que un CV (coeficiente de varianza) del 15%.</li>
		<li>Calcule la exactitud y precisión entre días como la media de cada nivel de concentración de control de calidad analizado durante los 20 días de validación.</li>
		<li>Considere aceptable la precisión media entre días si se encuentra dentro de los límites de aceptación del 85% al 115% de la concentración nominal. Considere aceptable la precisión entre días si es igual o mejor que un CV (coeficiente de varianza) del 15%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Exclusión de interferencias de matriz.
	<ol>
		<li>Para excluir las interferencias que pueden ser causadas por las señales de la matriz, analice las manchas de sangre seca en blanco (8 individuos diferentes, preferiblemente 4 machos y 4 hembras).</li>
		<li>Inspeccione visualmente los cromatogramas iónicos. Si se detectan picos dentro de la ventana de tiempo de retención de tacrolimus, integre y compare sus áreas bajo la curva con las de los picos de tacrolimus en muestras en blanco enriquecidas con tacrolimus en el LLOQ. Se supone que el área de los picos en las muestras en blanco no debe exceder el 15% de los de tacrolimus en el LLOQ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Supresión de iones/mejora de iones.
	<ol>
		<li>Utilice un protocolo de infusión posterior a la columna como se describe45 para evaluar la interferencia potencial de la supresión de iones/mejora de iones causada por los componentes de la matriz coeluyente.</li>
		<li>Infundir tacrolimus a una concentración de 10 μg/ml disuelto en ácido fórmico al 0,1%: metanol (30:70, v/v) después de la columna a una tasa de 10 μl/min.
		<ol>
			<li>Conecte una bomba de jeringa a través de una pieza en T entre la columna analítica y la fuente de electrospray del espectrómetro de masas.</li>
			<li>Monitorizar la intensidad de la señal MS/MS de las transiciones MRM para tacrolimus y su patrón interno (m/z = 826,6 → 616,2 y m/z = 829,6 → 619,2) después de la inyección de muestras en blanco extraídas (n = 8 muestras de diferentes individuos) 
			Nota: En ausencia de supresión de iones/mejora de iones, la señal continua causada por la infusión de los analitos no debe verse afectada por la inyección de la matriz en blanco, mientras que la supresión de iones provoca una caída de la señal y la mejora de iones un pico.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Arrastre.
	<ol>
		<li>Evalúe el posible arrastre mediante el análisis de muestras en blanco extraídas después de los calibradores más altos (50 ng/ml, n = 6).</li>
		<li>Inspeccione visualmente los cromatogramas iónicos. Si se detectan picos dentro de la ventana de tiempo de retención de tacrolimus, integre y compare sus áreas bajo la curva con las de los picos de tacrolimus en muestras en blanco enriquecidas con tacrolimus en el LLOQ. Se supone que el área de los picos en las muestras en blanco no debe exceder el 15% de los de tacrolimus en el LLOQ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Recuperaciones de extracción.
	<ol>
		<li>Determine las recuperaciones comparando las señales de los analitos después de la extracción de muestras de control de calidad en los cuatro niveles de concentración (n = 6 por concentración) con las de las manchas de sangre seca en blanco enriquecidas con las cantidades correspondientes de tacrolimus después de la extracción.</li>
		<li>Prepare cuatro series de QC (niveles de concentración: 2, 4, 20, 40 ng/ml).</li>
		<li>Prepare otros 4 juegos de las correspondientes "muestras de prueba de recuperación" colocando 50 μl de sangre entera EDTA en blanco en las tarjetas de papel de filtro y secando durante 2 horas.</li>
		<li>A continuación, tanto para el control de calidad como para las "muestras de prueba de recuperación" en blanco, corte toda la gota de sangre de la tarjeta de filtro con unas tijeras y coloque los discos resultantes en un tubo de polipropileno con fondo cónico y tapa a presión.</li>
		<li>Extraiga todas las muestras.</li>
		<li>Transfiera los sobrenadantes (400 μl) a viales de HPLC de vidrio.</li>
		<li>Añada la solución madre de tacrolimus a las "muestras de prueba de recuperación extraídas" en blanco para alcanzar concentraciones de 2, 4, 20 y 40 ng/ml (4 μl de soluciones madre de tacrolimus de 200, 400, 2.000, 4.000 ng/ml por 400 μl de sobrenadante).</li>
		<li>Después del análisis LC-MS/MS, compare las señales tanto en las muestras de control de calidad como en las "muestras de prueba de recuperación" de la concentración correspondiente (% de recuperación = muestras de señal con picos antes de la extracción / muestras de señal con picos después de la extracción x 100).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Integridad de la dilución.
