Name: Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprenda a determinar requisitos genéticos para la degradación de proteínas en Saccharomyces cerevisiae mediante ensayos de crecimiento y confirmación con Western blot. Este método permite identificar factores genéticos clave en la regulación celular.

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Damos las gracias a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Rubenstein para proporcionar un entorno de investigación y de apoyo entusiasta. Agradecemos a Ryan T. Gibson para la ayuda en la optimización del protocolo. Damos las gracias a Marcos Hochstrasser (Universidad de Yale) y Dieter Wolf (Universität Stuttgart) para las cepas de levadura y plásmidos. Agradecemos a nuestros revisores anónimos por su ayuda en la mejora de la claridad y la utilidad de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un premio de investigación del capítulo de la Universidad Ball State de Sigma Xi a SGW, los Institutos Nacionales de Salud de subvención (R15 GM111713) para EMR, un premio de investigación de la Universidad Ball State aspirar a EMR, y los fondos de la Universidad Ball State Oficina del Rector y del Departamento de Biología.

1. Ensayo de crecimiento de la levadura para identificar mutantes candidatos defectuosos en la degradación de proteínas <ol><li> Transformar de tipo salvaje y células de levadura mutante con un plásmido que codifica una proteína inestable fusionado, en cuadro, a una enzima metabólica reportero. </li><li> Inocular los transformantes en 5 ml de sintético definido (SD) medio mínimo que es selectivo para células que albergan moléculas de plásmido. Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación. </li><li> Medir la densidad óptica a 600 nm (OD 600) de cada cultivo de una noche. NOTA: Después de la incubación durante la noche, las células en cultivo puede estar en fase de crecimiento logarítmico o estacionario, pero deberá haber alcanzado una OD 600 de 0,2 mínimo. Cepas de levadura de crecimiento muy lento pueden requerir tiempos de incubación más de una noche, o la inoculación de un mayor número de células, tal como se determina empíricamente. </li><li> Preparar seis veces diluciones en serie de células de levadura transformadas en una placa de 96 pocillos estériles, a partir de células diluidas a unan OD 600 de 0,2. Coloque cada transformante de levadura a ensayar en una fila diferente en la placa de 96 pocillos. <ol><li> Para cada transformante, calcular el volumen de cultivo de una noche requerido para diluir las células hasta una DO 600 de 0,2 en un volumen final de 200 microlitros. Añadir este volumen de cultivo durante la noche al pocillo correspondiente en la columna 1. Añadir la cantidad apropiada de agua estéril para llevar el volumen a 200 l. </li><li> Para cada fila de la levadura, añadir 125 l de agua estéril a los pocillos en las columnas 2, 3, y 4. NOTA: placas de 96 pocillos estériles envueltas individualmente pueden envasarse con tapas estériles. Las tapas pueden ser utilizados como depósitos para el agua estéril que se distribuye en este paso. Esto permite la transferencia simultánea de agua estéril a todos los pocillos en una columna dada con una pipeta multicanal. </li><li> Mezclar el contenido de la primera columna (levadura diluida a un OD 600 de 0,2) pipeteando arriba y abajo con una pipeta multicanal. </li><li> Transfer 25 l de levadura de la Columna 1 Columna 2, utilizando una pipeta multicanal. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Transferencia de 25 l de la Columna 2 a columna 3, y 25 l de la columna 3 a la columna 4 (mezclando bien en cada paso). </li></ol></li><li> Mezclar cada muestra con una pipeta multicanal. Partiendo de más diluido para diluir menos columnas de levadura, pipeta de 4 l de cada muestra en dos placas que contenían el medio selectivo apropiado. Utilice una placa con medio que mantiene la selección del plásmido (Esta placa sirve como un manchado levadura y el control del crecimiento). Utilice una segunda placa con medio que selecciona para el mantenimiento del plásmido y la expresión de la proteína inestable fusionado a la enzima informadora. Debido a que la levadura resolver rápidamente, mezclar