Name: El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de Cryptococcus neoformans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprende a estudiar el papel del colesterol en la fagocitosis de Cryptococcus neoformans por macrófagos mediante agotamiento de esteroles y microscopía. Este protocolo permite analizar infecciones fúngicas in vitro.

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Este trabajo fue apoyado por becas del NIH AI56168, AI71142, AI87541 y AI100631 de MDP. Maurizio Del Poeta es Burroughs Wellcome Investigador en Enfermedades Infecciosas.

1. El colesterol agotamiento de las células J774A.1 con MβCD <ol><li> En una cabina de bioseguridad estéril, de semillas 10 5 J774A.1 células de tipo macrófago por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos en 200 l de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 O / N. </li><li> Retire el medio de la monocapa de células y se lavan las células dos veces con fosfato 1x solución salina tamponada (PBS) que ha sido filtrada o tratada en autoclave. </li><li> Añadir 200 l de solución de MβCD a la concentración deseada (10 mM o 30 mM en PBS) o 1x PBS como control y se incuba durante 30 min a 37 ° C con agitación. Eliminar el sobrenadante y reserva a RT para el análisis cuantitativo con el kit comercialmente disponible inmediatamente después del procedimiento. </li><li> Lavar las células dos o tres veces con PBS 1x o DMEM sin suero y continuar con infección o lisar células por pipetting de dos a tres veces con H2O desionizada para el análisis con cromatografía de capa fina o con un kit. NOTA: Tras el agotamiento de colesterol un kit de cuantificación de colesterol disponible comercialmente se puede utilizar. Vea la sección de materiales para los detalles. Siga las instrucciones del fabricante como está escrito. </li></ol> 2. Observación de colesterol contenido cromatografía en capa fina (TLC) <ol><li> Lavar un tanque de TLC dos veces con acetona y una vez con una solución de éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 en volumen). Saturar el tanque con el éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 en volumen) solución y dejar O / N. NOTA: Orgánica disolventes siempre se deben utilizar bajo una campana de humos para evitar la inhalación de los vapores. Guantes y bata de laboratorio deben ser usados ​​en todo momento. El ácido acético es un ácido fuerte y se debe utilizar con precaución. </li><li> En un gabinete de bioseguridad estéril, semillas 10 6 J774A.1 como los macrófagos-células por pocillo en un ce 6 pocillosll placa de cultivo en un volumen de 5 ml de DMEM caliente suplementado con 10% de FBS y 1% P / S. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. </li><li> Agotan los macrófagos de colesterol siguiendo los pasos 1.2 a 1.4, sustituyendo 1 ml para 200 l en su caso para tener en cuenta el tamaño bien grande. </li><li> Añadir 500 l de Tripsina-EDTA a cada pocillo, se incuba durante 3 min a 37 ° C, y raspar suavemente las células con un raspador de células. </li><li> Transferir a un tubo de microcentrífuga y añadir un adicional de 500 l de DMEM caliente suplementado con 10% de FBS y 1% P / S. </li><li> Girar las células durante 5 min a 300 xg y eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir un adicional de 500 l de DMEM caliente suplementado con 10% de FBS y 1% P / S al sedimento celular y resuspender cuidadosamente por pipeteando arriba y abajo. </li><li> Retire 10 l de células y contar las células en un hemocitómetro. Normalizar las concentraciones de células de cada muestra y añadir un número igual de células a tubos de vidrio. NOTA: En este paso, se puedeelegir combinar las células de los mismos grupos de tratamiento para obtener un extracto final de lípidos más concentrada. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y eliminar los medios de comunicación. </li><li> Añadir 2 ml de metanol y vórtice. A continuación, añadir 1 ml de cloroformo y agitar. Compruebe el estado de fase para asegurarse de que la solución en monofásico. NOTA: Los tubos se puede almacenar a 4 ° CO / N. </li><li> Centrifugar a 1700 xg durante 10 min a TA y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo </li><li> Añadir un adicional de 1 ml de cloroformo, seguido de 1 ml de dH 2 O. Vortex dos veces durante 30 segundos. Centrifugar a 1700 xg durante 5 min a TA. </li><li> Pesar un tubo de vidrio en un equilibrio sensible y utilizar una pipeta Pasteur de vidrio para transferir la fase inferior en el tubo de vidrio de peso conocido. </li><li> Seque los lípidos en un evaporador centrífugo hasta que se seque (aproximadamente 2 horas). Pesar tubo con lípidos secos y calcular el peso de lípido seco. NOTA: los lípidos secos se puede almacenar en -20 ° C hasta que esté listo para realizar TLC. </li><li> Diluir lípidos secos en suficiente cloroformo para normalizar la concentración de lípido (normalmente 20 - 50 l) y la carga de 20 l de la lípido diluido en una placa de TLC de sílice. Cargar 20 g de colesterol diluido en 20 l de cloroformo como un estándar. </li><li> Añadir placa de TLC se secó al tanque de TLC saturado y permitir disolvente para migrar hasta 1 cm antes de borde de la placa. Retire la placa de TLC en el tanque y deje que se seque unos 5 min. </li><li> Visualice los lípidos mediante la colocación de un tanque de vapor de yodo para comprobar la migración. Retirar y permiten manchas a desaparecer durante unos 10-15 min bajo el capó. NOTA: El yodo es un riesgo de inhalación. Utilice siempre bajo una campana de humos. </li><li> Preparar una solución para la tinción de lípidos neutros mediante la combinación de 60 ml de metanol con 60 ml de H2O desionizada, 4 ml de ácido sulfúrico, y 630 mg de cloruro de manganeso. </li><li> Con cuidado y lentamente sumergir la placa de TLC en la solución de tinción de lípidos neutros en una bandeja y quitar sin desprendimiento de la l de síliceayer. NOTA: La solución de tinción lípido neutro puede ser reutilizado varias veces y por lo que puede ser recuperada de la bandeja y se coloca de nuevo en una botella para su uso posterior. </li><li> Deje que la placa se seque bajo el capó a TA hasta que todas las burbujas ha desaparecido. Calentar la placa de TLC en un conjunto de bloque de calor a 160 ° C y Char al color deseado. NOTA: Un programa de densitometría como Vision Works LS puede utilizarse para cuantificar las bandas carbonizados para comparar muestras de lípidos. </li></ol> 3. La infección de macrófagos con C. neoformans (H99) <ol><li> En una cabina de bioseguridad estéril, semilla de 10 células 5 macrófagos como por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos en 200 l de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% P / S. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2, 5% de CO 2 O / N. NOTA: La infección también se puede hacer de fondo de cristal platos confocal para formación de imágenes más fácil; todas las cantidades siguen siendo los mismos. </li><li> Cultivar una cultura de C. neoformans (H99)mediante la inoculación de 10 ml de YNB con una colonia obtenida a partir de una placa golpeado e incubando que O / N a 30 ° C con agitación. </li><li> Lave y contar C. neoformans células (H99). <ol><li> Centrífuga C. cultura neoformans O / N a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Retire el medio y desechar. Lavar las células con 5 ml de PBS 1x. Centrifugar a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Retirar PBS y se lava con 5 ml de PBS 1x filtrada. Centrifugar a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este paso 2 veces más. </li><li> Retirar PBS y resuspender en 5 ml de PBS 1x. </li><li> Hacer una dilución en serie en PBS para obtener una dilución 1: 500 de la cultura lavado. <ol><li> Añadir 100 l de la muestra original para 900 l de 1x PBS para obtener una dilución 1:10. </li><li> Añadir 100 l de muestra diluida 1:10 a 900 l de 1x PBS para obtener una dilución 1: 100. </li><li> Añadir 200 l de la 1: 100 muestra diluida a 800 l de PBS 1x para obtener un 1: diluti 500en </li></ol></li><li> Tomar 10 l de 1: 500 dilución y contar con hemocitómetro para calcular el número de células. </li></ol></li><li> Preparar la solución de trabajo para la activación de los macrófagos y opsonizantes C. neoformans. <ol><li> Diluir