	<ol>
		<li>Establezca la integridad de la dilución utilizando muestras enriquecidas con los analitos a 500, 250 y 100 ng/ml.</li>
		<li>Después de la extracción, diluya las muestras con una solución de precipitación de proteínas (1:10, n = 3 por nivel de concentración).</li>
		<li>Calcule las desviaciones de las concentraciones nominales. Considere los resultados que se encuentran entre el 85% y el 115% de lo aceptable nominal.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Estabilidades.
	<ol>
		<li>Investigue las estabilidades utilizando las muestras de control de calidad en los cuatro niveles de concentración (n = 4 por concentración) analizados en diferentes puntos de tiempo y en las diferentes condiciones de almacenamiento.</li>
		<li>Compare los resultados después del almacenamiento con los valores nominales. Considere los resultados que se encuentran entre el 85% y el 115% de lo aceptable nominal.</li>
		<li>Establecer la estabilidad de la muestra durante 1 semana a temperatura ambiente, 1 semana a 4 °C, 1 mes a -20 °C y 1 mes a -80 °C.</li>
		<li>Pruebe la estabilidad de congelación-descongelación durante tres ciclos (-20 °C). Pruebe la muestra extraída y la estabilidad del muestreador automático colocando las muestras en el muestreador automático termostático ajustado a 4 °C. Inyecte las muestras después de 72 horas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque, como se mencionó anteriormente, el concepto de fármaco terapéutico y el monitoreo de la adherencia de tacrolimus basado en gotas de sangre seca es atractivo, existen desafíos analíticos que van más allá de los típicamente asociados con el análisis LC-MS/MS de tacrolimus en muestras de sangre total venosa con EDTA. Estos incluyen, entre otros, el hecho de que la matriz es sangre entera capilar empapada en el material de los linters de algodón del material de la tarjeta de filtro utilizado aquí y el bajo volumen de...

Tacrolimus es un potente immonosupresor1-7 que tiene una estructura de macrólidos8 (Figura 1). Debido a la isomería cis-trans de los enlaces CN, forma dos rotámeros en la solución 9 que se pueden separar mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa El tacrolimus es lipofílico y soluble en alcoholes (metanol: 653 g/L, etanol: 355 g/L), hidrocarburos halogenados (cloroformo: 573 g/L) y éter. Es escasamente soluble en hidrocarburos alifáticos (hexano: 0,1 g/L y agua (pH 3: 0,0047 g/L)9. La molécula no contiene ningún cromóforo y su máxima de absorción de rayos UV es de 192 nm. El tacrolimus actúa a través de la inhibición de la calcineurina. Su mecanismo de acción ha sido revisado en las referencias10,11. Actualmente se utiliza en más del 80% de los pacientes con trasplante de órgano sólido en los Estados Unidos12.
El índice terapéutico de tacrolimus se considera estrecho13. Además, la correlación entre las dosis de tacrolimus y las concentraciones sanguíneas es pobre y la farmacocinética es variable14,15. El seguimiento terapéutico de fármacos para guiar la dosificación de tacrolimus en pacientes trasplantados es, por tanto, práctica clínica general16-20. El objetivo es mantener las concentraciones sanguíneas de tacrolimus dentro de un rango terapéutico predefinido. Las concentraciones de tacrolimus en sangre por debajo del rango terapéutico pueden dar lugar a un aumento de la actividad de las reacciones aloinmunes crónicas o agudas, mientras que las concentraciones por encima de la ventana terapéutica aumentan el riesgo de sobreinmunosupresión, cáncer y toxicidades, como nefrotoxicidad, neurotoxicidad, hipertensión y diabetes. La alta variabilidad farmacocinética intraindividual del tacrolimus puede ser perjudicial tanto para la supervivencia del órgano trasplantado como del paciente21,22. Si bien la variabilidad interindividual de la farmacocinética de tacrolimus es causada principalmente por los polimorfismos del CYP3A5, las razones de la variabilidad intraindividual incluyen, entre otras, las interacciones fármaco-fármaco, enfermedad-fármaco y alimento-fármaco14,15. Además, la falta de adherencia al régimen farmacológico terapéutico inmunosupresor es un factor contribuyente y una de las principales razones para la pérdida del injerto23,24.
