Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en Saccharomyces cerevisiae

El objetivo general del siguiente experimento es determinar rápidamente los requisitos genéticos para la degradación de una proteína inestable en Croce Visier. Esto se logra mediante la fusión de una enzima reportera necesaria para el crecimiento en condiciones selectivas específicas con una proteína inestable de interés. A continuación, las células de tipo salvaje o mutantes, ambas expresando la proteína de fusión, se cultivan en placas de agar medio selectivo.

El ensayo de siembra proporciona un indicador conveniente de la estabilización de proteínas sobre la base del crecimiento de células de levadura para confirmar bioquímicamente las diferencias en la abundancia de proteínas, mientras que el tipo de células mutantes que albergan la proteína de fusión se lisa a través de un método de extracción de proteínas rápido e ineficiente para el análisis de Western blot. Los resultados muestran que la abundancia de una proteína inestable aumenta en las células con una mutación en un gen necesario para la degradación. Lo contrario es cierto para las cepas de tipo salvaje competentes para la degradación.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los análisis de persecución de pulsos y de persecución de ciclos, es que requiere menos mano de obra y menos tiempo, lo que permite la determinación rápida y de alto rendimiento de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre los requisitos de degradación para una variedad de proteínas inestables. También se puede utilizar para identificar reguladores de otros aspectos de la expresión génica, como la transcripción y la traducción.

Los encargados de demostrar los procedimientos estarán a cargo de Sheldon Watts y Justin Crowder. Los estudiantes de mi laboratorio antes del ensayo transforman un plásmido que codifica una proteína de fusión que consta de una proteína inestable y una enzima reportera metabólica en una cepa de levadura mutante. Se sospecha que tiene defectos genéticos relacionados con la regulación de la degradación de proteínas como control, también transforma el mismo plásmido en una cepa de levadura de tipo salvaje.

Inocular los transformantes en cinco mililitros de medio mínimo que seleccione para las células, albergando las moléculas de plásmido. Coloque el tubo de ensayo en un rotador inclinado e incube durante la noche a 30 grados centígrados al día siguiente. Mida la densidad óptica de los cultivos nocturnos y, a continuación, iguale la concentración celular de todas las células diluyendo cada cultivo hasta un diámetro exterior de 600 de 0,2 con medios frescos y tubos de centrífuga individuales estériles de 1,5 mililitros.

Para comenzar el ensayo principal, configure una matriz de serie de dilución séxtuple transfiriendo primero 200 microlitros de cada cepa prediluida, a partir de un DE 600 de 0,2 a pocillos designados en la primera columna de una placa estéril de 96 pocillos en preparación para diluciones posteriores, utilice una pipeta multicanal para agregar 125 microlitros de agua estéril a los pocillos vacíos en las columnas dos, tres, y cuatro. A continuación, transfiera 25 microlitros de levadura de la columna uno a la columna dos, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar las células de manera uniforme y proceda a transferir 25 microlitros de células de la columna dos a la columna tres. Repita los pasos de dilución en serie hasta que los pocillos de la columna cuatro estén bien mezclados como ayuda visual para la detección de células.

Imprima una plantilla de rejilla y péguela con cinta adhesiva en el interior de la tapa de una placa de Petri, comenzando con la columna menos concentrada en la matriz de dilución en serie. Transfiera cuatro microlitros de células de cada columna. En la placa de 96 pocillos en una placa de agar medio mínimo de control que selecciona para el mantenimiento del plásmido intracelular Detecte otros cuatro microlitros de células de cada columna en una placa de agar medio mínima separada que selecciona ambos plásmidos intracelulares.

Mantenimiento y expresión de la proteína de fusión inestable. Deje que ambos platos se sequen en el banco durante cinco a 10 minutos. Selle las tapas con param para evitar la deshidratación e incube las células a 30 grados centígrados durante dos a seis días.

Cuando las colonias del cultivo de más rápido crecimiento se hagan visibles por primera vez en el punto más diluido de una placa determinada, retire la placa de la incubadora y documente el grado de crecimiento. Al tomar fotografías, puede ser necesario tomar fotografías de diferentes placas en diferentes días o de la misma placa en varios días. En el caso de diferentes cepas de levadura que exhiben un amplio rango de tasas de crecimiento, se ha confirmado bioquímicamente que un gen identificado en el ensayo de crecimiento regula la abundancia de proteínas, se comienza por transformar las cepas de levadura de tipo salvaje y mutante con un plásmido que codifica la proteína de fusión antes mencionada, se inoculan los transformantes en cinco mililitros de medio mínimo que selecciona para el mantenimiento del plásmido intracelular y se incuban los tubos durante la noche en un rotador inclinado a 30 grados centígrados.