LPS y IFN 100x de soluciones madre añadiendo 10 l hasta 990 l. NOTA: LPS y IFN se utilizan para mejorar la absorción fagocítica pero no son necesarios para la fagocitosis. Si hay un interés en la actividad fungicida de los macrófagos, realizar la activación O / N a 37 ° C con agitación antes de la infección. </li><li> Por muestra combinar 7,5 l de LPS diluidos, 1,25 l de IFN diluido, 1,25 l de anticuerpo GXM y el volumen de la C. cultura neoformans que da 1,25 x 10 5 células. Llevar el volumen hasta 250 l multiplicado por el número de muestras con DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% P / S. </li><li> Vortex e incubar la solución durante 20 min a 37 ° C con agitación. NOTA:Agotamiento de colesterol (pasos 1.2 hasta 1.4) se puede hacer simultáneamente con la etapa de opsonización. Asegúrese de tratar los macrófagos antes de la combinación de la solución de trabajo, ya que las células opsonizadas óptimamente se deben utilizar no más de 20 minutos después de la incubación paso 3.4.3. </li></ol></li><li> Infectar a los macrófagos <ol><li> Macrófagos Lavar dos veces con DMEM libre de suero y añadir 200 l de opsonizado C. neoformans solución de trabajo a cada pocillo. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C. </li></ol></li><li> Fijar y teñir las células <ol><li> Retire el medio y lavar las células 2 veces con DMEM. </li><li> Aire seco en la monocapa de células durante 10 min y añadir 200 l de metanol enfriado con hielo para fijar las células. </li><li> Incubar durante 15 min a TA y eliminar cualquier metanol restante. </li><li> Añadir 200 l de 10x Giemsa y se incuba durante 5 min a TA. </li><li> Lave 2 - 3 veces con agua desionizada y se seca O / N con la gorra. NOTA: Imaging se puede hacer al día siguiente o hasta una semana followitinción ng. </li></ol></li><li> Visualizar y Conde <ol><li> Usando un microscopio, contar 300 células por punto de datos (si hay 2 de el mismo trato contar 150 por pocillo) y anote el número de macrófagos infectados y el número de células Cryptococcus envueltos. NOTA: Para garantizar incluso el muestreo por uso punto de datos 2 placas por condición, elija 3 áreas que no se solapan por placa y recuento de 50 células por área. </li><li> Calcular el índice fagocítico multiplicando el porcentaje de macrófagos infectados por el número medio de C. neoformans por macrófago. Normalizar índice fagocítico expresando los valores como porcentaje de la PBS 1x tratada control. Después de varios ensayos calcular el valor medio y la desviación estándar de la media para determinar las tendencias en el índice de fagocitosis. Utilice estudiante t-test para determinar la significación. </li><li> Tome micrografías de células en 1.000X o ampliación de 400X. </li></ol></li></ol> 4. Ensayo de azul de tripano <ol><li> En una cabina de bioseguridad estéril, las semillas 10 6 células de tipo macrófago por pocillo en una placa de cultivo celular de 6 pocillos en un volumen de 5 ml de medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina / estreptomicina . Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. </li><li> Agotan los macrófagos de colesterol siguiendo los pasos 1.2 a 1.4 sustituyendo 2 ml para 200 l en su caso para tener en cuenta el tamaño bien grande. NOTA: Asegúrese de incluir un control tratado con 1x PBS, así como un control que se raspa antes de cualquier tratamiento. </li><li> Añadir 500 l de 1x PBS a cada pocillo y raspar suavemente las células con un raspador de células. Traslado en un tubo de microcentrífuga y suspender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. </li><li> Retire 10 l de células y tinción con 1 l de 4% de azul de tripano. </li><li> Contar las células en un hemocitómetro y la viabilidad calcular utilizando la siguiente ecuación:% de viabilidad = [1 - (células azules / células totales)]x 100. Normalizar los valores al control que no fue tratada. Después de varios ensayos calcular el valor medio y la desviación estándar para determinar las tendencias en la viabilidad. Utilice estudiante t-test para determinar la significación. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