células pipeteando arriba y abajo a intervalos regulares. NOTA: Secador placas serán más fácilmente absorber líquidos que los platos recién preparados y por lo tanto se recomienda para estos experimentos. Placas húmedas se pueden secar por incubación a temperatura ambiente en low humedad durante 1-2 días o incubaciones cortas en una campana de flujo laminar. Las placas pueden secar de forma desigual si el flujo de aire laminar es paralelo a la mesa. El uso de una plantilla hace que sea más fácil de detectar células de levadura a distancias regulares. Dos plantillas de ejemplo se proporcionan en la Figura 1. Estos pueden ser impresas, cortadas y colocadas en el interior de un plato de Petri tapa. </li><li> Permita que las placas se sequen en la parte superior del banco. </li><li> Incubar las placas a 30 ° C durante 2-6 días. </li><li> Fotografiar cada placa después de la incubación. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> Figura 1. Las plantillas para la detección de células de levadura en placas de agar de 100 mm. Estas plantillas se pueden usar para facilitar la detección de la levadura a distancias regulares con una pipeta multicanal. Las plantillas pueden ser impresas, cortadas y colocadas en el interior de un plato de Petri tapa. Coloque placa de Petri con el crecimientointerior de la tapa medio con plantilla fija. Plantillas están marcados con una muesca para realizar un seguimiento de la orientación. Se recomienda que las placas utilizadas en los ensayos de crecimiento ser marcados de manera similar con una muesca para realizar un seguimiento de la orientación. Plantillas para la detección de cuatro (A) o cinco (B) se proporcionan diluciones seriadas de células de levadura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión imprimible de esta figura con plantillas de 100 mm.</a> 2. Ensayo de confirmación bioquímica de crecimiento de la levadura <ol><li> El crecimiento de células de levadura y Post-alcalina proteína Extracción (modificado de 31) <ol><li> Transformar de tipo salvaje y células de levadura mutante con un plásmido que codifica la proteína inestable. </li><li> Inocular los transformantes en 5 ml de medio SD que es selectivo para células que albergan moléculas de plásmido. Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación. </li><li> Mida el diámetro exterior 600 de cada cu nochelture. NOTA: Después de la incubación durante la noche, las células pueden estar en cualquier fase de crecimiento logarítmico o estática, pero han llegado a un OD 600 que permita la dilución a un OD 600 de 0,2 en 10 ml de medio selectivo fresco (etapa 2.1.4). Cepas de levadura de crecimiento muy lento pueden requerir tiempos de incubación más de una noche, o la inoculación de un mayor número de células, tal como se determina empíricamente. </li><li> Diluir las células de levadura a un OD 600 de 0,2 en 10 ml de medio selectivo fresco. </li><li> Continuar incubar las células a 30 ° C, rotación o agitación, hasta que los cultivos alcancen un OD 600 entre 0,8 y 1,2 (es decir, están en crecimiento semilogarítmica). NOTA: Si la proteína inestable de interés está bajo el control de un promotor regulable, el momento óptimo de la inducción de la expresión de la proteína y la cosecha de células puede variar de acuerdo con estudios previos u observaciones empíricas. </li><li> Recoger 2,5 OD 600 unidades de cultivo en un 15 ml cónicaal tubo por centrifugación a 5000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración. NOTA: Una OD 600 unidad se define como la cantidad de levadura presente en 1 ml de cultivo a una DO 600 de 1,0. El volumen de cultivo (en ml) requerida para cosechar 2,5 OD 600 unidades (V) se puede determinar usando la siguiente ecuación: V = 2,5 OD 600 unidades / OD Medido 600 </li><li> Resuspender las células en 1 ml de agua destilada. Transferencia de células suspendidas a un tubo de microcentrífuga. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 6500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración. </li><li> Resuspender las células en 100 l de agua destilada con la pipeta hacia arriba y abajo o vórtice, y añadir 100 l de 0,2 M de NaOH. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Incubar las muestras durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Células de pellets (la mayoría de los cuales aún no han lanzado proteínas y son todavía viables) por centrifugación a 18.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración. </li><li> Resuspender pellet en 50 - 100 l de tampón de muestra Laemmli 1x, el cual lisar las células, pipeteando arriba y abajo o agitación con vórtex. NOTA: La eliminación del sobrenadante después de la centrifugación alcalina y posterior resuspensión de las células en tampón de muestra Laemmli extrae proteínas a un pH compatible con sodio dodecil sulfato de electroforesis en gel-poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando un sistema de tampón de Tris-glicina y Western Blot. </li><li> Para desnaturalizar completamente proteínas, se incuban los lisados ​​a 95 ° C durante 5 min. NOTA: Las proteínas de agregación propensos (por ejemplo, proteínas con varios segmentos de transmembrana) pueden llegar a ser insolubles cuando se incuba a 95 ° C. Por lo tanto, los lisados ​​deben incubarse a temperaturas más bajas (por ejemplo 37 ° C - 70 ° C) durante 10 a 30 min, determinado como empíricamente, para el análisis de tales proteínas. </li><li> Super lisados ​​mediante la colocación en hielo durante 5 min. </li><li> Centrifugar a lisados ​​18000 xg durante 1 min a temperatura ambiente para sedimentar el material insoluble. Separar el sobrenadante (proteína extraída solubilizado) por SDS-PAGE antes del análisis de transferencia de western posterior (sección 2.2). Como alternativa, las tiendas lisados ​​a -20 ° C. </li></ol></li><li> Representante Protocolo de Transferencia Western <ol><li> Cargar empíricamente determinado volumen de lisados ​​en un gel de SDS-PAGE. </li><li> Ejecutar gel a 200 V hasta el frente de colorante ha alcanzado la parte inferior del gel. </li><li> Transferencia de proteínas a partir de gel de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de la membrana por transferencia en húmedo a 20 V para 60 a 90 min a 4 ° C. </li><li> Bloquear la membrana por incubación en leche descremada al 5% en Tris-solución salina tamponada (TBS), oscilación, durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Decantar la solución de bloqueo. </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo primario específico para la proteína de interés (o etiqueta de epítopo de los mismos) en 1% de leche desnatada en TBS con 0,1% de Tween-20 (TBS / T) durante 1 h en la sala de temperatura, meciéndose. </li><li> Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo. </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, de balanceo. NOTA: Debido a fluoróforos son sensibles a la luz, las diluciones de anticuerpos fluoróforo conjugado deben prepararse en la oscuridad. Además, la incubación de las membranas en la presencia de anticuerpos conjugado con fluoróforo debe ocurrir en recipientes a prueba de luz. Esto puede lograrse envolviendo las bandejas de incubación en papel de aluminio. </li><li> Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo. </li><li> Adquirir imagen de membrana utilizando Li-Cor Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. </li><li> Después de la formación de imágenes de la membrana, se incuba la membrana con un anticuerpo primario específico para una cargaing proteína de control en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, meciéndose. </li><li> Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo. </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, de balanceo. </li><li> Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo. </li><li> Adquirir imagen de membrana utilizando Li-Cor Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La metodología que aquí se presenta permite la determinación rápida y la confirmación bioquímica de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas en células de levadura. Estos experimentos ponen de relieve la utilidad y el poder de la levadura como un organismo eucariota modelo (varios excelentes críticas de la biología de la levadura y compilaciones de protocolos para el manejo, almacenamiento y manipulación de células de levadura (por ejemplo 41-44) están disponibles para los investigad...