Estas consideraciones sugieren que el farmacológico frecuente en el hogar y el monitoreo de la adherencia de las concentraciones de tacrolimus en sangre total pueden ser beneficiosos para garantizar que los pacientes tengan exposición a tacrolimus dentro de la ventana terapéutica deseada en todo momento. Sin embargo, la logística y el costo de un seguimiento terapéutico farmacológico más frecuente como es la práctica clínica actual15 es prohibitivo. Una de las razones es que el paciente tiene que ver a un flebotomista para que le extraiga la muestra de sangre venosa requerida. Las manchas de sangre seca han surgido recientemente como un concepto atractivo25-28. Después de un simple pinchazo en el dedo, el paciente recoge una gota de sangre en una tarjeta de papel de filtro especial y, después de que la gota de sangre se haya secado, se puede enviar por correo a un laboratorio central para el análisis de tacrolimus y cualquier otro inmunosupresor que el paciente pueda estar tomando actualmente. Esto ha sido posible gracias al desarrollo de ensayos LC-MS/MS altamente sensibles y específicos para la cuantificación de tacrolimus y otros inmunosupresores en volúmenes sanguíneos muy pequeños, como las gotas de sangre seca (típicamente 20 μl de sangre)25,29-43. Otra ventaja es que las estrategias de recolección de muestras mínimamente invasivas y de bajo volumen, como las gotas de sangre seca, facilitan enormemente el seguimiento terapéutico de fármacos y los estudios farmacocinéticos en niños pequeños28.
Tacrolimus se mide generalmente en sangre total venosa con EDTA15. Las razones son que el tacrolimus se distribuye ampliamente en las células sanguíneas y que los estudios clínicos han reportado una mejor correlación entre las concentraciones mínimas de tacrolimus en sangre que en plasma con eventos clínicos15,18. En comparación, el análisis de tacrolimus en manchas de sangre seca se basa en la sangre capilar que se mezcla con la matriz de papel de filtro. Esto presenta desafíos en términos de solubilización de tacrolimus y posibles interferencias con el análisis LC-MS/MS. Aquí presentamos un ensayo establecido y validado basado en la homogeneización de la mancha de sangre seca utilizando un mezclador de balas en combinación con un procedimiento de limpieza de muestras en columna en línea de alto flujo y análisis LC-MS/MS. A día de hoy, este ensayo se ha utilizado con éxito para la cuantificación de más de cinco mil muestras de muestras de sangre seca de tacrolimus para el seguimiento de la adherencia en ensayos clínicos.