En el trabajo con este protocolo es importante para obtener recuentos de células precisos cuando chapado en células de mamíferos y opsonizantes C. células neoformans. Esto minimiza la variación entre los ensayos y asegura una precisa 1: 1 de destino para la proporción de efector durante todo el estudio. También es fundamental para coordinar la temporización de la depleción de colesterol y para prevenir la infección las células de levadura o células opsonizadas macrófagos tratados de reposo a temperatur...

La fagocitosis es un proceso por el cual las entidades extracelulares son internalizados por las células huésped. Es un arma clave en el arsenal del sistema inmune para defenderse contra agentes patógenos, pero el proceso a menudo puede ser subvertido por patógenos para permitir la internalización y la difusión a través del cuerpo 1. La fagocitosis está mediada por varios eventos de señalización que resultan en la unión y la inmersión a través de reordenamientos de citoesqueleto de la célula huésped. Fagocitos &quot;profesional&quot; son capaces de reconocer y unirse a opsoninas en la superficie del patógeno invasor a la señal para la unión y la formación de lamelipodios, que sobresalgan del patógeno y formar un fagosoma 2. Entre los llamados fagocitos &quot;profesionales&quot; son los macrófagos. Los macrófagos son células altamente especializadas que realizan funciones de protección que incluyen la búsqueda y eliminación de agentes causantes de enfermedades, la reparación de los tejidos dañados, y la mediación de la inflamación, la mayoría deéstos a través del proceso de la fagocitosis 1,2. Cryptococcus neoformans es una especie de levadura patógena que causa una enfermedad grave conocida como criptococosis. Cryptococcus esporas son inhaladas por el anfitrión y dan lugar a una infección pulmonar que suele ser asintomática. Se cree que la exposición es muy frecuente; una muestra de 61 niños de las Enfermedades Infecciosas Pediátricas Clínica en el Hospital Centro de Bronx-Lebanon encontró que todos los encuestados tenían anticuerpos contra el polisacárido glucuronoxylomanan criptocócica y otros estudios han demostrado la prevalencia tanto en el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) no infectado y adultos infectados 3, 4. Los macrófagos alveolares son la primera línea de la respuesta a la infección pulmonar y en la mayoría de los casos con éxito claro el patógeno. Sin embargo, en individuos inmunodeprimidos (pacientes por ejemplo, VIH y SIDA), la levadura es capaz de sobrevivir dentro de los macrófagos. En estosde los casos, los macrófagos pueden servir como un nicho para la replicación del patógeno y pueden facilitar su difusión en el sistema nervioso central (CNS), donde la enfermedad se vuelve mortal 5-8. Se cree que los macrófagos pueden incluso ofrecer la levadura directamente en las meninges, ayudando a la levadura para cruzar la barrera de sangre del cerebro a través del modelo &quot;caballo de Troya&quot; 3,9 - 11. Por lo tanto, es importante entender el proceso de fagocitosis y los factores que la afectan, especialmente en infecciones por criptococos. El trabajo previo en otros sistemas de patógenos apuntan a colesterol y lípidos balsas formadas por colesterol como teniendo un papel importante que desempeñar en la fagocitosis 12-15. El colesterol es la especie de lípidos más abundantes en las células de mamífero y comprende 25 - 50% de la membrana de células de mamíferos 16. Se ha encontrado a desempeñar un papel en la modulación de la BIOPpropiedades ÍSICA de membranas cambiando su rigidez 17. El colesterol y esfingolípidos juntos forman microdominios lipídicos dentro de la membrana conocida como balsas lipídicas. Se ha encontrado que las balsas de lípidos estar involucrado en la formación de caveolas, así como proporcionar un dominio aislado para ciertos tipos de señalización 16-18. Debido a su pequeño tamaño, es difícil de estudiar las balsas de lípidos in vivo. Una forma útil para estudiar el papel de las balsas lipídicas es alterar sus electores. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) es un compuesto que se ha encontrado para agotar el colesterol de las membranas de mamíferos y se utiliza comúnmente para estudiar el papel de las balsas de lípidos 18. En este protocolo, se presenta un método para agotar el colesterol de las membranas de la célula huésped y cuantificar el efecto de la disminución en la capacidad de las células huésped para fagocitar C. neoformans in vitro. Este procedimiento hace uso de cultivo celular techniqUES en un macrófago como línea celular inmortalizada (J774A.1) como un modelo para la infección. Agotamiento de colesterol se llevó a cabo por la exposición a MβCD, que tiene un núcleo hidrófobo específico para el tamaño de los esteroles y es capaz de actuar como un sumidero para el colesterol para dibujar hacia fuera de la membrana 19. Agotamiento de colesterol se midió cuantitativamente usando un kit disponible comercialmente y cualitativamente utilizando una extracción de lípidos Bligh-Dyer modificada seguido por cromatografía en capa fina (TLC) 20. . La fagocitosis se midió mediante la infección de la línea celular con un cultivo de levadura opsonizado mezclado con un cóctel de interferón-γ y lipopolisacárido para la activación de los macrófagos Cryptococcus se opsonizó utilizando un glucuronoxylomanan (GXM) de anticuerpos 21-23. Tinción y experimentos de microscopía permitido para la visualización de las células y el cálculo del índice de fagocitosis para evaluar el grado de fagocitosis. En conjunto, este protocolo dEscribes un método básico que integra la alteración de la composición de lípidos con un proceso fisiológico.