La degradación de proteínas selectiva es esencial para la vida eucariota, y la degradación de proteínas alterada contribuye a una serie de condiciones médicas, incluyendo varios tipos de cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, y la fibrosis quística 1-5. El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), que cataliza la degradación selectiva de proteínas, es una diana terapéutica emergente para estas condiciones 6-10. Ubiquitina ligasas unir covalentemente polímeros de la ubiquitina de ácido 76-amino de proteínas 11. Las proteínas que se han marcado con cadenas poliubiquitina son reconocidos y proteolizadas por los ~ 2.5 megadalton proteasoma 26S 12. Los estudios iniciados en el organismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) han sido fundamental en la elucidación de los mecanismos de degradación de proteínas en células eucariotas. El primer sustrato fisiológico demostrada del UPS era la levadura represor transcripcional MATα2 13, Primero se identificaron 14, y muchos componentes altamente conservadas de la UPS o caracterizadas en la levadura (por ejemplo, 15-26). Los descubrimientos hechos en este modelo versátil y manejable de forma genética organismo es probable que continúe proporcionando importantes conocimientos sobre conservados mecanismos de degradación mediada por ubiquitina. El reconocimiento y la degradación de la mayoría de los sustratos de UPS requieren la acción concertada de múltiples proteínas. Por lo tanto, un objetivo importante en la caracterización de la degradación regulada de una proteína dada es inestable para determinar los requisitos genéticos para la proteólisis. Los enfoques clásicos (por ejemplo de pulso-caza y experimentos cicloheximida-caza 27) para el seguimiento de la degradación de proteínas en células de mamífero o de levadura son laborioso y consume mucho tiempo. Si bien estos tipos de metodología proporcionan medios altamente sensibles para la detección de la degradación de proteínas, que no son adecuados para el análisis rápido de la degradación de proteína o Prueba de detección a gran escalang para mutaciones que impiden la degradación de proteínas. Aquí, se presenta un ensayo basado en un crecimiento de la levadura para la rápida identificación de los requisitos genéticos para la degradación de las proteínas inestables. En el método basado en el crecimiento de la levadura para el análisis de la degradación de proteínas, una proteína inestable de interés (o señal de degradación) se fusiona, en marco, a una proteína que se requiere para el crecimiento de la levadura bajo circunstancias específicas. El resultado es un sustrato artificial que puede servir como una herramienta de gran alcance para determinar los requisitos genéticos de degradación de las proteínas de la proteína inestable de interés. Convenientemente, las cepas de levadura de laboratorio más comúnmente utilizados albergan un panel de mutaciones en genes que codifican enzimas metabólicas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos particulares o bases nitrogenadas (por ejemplo, 20,28-30). Estas enzimas son esenciales para la proliferación celular en ausencia de proporcionadas exógenamente metabolitos en cuya síntesis las enzimas participan. Talenzimas metabólicas pueden así funcionar como reporteros basadas en el crecimiento de la degradación de las proteínas inestables a las que se fusionan. Los requisitos genéticos para la degradación de la proteína pueden ser dilucidado fácilmente, ya que las mutaciones que impiden la proteolisis se permitir que las células que albergan el reportero de la degradación crezcan bajo condiciones selectivas. Una ventaja de crecimiento es una indicación indirecta de que una mutación particular aumenta la abundancia de la proteína de interés. Sin embargo, se requiere un análisis bioquímico directo a confirmar que una mutación permite el crecimiento mediante el aumento de los niveles de proteína en lugar de a través de las causas indirectas o artefactos. El efecto de una mutación en la abundancia de proteínas puede ser confirmado por Western blot de los niveles de proteína en estado de equilibrio en las células que hacen y no albergan la mutación particular. Un método para la extracción rápida y eficiente de las proteínas de levadura (incubación secuencial de células de levadura con hidróxido de sodio y tampón de muestra) en una forma adecuadapara el análisis por transferencia de Western también se presenta 31. En conjunto, estos experimentos facilitar la rápida identificación de los reguladores candidatos de la degradación de proteínas.