<table><tbody><tr><td>Tacrolimus</td><td>Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos</td><td>1642802</td><td></td></tr><tr><td>D2,13C-Tacrolimus</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td></td><td></td>F370002</tr><tr><td>Glóbulos rojos</td><td>Hospital de la Universidad de Colorado</td><td>W20091305500 V</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Hospital</td><td>de la Universidad de Colorado</td><td></td> W2017130556300Q <td></td></tr><tr><td>Acetona CHROMASOLV, HPLC, &ge; 99,9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439126-4 L</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol 99.9%, HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2632-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol Optima LC/MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Water Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 &ndash; 10 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml tubo Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10 &ndash; 100 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008651</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l puntas de pipeta con filtro, estériles</td><td>Neptune</td><td>BT 10XLS3</td><td></td></tr><tr><td>100 &ndash; 1.000 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l puntas de pipeta con filtro, estériles</td><td>Neptune</td><td>BT 100</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &mu; l puntas de pipeta con filtro, estériles</td><td>Multimax</td><td>2940</td><td></td></tr><tr><td>2 &ndash; 20 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo 17008650</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml tubo Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>20 &ndash; 200 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l puntas de pipeta con filtro, estériles</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-20</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l puntas de pipeta con filtro</td><td>Multimax</td><td>2938T</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l puntas de pipeta con filtro, estériles</td><td>Multimax</td><td>2936J</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon tubo</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; l insertos para viales de HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO-9973-13</td><td></td></tr><tr><td>Balanza PR2002</td> Balanzas <td>1117050723</td><td></td><td>Mettler Toledo</td></tr><tr><td>AX205 Gama Delta</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119343379</td><td></td></tr><tr><td>Batidora de bala Homogeneizador Siguiente</td><td>Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Biofuge Fresco</td><td>Heraeus</td><td>290395</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas</td> <td>DesechablesPDI</td><td>Q55172</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio, 4 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>Viales de vidrio, 20 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B7800-20</td><td></td></tr><tr><td>Guantes, nitrilo</td><td>Titan Brand Gloves</td><td>44-100S Viales</td><td></td>de</tr><tr><td>HPLC, 9 mm, 2 ml, transparentes</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 9921-13</td><td></td></tr><tr><td>Tapas para viales de HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 8952-13-B</td><td></td></tr><tr><td>Aguja, 18 g 1.5</td><td>Portaobjetos de precisión</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Rack para tubos Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-448-11</td><td></td></tr><tr><td>Rack para viales de HPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-541-29</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de acero 0,9 &ndash; 2 mm</td><td>Siguiente Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Cajas de almacenamiento para congeladores / refrigeradores</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice multitubo estándar</td><td>VWR Scientific Products</td><td>658816-115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td><td>GE Whatman&nbsp;</td><td>2016-05</td><td></td></tr><tr><td>Muestreador automático</td><td>CTC PAL&nbsp;</td><td>Camarada. HTCABIx1</td><td></td></tr><tr><td>Bomba binaria, Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G1312B</td><td></td></tr><tr><td>Bomba binaria, Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Micro desgasificador al vacío, Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G13798</td><td></td></tr><tr><td>Horno de columna,&nbsp; Agilent 1290 con 2 posiciones&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1216C</td><td></td></tr><tr><td>Compartimento de columna termostatizado con válvula de conmutación integrada de 6 puertos</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho de precolumna para HPLC, Zorbax XDB C8 (5 y micro; m tamaño de partícula), 4.6 y middot; Columna</td> analítica <td>HPLC Phenomenex</td><td>820950-926</td><td></td>de 12,5 mm</tr><tr><td>, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &micro; m tamaño de partícula), 4.6 y middot; </td><td>Espectrómetro</td><td></td> de masas en tándem Phenomenex 993967-906 <td></td>de 150 mm</tr><tr><td>API5000 MS/MS con fuente TurboIonspray</td><td>AB Sciex</td><td>4364257</td><td></td></tr><tr><td>Software de espectrometría de masas</td><td>AB Sciex</td><td>Analyst 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación del inmunosupresor tacrolimus en gotas de sangre seca mediante lc-ms/ms

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

El inhibidor de calcineurina tacrolimus es la piedra angular de la mayoría de los protocolos de tratamiento inmunosupresor después del trasplante de órganos sólidos en los Estados Unidos. El tacrolimus es un fármaco de índice terapéutico estrecho y, como tal, requiere un seguimiento terapéutico del fármaco y un ajuste de la dosis en función de sus concentraciones mínimas en sangre total. Para facilitar el seguimiento de la adherencia y la farmacoterapia terapéutica en el hogar, la recolección de gotas de sangre seca es un concepto atractivo. Después de una punción en el dedo, el paciente recoge una gota de sangre en papel de filtro en casa. Una vez que la sangre se seca, se envía por correo al laboratorio analítico donde se cuantifica el tacrolimus mediante cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) en combinación con un simple paso manual de precipitación de proteínas y extracción en columna en línea.
Para el análisis de tacrolimus, se perfora un disco de 6 mm desde el centro saturado de la mancha de sangre. La gota de sangre se homogeneiza utilizando un mezclador de bala y luego las proteínas se precipitan con metanol/0,2 M ZnSO4 que contiene el estándar interno D2,13 C-tacrolimus. Después del vórtice y la centrifugación, se inyectan 100 μl de sobrenadante en una columna de extracción en línea y se lavan con 5 ml/min de ácido fórmico/acetonitrilo 0,1 (7:3, v:v) durante 1 min. A continuación, se activa la válvula de conmutación y los analitos se retrolavan en la columna analítica (y se separan mediante un gradiente de ácido fórmico/acetonitrilo del 0,1%). El tacrolimus se cuantifica en el modo de reacción múltiple positiva (MRM) utilizando un espectrómetro de masas en tándem.