<table><tbody><tr><td>Gabinete de Bioseguridad Clase II tipo A2</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 línea celular</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Llega Congelado. Consulte las instrucciones de ATCC para el cultivo.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Tienda en 4 &deg; C y cálido a 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Mantener congelado a -20 ° C y descongele antes de agregar a DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U / ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Se utiliza para complementar DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Incubadora de cultivo celular</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Modelo # 3530</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de 96 pocillos</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Diluir a 1x y filtrar o esterilizar en autoclave antes de usar.</td></tr><tr><td>Metil-&beta;-ciclodextrina</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Se disuelve en 1x PBS para hacer soluciones de concentraciones de 10 mM y 30 mM</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td> Life <td>Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>Todos los reactivos para el ensayo de colesterol están contenidos en el kit. Siga las instrucciones del fabricante.</td></tr><tr><td>Placa de ensayo negra de 96 pocillos</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax Lector de microplacas</td><td>Molecular Devices Modelo</td><td></td><td>F5</td></tr><tr><td>Cámara TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Papel</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Cortado al tamaño necesario para el tanque TLC</td></tr><tr><td>Campana</td><td></td><td></td> extractora <td>Cualquier campana extractora que cumpla con las normas AIHA/ANSI</td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Modelo Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Mezclador Votex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Modelo # MS104S mide hasta 0,1 mg</td></tr><tr><td>Vidrio Pipeta Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Modelo # SPD2010</td></tr><tr><td>Éter de petróleo</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Gel de sílice 60 con zona de concentración</td><td>Cromatocrato analítico Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Chips de yodo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Utilice el software Vision Works LS para el análisis de densitometría</td></tr><tr><td>Plato confocal con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtenido del Centro Médico de la Universidad de Duke</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>Consulte al fabricante para obtener instrucciones de preparación. Utilice una concentración de glucosa de 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolisacárido</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Disolver en 1x PBS para hacer un caldo de 1 mg/ml. Almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Interferón gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Disolver en 1x PBS para hacer una solución madre de 0,1 mg/ml</td></tr><tr><td>Anticuerpo de glucuronoxilomanano (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Regalo de Arturo Casadevall's Lab la concentración es de 1,98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Disuelva 0,8 g de Giemsa en 25 ml de glicerol y caliente a 60 °C; C durante 1 hora. Añadir 25 ml de metanol a la solución y dejar envejecer a temperatura ambiente durante al menos 1 mes.</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Observer.Microscopio D1 con AxioCam MRm para la toma de</td><td></td> imágenes</tr></tbody></table>

el colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

La criptococosis es una infección potencialmente mortal causada por hongos patógenos del género Cryptococcus. La infección se produce después de la inhalación de las esporas, que son capaces de replicar en el pulmón profundo. La fagocitosis por los macrófagos de Cryptococcus es una de las formas en que la enfermedad es capaz de propagarse en el sistema nervioso central para causar meningoencefalitis letal. Por lo tanto, el estudio de la asociación entre Cryptococcus y macrófagos es importante para entender la progresión de la infección. El presente estudio describe un protocolo de paso a paso para estudiar la infectividad de macrófagos por C. neoformans in vitro. El uso de este protocolo, se estudia el papel de los esteroles de acogida en las interacciones huésped-patógeno. Diferentes concentraciones de metil - ciclodextrina (MCD) se utilizaron para suprimir el colesterol de murino sarcoma retículo-macrófago línea celular J774A.1. El agotamiento de colesterol se confirmó y cuantificó usando tanto un dis comercialmentekit de cuantificación de colesterol e y cromatografía en capa fina. Células de colesterol empobrecido se activaron usando lipopolisacárido (LPS) y el interferón gamma (IFN) y se infectaron con Cryptococcus neoformans anticuerpos opsonizado de tipo salvaje células H99 en una relación de efector a diana de 1: 1. Las células infectadas fueron monitorizados después de 2 h de incubación con C. se calculó neoformans y su índice de fagocitosis. Agotamiento de colesterol dio lugar a una reducción significativa en el índice de fagocitosis. Los protocolos presentados ofrecen un método conveniente para imitar la iniciación del proceso de infección en un entorno de laboratorio y estudiar el papel de la composición de lípidos de acogida sobre la infectividad.

El agotamiento Colesterol Análisis del sobrenadante reservado en el paso 1.3 del protocolo, siguiendo las instrucciones del fabricante en el kit de ensayo de colesterol de Amplex Red produce una concentración elevada de colesterol en la muestra MβCD tratado en comparación con el control PBS 1x. Dependiendo del tipo de célula y el agotamiento de colesterol concentración MβCD utilizado puede variar. Para J774 tratados con 10 mM MβCD, se observó una disminución de aproximadamente el 50%. El agotam...