<table><tbody><tr><td>Cepas de levadura deseadas, plásmidos, medio estándar y componentes</td><td></td><td></td> tampón <td>Las cepas de levadura con las mutaciones deseadas pueden generarse en el laboratorio del investigador. La levadura de tipo salvaje y una variedad de mutantes también están disponibles comercialmente ( ejemplo de GE Healthcare). Los plásmidos que codifican proteínas de fusión pueden generarse en el laboratorio del investigador.</td></tr><tr><td>3-amino-1H-1,2,4-triazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Inhibidor competitivo de la enzima His3. Se puede incluir en el ensayo de medio para aumentar la rigurosidad del crecimiento utilizando construcciones reporteras His3.</td></tr><tr><td>Endoglicosidasa H (forma recombinante de Streptomyces plicatus)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>Puede utilizarse para evaluar la N-glicosilación de proteínas; compatible con las concentraciones de SDS y beta-mercaptoetanol encontradas en 1x tampón de muestra Laemmli.</td></tr><tr><td>Tubos de vidrio de borosilicato desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Disponible en una variedad de fabricantes</td></tr><tr><td>Incubadora con regulación de temperatura (p. ej. Incubadora Heratherm modelo IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Disponible en una variedad de fabricantes</td></tr><tr><td>New Brunswick Tambor intercambiable para tubos de 18 mm (rodillo de tubo)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Se recomienda el rodillo de tubo para mantener durante la noche los cultivos iniciadores de levadura de células de levadura en suspensión. Se puede usar un agitador de plataforma o un rodillo de tubo para mantener cultivos más grandes en suspensión.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Tambor de rodillos 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Para uso con rodillo de tubo</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Espectrofotómetro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Disponible en una variedad de fabricantes Placas de</td></tr><tr><td>microprueba estériles de fondo plano de 96 pocillos con tapa envuelta individualmente</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Disponible en una variedad de fabricantes</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 y mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Disponible de una variedad de fabricantes &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Las pipetas monocanal y multicanal se utilizan en varias etapas del protocolo. Mientras que las pipetas multicanal reducen la carga de pipeteo en varios pasos, las pipetas monocanal se pueden utilizar en todo el protocolo. Disponible en una variedad de fabricantes.</td></tr><tr><td>Centrífuga 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>El rotor que se vende con unidad contiene tubos de microcentrífuga de 1,5 y 2,0 ml. El rotor se puede cambiar por uno que contenga tubos cónicos de 15 ml y 50 ml.</td></tr><tr><td>Sistema de imagen de placas (p. ej. Gel Doc XR+ System)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>Se puede utilizar una variedad de sistemas para obtener imágenes de placas, incluidos sofisticados sistemas de imagen, escáneres de computadora y teléfonos con cámara.</td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo F-35-6-30 con tapa y adaptadores para centrífuga modelo 5430/R, 15/50 ml Tubos cónicos, 6 plazas</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubo de tapón de rosca serigrafiado 17 x 20 mm cónico, polipropileno</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Disponible en una variedad de fabricantes</td></tr><tr><td>Tubo flexible de 1,5 ml, PCR limpio, Tubos de microcentrífuga natural</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Disponible en una variedad de fabricantes</td></tr><tr><td>Calentador analógico Dri-Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>El baño de agua hirviendo con placa caliente también se puede usar para desnaturalizar proteínas</td></tr><tr><td>SDS-PAGE aparatos de funcionamiento y transferencia, fuentes de alimentación y equipos de imágenes o cuartos oscuros para SDS-PAGE y transferencia a membrana</td><td></td><td></td><td>Variará según el laboratorio y la aplicación</td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de imágenes Western blot (p. ej. escáner Li-Cor Odyssey CLx y software Image Studio)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Variará según el laboratorio y la aplicación</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon Membranas de transferencia de PVDF</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Variará según el laboratorio y la aplicación</td></tr><tr><td>Anticuerpos primarios (p. ej. Fosfoglicerato quinasa (Pgk1) Anticuerpo monoclonal, ratón (clon 22C5D8))Life</td> <td>Technologies</td><td>459250</td><td>Variará según el laboratorio y la aplicación</td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios (p. ej. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Variará según el laboratorio y la aplicación</td></tr></tbody></table>

determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de requisitos genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

La degradación de proteínas regulado es crucial para prácticamente todas las funciones celulares. Gran parte de lo que se conoce acerca de los mecanismos moleculares y los requisitos genéticos para la degradación de proteínas eucariotas se estableció inicialmente en Saccharomyces cerevisiae. Los análisis clásicos de la degradación de proteínas se han basado en pulso-caza y cicloheximida-caza metodologías bioquímicas. Aunque estas técnicas proporcionan medios sensibles para la observación de la degradación de proteínas, que son laboriosos, consumen mucho tiempo, y de bajo rendimiento. Estos enfoques no son susceptibles de cribado rápido o a gran escala para las mutaciones que impiden la degradación de proteínas. Aquí, se describe un ensayo basado en el crecimiento de la levadura para la identificación fácil de los requisitos genéticos para la degradación de la proteína. En este ensayo, una enzima reportero requerido para el crecimiento bajo condiciones selectivas específicas se fusiona a una proteína inestable. Las células que carecen de la enzima reportero endógena pero que expresan la proteína de fusión puede crecer bajo selecondiciones ctive sólo cuando se estabiliza la proteína de fusión (es decir, cuando se ve comprometida la degradación de proteínas). En el ensayo de crecimiento descrito aquí, diluciones en serie de tipo salvaje y células de levadura mutantes que albergan un plásmido que codifica una proteína de fusión se manchan sobre medio selectivo y no selectivo. Crecimiento en condiciones selectivas es consistente con la degradación de deterioro por una mutación dada. El aumento de la abundancia de proteínas debe ser confirmada bioquímicamente. Un método para la rápida extracción de proteínas de levadura en una forma adecuada para la electroforesis y transferencia Western también se demuestra. Una lectura basada en el crecimiento para la estabilidad de la proteína, combinado con un protocolo sencillo para la extracción de proteína para el análisis bioquímico, facilita la rápida identificación de los requisitos genéticos para la degradación de la proteína. Estas técnicas se pueden adaptar para controlar la degradación de una variedad de proteínas de vida corta. En el ejemplo presentado, la enzima His3, que se requiere para la biosíntesis de histidina, se fusionóa Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 está destinada a la degradación después de que encaje de forma aberrante translocón retículo endoplásmico. Las células que albergan Deg1 -Sec62-His3 fueron capaces de crecer en condiciones selectivas cuando se estabilizó la proteína.

Para ilustrar esta metodología, la enzima His3 se ha fusionado con el extremo carboxi-terminal del modelo de retículo endoplásmico (ER) la degradación -Associated (ERAD) sustrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) para crear Deg1 -Sec62-His3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 representa uno de los fundadores de una nueva clase de sustratos ERAD que están dirigidos siguiente persistente, asociación aberrante con la translocon, el canal de los principales responsables de las proteí...

Este artículo describe un ensayo basado en el crecimiento de levaduras para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. También demuestra un método para la extracción rápida de proteínas de levadura, adecuado para la transferencia de Western para confirmar bioquímicamente los requisitos de degradación. Estas técnicas se pueden adaptar para monitorear la degradación de una variedad de proteínas.