El ensayo es lineal de 1 a 50 ng/ml. La variabilidad entre ensayos (3,6%-6,1%) y la precisión (91,7%-101,6%) evaluadas durante 20 días cumplen con los criterios de aceptación. La recuperación media de la extracción es del 95,5%. No hay arrastre relevante, interferencias de matriz ni efectos de matriz. El tacrolimus es estable en las gotas de sangre seca a RT y a +4 °C durante 1 semana. Las muestras extraídas en el muestreador automático son estables a +4 °C durante al menos 72 horas.

En la Figura 3 se muestran cromatogramas iónicos representativos de una muestra en blanco, una muestra con picos en el límite inferior de cuantificación y una muestra de paciente.
Curvas de calibración
El límite inferior de detección fue de 0,5 ng/ml y el límite inferior de cuantificación fue de 1,0 ng/ml. Se eligió cincuenta ng/ml como el calibrador más alto, ya que es poco probable que se alcancen concentraciones más altas en la clínica en circuns...

Aquí describimos un ensayo de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) para cuantificar el inmunosupresor tacrolimus en manchas de sangre seca utilizando un paso simple de precipitación manual de proteínas y extracción en columna en línea.

Cuantificación del inmunosupresor tacrolimus en gotas de sangre seca mediante LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar el tacrolimus en manchas de sangre seca. La principal ventaja de esta técnica sobre la cuantificación de tacrolimus en muestras de sangre después de la extracción de sangre intravenosa es que los pacientes pueden recolectar muestras por sí mismos: las estrategias de recolección de muestras de bajo volumen mínimamente invasivas, como las gotas de sangre seca, también facilitan el seguimiento terapéutico de medicamentos y los estudios farmacocinéticos en niños pequeños. Después de un simple pinchazo en el dedo, el paciente recoge una gota de sangre en una tarjeta de papel de filtro especial, y después de que la gota de sangre se seca, se puede enviar por correo a un laboratorio central para el análisis de tacrolimus y cualquier otro inmunosupresor que el paciente pueda estar tomando.La cuantificación de fármacos en gotas de sangre seca ha sido posible gracias al desarrollo de ensayos LCM SM S altamente sensibles y específicos para la cuantificación de tacrolimus y otros inmunosupresores en volúmenes sanguíneos muy pequeños, como las gotas de sangre seca. En primer lugar, prepare soluciones madre en metanol puro a una concentración de un miligramo por mililitro para el tacrolimus y una concentración de 10 microgramos por mililitro. Para D dos soluciones madre alícuotas de 13 C y almacenarlas a menos 70 grados Celsius o menos en cada día de extracción, prepare una proporción de siete a tres de metanol y sulfato de zinc 0,2 molar en agua para precipitar proteínas y extraer tacrolimus.La solución madre estándar interna se introduce en la solución de precipitación. Establezca la caducidad de la solución en 12 horas. A continuación, prepare las soluciones madre de tacrolimus realizando una dilución adecuada de la solución madre utilizando metanol puro para preparar calibradores y muestras de control de calidad.Agregue 20 microlitros de la solución madre adecuadamente diluida en EDT. Una sangre entera se incuba a 37 grados centígrados bajo una suave agitación en un baño de agua durante 20 minutos para permitir la distribución homogénea de tacrolimus en los componentes celulares de la sangre. Para preparar una mayor cantidad de calibradores y muestras de control de calidad, agregue 2000 microlitros de la solución madre adecuadamente diluida en EDT.Una sangre entera se incuba a 37 grados centígrados bajo una suave agitación en un baño de agua durante 20 minutos para permitir la distribución homogénea de tacrolimus en los componentes celulares de la sangre. A continuación, alícuota las muestras en tubos de polipropileno de 1,5 mililitros con fondos cónicos y tapas a presión. Localice 50 microlitros de sangre entera enriquecida en el centro de cada círculo en tarjetas de filtro con una pipeta después de secar las manchas de sangre a temperatura ambiente durante tres horas, prepare estándares de calibración de tacrolimus en sangre total EDTA humana a concentraciones de tacrolimus de 2,5, 5, 10, 25 y 