En este artículo, se describe un protocolo para la infección de macrófagos con Cryptococcus neoformans. Además, se explica un método para la depleción de esteroles de los macrófagos. Estos protocolos proporcionan una guía para estudiar las infecciones fúngicas in vitro y examinar el papel de los esteroles en dichas infecciones.

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

El objetivo general de este procedimiento es esclarecer el papel del colesterol en la captación de cryptococcus neoformans por los macrófagos. Esto se logra primero agotando el colesterol de una línea celular de macrófagos murinos mediante el uso de metil beta ciclodextrina. A continuación, el agotamiento de colesterol se confirma y cuantifica utilizando cromatografía en capa fina y un kit comercialmente disponible.Luego, las células de *Cryptococcus neoformans* se ionizan con anticuerpos específicos contra la gluc, xlo manina o el componente GXMA de la cápsula de *Cryptococcus*. Finalmente, los macrófagos desprovistos de colesterol se infectan con *Cryptococcus neoformans* opsonizado. En última instancia, se utilizan microscopía de gemas sostenidas y microscopía ligera para visualizar las células infectadas y permitir el cálculo del grado de fagocitosis.Las principales ventajas de esta técnica son que puede realizarse con equipos de laboratorio básicos en un tiempo relativamente corto y aún así obtener resultados cuantitativos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patogénesis fúngica. Por ejemplo, ¿cuál es el papel de los injertos lipídicos del hu

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Los macrófagos juegan un papel central en la homeostasis y la patología en muchos tejidos. El protocolo presentado aquí se describen métodos para agotar los...

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

En este video, demostramos un ensayo de citotoxicidad para evaluar la infección por Cryptococcus neoformans, un hongo patógeno, en macrófagos. La citotoxicidad está determinada por la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa citoplasmática debido a la lisis de macrófagos causada por la infección por Cryptococcus neoformans.

Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa para detectar la infección por Cryptococcus neoformans en macrófagos

Este video muestra un método para evaluar el impacto de la aspirina y el ibuprofeno, en sus concentraciones inhibitorias mínimas, sobre la fagocitosis de los macrófagos utilizando células fúngicas teñidas con colorante fluorescente sensibles al pH. Los fármacos inhiben la ciclooxigenasa-2, disminuyendo la formación de prostaglandinas y potenciando la fagocitosis de los macrófagos, como se observó a través de las mediciones de fluorescencia del colorante sensible al pH.

El efecto de la aspirina y el ibuprofeno en la capacidad fagocítica de los macrófagos

Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células...

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Un método para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratón para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados por microscopía confocal.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

Se describe cómo visualizar macrófagos C. neoformans (Cn) interacciones en tiempo real, con especial énfasis en el proceso de exocitosis no lítico usando microscopía de luz digital. Usando esta técnica de forma individual los macrófagos infectados se puede estudiar para determinar varios aspectos de este fenómeno.

La visualización no lítico exocitosis de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando microscopía de luz digital

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

Se presenta un protocolo para el cultivo celular de macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El protocolo utiliza la criopreservación de monocitos junto con su diferenciación masiva en macrófagos. Luego, los macrófagos cosechados se pueden sembrar en pozos de cultivo a las densidades celulares requeridas para llevar a cabo experimentos.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

Describimos un método para medir la velocidad de los fagosomas que se mueven hacia el centro celular en células vivas infectadas con o sin el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1, utilizando microscopía de fluorescencia confocal de disco giratorio para identificar células infectadas fluorescentes y microscopía de campo claro para detectar fagosomas.

Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1

Los lípidos se sabe que juegan un papel importante en las funciones celulares. A continuación, describimos un método para determinar la composición lipídica de los neutrófilos, con énfasis en el nivel de colesterol, mediante el uso de ambos HPTLC y HPLC para obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de la formación trampa extracelular de neutrófilos.

Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas

Aquí se presenta un protocolo para cuantificar y producir imágenes dinámicas de la regulación mediada por células madre mesenquimales (MSC) de la fagocitosis de macrófagos (MΦ) de partículas de levadura no opsonizada (zymosan) que se conjugan con una molécula fluorescente sensible al pH.

Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

Aprende a estudiar el papel del colesterol en la fagocitosis de Cryptococcus neoformans por macrófagos mediante agotamiento de esteroles y microscopía. Este protocolo permite analizar infecciones fúngicas in vitro.

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de

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