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar rápidamente los requisitos genéticos para la degradación de una proteína inestable en Croce Visier. Esto se logra mediante la fusión de una enzima reportera necesaria para el crecimiento en condiciones selectivas específicas con una proteína inestable de interés. A continuación, las células de tipo salvaje o mutantes, ambas expresando la proteína de fusión, se cultivan en placas de agar medio selectivo.El ensayo de siembra proporciona un indicador conveniente de la estabilización de proteínas sobre la base del crecimiento de células de levadura para confirmar bioquímicamente las diferencias en la abundancia de proteínas, mientras que el tipo de células mutantes que albergan la proteína de fusión se lisa a través de un método de extracción de proteínas rápido e ineficiente para el análisis de Western blot. Los resultados muestran que la abundancia de una proteína inestable aumenta en las células con una mutación en un gen necesario para la degradación. Lo contrario es cierto para las cepas de tipo salvaje competentes para la degradación.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los análisis de persecución de pulsos y de persecución de ciclos, es que requiere menos mano de obra y menos tiempo, lo que permite la determinación rápida y de alto rendimiento de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre los requisitos de degradación para una variedad de proteínas inestables. También se puede utilizar para identificar reguladores de otros aspectos de la expresión génica, como la transcripción y la traducción.Los encargados de demostrar los procedimientos estarán a cargo de Sheldon Watts y Justin Crowder. Los estudiantes de mi laboratorio antes del ensayo transforman un plásmido que codifica una proteína de fusión que consta de una proteína inestable y una enzima reportera metabólica en una cepa de levadura mutante. Se sospecha que tiene defectos genéticos relacionados con la regulación de la degradación de proteínas como control, también transforma el mismo plásmido en una cepa de levadura de tipo salvaje.Inocular los transformantes en cinco mililitros de medio mínimo que seleccione para las células, albergando las moléculas de plásmido. Coloque el tubo de ensayo en un rotador inclinado e incube durante la noche a 30 grados centígrados al día siguiente. Mida la densidad óptica de los cultivos nocturnos y, a continuación, iguale la concentración celular de todas las células diluyendo cada cultivo hasta un diámetro exterior de 600 de 0,2 con medios frescos y tubos de centrífuga individuales estériles de 1,5 mililitros.Para comenzar el ensayo principal, configure una matriz de serie de dilución séxtuple transfiriendo primero 200 microlitros de cada cepa prediluida, a partir de un DE 600 de 0,2 a pocillos designados en la primera columna de una placa estéril de 96 pocillos en preparación para diluciones posteriores, utilice una pipeta multicanal para agregar 125 microlitros de agua estéril a los pocillos vacíos en las columnas dos, tres, y cuatro. A continuación, transfiera 25 microlitros de levadura de la columna uno a la columna dos, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar las células de manera uniforme y proceda a transferir 25 microlitros de células de la columna dos a la columna tres. Repita los pasos de dilución en serie hasta que los pocillos de la columna cuatro estén bien mezclados como ayuda visual para la detección de células.Imprima una plantilla de rejilla y péguela con cinta adhesiva en el interior de la tapa de una placa de Petri, comenzando con la columna menos concentrada en la matriz de dilución en serie. Transfiera cuatro microlitros de células de cada columna. En la placa de 96 pocillos en una placa de agar medio mínimo de control que selecciona para el mantenimiento del plásmido intracelular Detecte otros cuatro microlitros de células de cada columna en una placa de agar medio mínima separada que selecciona ambos plásmidos intracelulares.Mantenimiento y expresión de la proteína de fusión inestable. Deje que ambos platos se sequen en el banco durante cinco a 10 minutos. Selle las tapas con param para evitar la deshidratación e incube las células a 30 grados centígrados durante dos a seis días.Cuando las colonias del cultivo de más rápido crecimiento se hagan visibles por primera vez en el punto más diluido de una placa determinada, retire la placa de la incubadora y documente el grado de crecimiento. Al tomar fotografías, puede ser necesario tomar fotografías de diferentes placas en diferentes días o de la misma placa en varios días. En el caso de diferentes cepas de levadura que exhiben un amplio rango de tasas de crecimiento, se ha confirmado bioquímicamente que un gen identificado en el ensayo de crecimiento regula la abundancia de proteínas, se comienza por transformar las cepas de levadura de tipo salvaje y mutante con un plásmido que