50 nanogramos por mililitro.Prepare una muestra en blanco para la extracción como los patrones de calibración con la solución de precipitación de proteínas, que no contenga el patrón interno D dos 13 C de tacrolimus. A continuación, prepare muestras de control de calidad en sangre total humana con EDTA a concentraciones de 0, 2, 4, 20 y 40 nanogramos por mililitro. Prepare también una muestra en blanco Después de recolectar las gotas de sangre seca, inspeccione visualmente cada una para garantizar una calidad y un volumen de muestra aceptables.A continuación, perfora el centro de la mancha de sangre en la tarjeta de filtro con una perforadora de seis milímetros. Coloque los discos en tubos de polipropileno de 1,5 mililitros con fondos cónicos y encaje las tapas. Agregue de 20 a 30 balas a cada tubo.Después de esto, agregue 500 microlitros de la solución de precipitación de proteínas en cada tubo. Homogeneizar los discos en una batidora de balas durante un minuto a máxima velocidad. Cuando termine, agite las muestras a temperatura ambiente en un vórtice multitubo a velocidad máxima durante 10 minutos.A continuación, centrifugar las muestras a 16.000 GS y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de la centrifugación, transfiera el SNAT a viales de HPLC de vidrio equipados con un inserto de 300 microlitros. En este punto, cargue 100 microlitros del supernat de la muestra extraída en la columna de lavado de extracción de ocho cartuchos C con una proporción de siete a tres de 0,1% de ácido fórmico en agua y nitrilo ácido a un flujo de cinco mililitros por minuto.A partir de entonces, durante un minuto, active la válvula de conmutación, lo que dará lugar a un retrolavado de los analitos de la precal a la columna analítica. A continuación, ajuste el termostato de columna a 65 grados centígrados. Eluya los analitos de la columna analítica utilizando los caudales y el gradiente que se muestran aquí.Conecte la columna analítica a un espectrómetro de masas en tándem a través de la fuente de ionización de electrospray turbo. Ajuste los parámetros clave del espectrómetro de masas de acuerdo con la siguiente tabla. A continuación, detecte iones positivos en el modo de reacción múltiple.Para cuantificar el tacrolimus en las gotas de sangre seca, compárelo con la curva de calibración utilizando el software de espectrometría de masas cromatogramas iónicos representativos de una muestra en blanco. Aquí se muestra una muestra con picos en el límite inferior de cuantificación y una muestra de paciente. Aquí se muestra una curva de calibración típica.El coeficiente medio de correlación es de 0,9994. Los resultados de exactitud y precisión se muestran en detalle aquí. No se observaron indicios de supresión o mejora significativa de iones y no se observó ningún arrastre relevante que diera lugar a la superación de los picos.Se detectó el 15% de la señal en el límite inferior de cuantificación. La integridad de la dilución se investigó mediante el análisis de muestras preparadas a concentraciones superiores al calibrador más alto y diluidas en una solución de precipitación de proteínas después de la extracción para alcanzar las concentraciones objetivo. Todas las diluciones probadas cumplieron con los criterios de aceptación.No se observaron pérdidas después de una semana de almacenamiento a temperatura ambiente, después de una semana de almacenamiento a cuatro grados centígrados y después de un mes de almacenamiento a 20 grados centígrados negativos. Además, no se observaron pérdidas después de un mes de almacenamiento a menos 80 grados Celsius después de tres ciclos de congelación y descongelación, y después de 72 horas de muestras extraídas en el muestreador automático a cuatro grados Celsius. Una vez dominadas, se pueden extraer 20 muestras en menos de una hora.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la clave para una cuantificación confiable es la calidad de la mancha de sangre seca y que el disco se perfora desde un área completamente saturada del papel de filtro. Las técnicas y el ensayo que se muestran en este video proporcionan una tecnología de plataforma para cuantificar otros inmunosupresores y medicamentos en gotas de sangre seca.

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