Al día siguiente, mida la densidad óptica a 600 de cada cultivo durante la noche. Una vez que todas las cepas hayan alcanzado un OD 600 de 0,4 o más, diluya todos los cultivos hasta 0,2 con medio fresco de modo que el volumen final de cada cepa sea de 10 mililitros. Incubar las células en una plataforma agitadora a 30 grados centígrados hasta que todos los cultivos alcancen un crecimiento de fase logarítmica media OD 600, entre 0,8 y 1,2.

Recoja una célula transfiriendo un total de 2,5 unidades OD de células a un tubo cónico fresco de 15 mililitros. Centrifugar las células a temperatura ambiente durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante S. A continuación, añada un mililitro de agua destilada, vórtice o pipeta hacia arriba y hacia abajo para resuspender el paladar y transferir la suspensión celular a un tubo fresco de 1,5 mililitros.

Aislar las células con la segunda centrifugación durante 30 segundos A temperatura ambiente, retirar el snat y resuspender las células en 100 microlitros de agua destilada. Añadir 100 microlitros de hidróxido de sodio 0,2 molar a la suspensión celular, pipetear hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para mezclar e incubar las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente para evitar la lisis celular prematura. No haga vórtices en las células.

Aislar las células de nuevo con una tercera centrifugación durante 30 segundos. A temperatura ambiente, retire los sobrenadantes de las células y lide las células suspendiendo el pellet en 50 a 100 microlitros de un tampón de muestra de lamby, desnaturalice todas las proteínas incubando la suspensión a 95 grados centígrados durante cinco minutos, y luego enfríe el lisado de toda la célula en hielo durante cinco minutos. Para analizar la abundancia de proteínas propensas a la agregación, como las proteínas con varios segmentos transmembrana, determine empíricamente la incubación, la temperatura y el tiempo óptimos de desnaturalización comenzando a 70 grados Celsius durante 10 minutos en lugar de 95 grados Celsius durante cinco minutos.

Finalmente, aísle la fracción soluble centrifugando el lisado durante un minuto a temperatura ambiente, transfiera el snat a un tubo nuevo y deseche la fracción de pellets insoluble. La fracción soluble ahora puede cargarse directamente en una página SDS, gel o almacenarse a menos 20 grados Celsius en la configuración de un ensayo de degradación de proteínas basado en el crecimiento de levaduras. Una proteína de triple fusión inestable se fusiona con una enzima metabólica adicional que complementa el fondo de la cepa de levadura que carece del mismo gen metabólico.

Cuando la proteína de fusión se expresa en levadura, es propensa a eventos de translocación estériles en la membrana del retículo endoplásmico. Esta translocación aberrante desencadena la degradación mediada por ubiquitina de toda la proteína, incluida la enzima metabólica, evitando así la proliferación celular. Sin embargo, en las cepas de levadura que carecen de la ubiquitina ligasa, la proteína de fusión está protegida de la degradación, incluso en la translocación promedio, lo que permite que las células proliferen.

Por lo tanto, en presencia de ubiquitina ligasa, existe una correspondencia entre la degradación de proteínas que ocurre dentro de las células y la incapacidad de las células de levadura para proliferar en placas de agar empobrecidas en metabolitos. Por otro lado, en el contexto de una ubiquitina ligasa, la proliferación celular indica que la proteína de fusión se protegió de la degradación para reducir el crecimiento de fondo o espurio y aumentar la rigurosidad de este ensayo. Se pueden agregar inhibidores competitivos de la enzima metabólica al medio de crecimiento para confirmar los resultados observados en el ensayo de crecimiento de levaduras.

La evidencia directa de la degradación de la proteína de fusión también se puede determinar con un Western blot. En presencia o ausencia de ubiquitina ligasa, la proteína de fusión se degradará o se salvará de la destrucción, respectivamente. Es importante recordar que estos procedimientos informan más directamente sobre la abundancia en estado estacionario de la proteína de interés.

Una vez que se han llevado a cabo estos procedimientos, se pueden realizar análisis de pulso o de persecución de cicloheximida para analizar directamente la cinética de degradación de proteínas y la presencia de mutaciones que aumentan los niveles de proteínas en el estado de estudio.