codifica la proteína de fusión antes mencionada, se inoculan los transformantes en cinco mililitros de medio mínimo que selecciona para el mantenimiento del plásmido intracelular y se incuban los tubos durante la noche en un rotador inclinado a 30 grados centígrados.Al día siguiente, mida la densidad óptica a 600 de cada cultivo durante la noche. Una vez que todas las cepas hayan alcanzado un OD 600 de 0,4 o más, diluya todos los cultivos hasta 0,2 con medio fresco de modo que el volumen final de cada cepa sea de 10 mililitros. Incubar las células en una plataforma agitadora a 30 grados centígrados hasta que todos los cultivos alcancen un crecimiento de fase logarítmica media OD 600, entre 0,8 y 1,2.Recoja una célula transfiriendo un total de 2,5 unidades OD de células a un tubo cónico fresco de 15 mililitros. Centrifugar las células a temperatura ambiente durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante S. A continuación, añada un mililitro de agua destilada, vórtice o pipeta hacia arriba y hacia abajo para resuspender el paladar y transferir la suspensión celular a un tubo fresco de 1,5 mililitros.Aislar las células con la segunda centrifugación durante 30 segundos A temperatura ambiente, retirar el snat y resuspender las células en 100 microlitros de agua destilada. Añadir 100 microlitros de hidróxido de sodio 0,2 molar a la suspensión celular, pipetear hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para mezclar e incubar las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente para evitar la lisis celular prematura. No haga vórtices en las células.Aislar las células de nuevo con una tercera centrifugación durante 30 segundos. A temperatura ambiente, retire los sobrenadantes de las células y lide las células suspendiendo el pellet en 50 a 100 microlitros de un tampón de muestra de lamby, desnaturalice todas las proteínas incubando la suspensión a 95 grados centígrados durante cinco minutos, y luego enfríe el lisado de toda la célula en hielo durante cinco minutos. Para analizar la abundancia de proteínas propensas a la agregación, como las proteínas con varios segmentos transmembrana, determine empíricamente la incubación, la temperatura y el tiempo óptimos de desnaturalización comenzando a 70 grados Celsius durante 10 minutos en lugar de 95 grados Celsius durante cinco minutos.Finalmente, aísle la fracción soluble centrifugando el lisado durante un minuto a temperatura ambiente, transfiera el snat a un tubo nuevo y deseche la fracción de pellets insoluble. La fracción soluble ahora puede cargarse directamente en una página SDS, gel o almacenarse a menos 20 grados Celsius en la configuración de un ensayo de degradación de proteínas basado en el crecimiento de levaduras. Una proteína de triple fusión inestable se fusiona con una enzima metabólica adicional que complementa el fondo de la cepa de levadura que carece del mismo gen metabólico.Cuando la proteína de fusión se expresa en levadura, es propensa a eventos de translocación estériles en la membrana del retículo endoplásmico. Esta translocación aberrante desencadena la degradación mediada por ubiquitina de toda la proteína, incluida la enzima metabólica, evitando así la proliferación celular. Sin embargo, en las cepas de levadura que carecen de la ubiquitina ligasa, la proteína de fusión está protegida de la degradación, incluso en la translocación promedio, lo que permite que las células proliferen.Por lo tanto, en presencia de ubiquitina ligasa, existe una correspondencia entre la degradación de proteínas que ocurre dentro de las células y la incapacidad de las células de levadura para proliferar en placas de agar empobrecidas en metabolitos. Por otro lado, en el contexto de una ubiquitina ligasa, la proliferación celular indica que la proteína de fusión se protegió de la degradación para reducir el crecimiento de fondo o espurio y aumentar la rigurosidad de este ensayo. Se pueden agregar inhibidores competitivos de la enzima metabólica al medio de crecimiento para confirmar los resultados observados en el ensayo de crecimiento de levaduras.La evidencia directa de la degradación de la proteína de fusión también se puede determinar con un Western blot. En presencia o ausencia de ubiquitina ligasa, la proteína de fusión se degradará o se salvará de la destrucción, respectivamente. Es importante recordar que estos procedimientos informan más directamente sobre la abundancia en estado estacionario de la proteína de interés.Una vez que se han llevado a cabo estos procedimientos, se pueden realizar análisis de pulso o de persecución de cicloheximida para analizar directamente la cinética de degradación de proteínas y la presencia de mutaciones que aumentan los niveles de proteínas en el estado de estudio.

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Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal

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