Name: Transposón mediada Integración de ADN plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende a inducir glioblastomas en ratones recién nacidos mediante integración de transposones en la zona subventricular. Este método permite monitorizar la progresión tumoral con bioluminescencia y analizar mutaciones genéticas específicas.

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Agradecemos al Dr. John Ohlfest y a la Dra. Stacey Decker13 por el generoso regalo de plásmidos y por la formación proporcionada para dominar este método. Agradecemos a Marta Dzaman por su ayuda en la estandarización del procedimiento de tinción con hematoxilina-eosina de secciones incluidas en parafina. También agradecemos a Molly Dahlgren por leer detenidamente este manuscrito y proporcionar sugerencias útiles. Este trabajo cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH/NINDS a MGC y PRL, la subvención de la Fundación Leah's Happy Hearts a MCG y PRL. Premio al Investigador Joven de la Fundación Alex's Lemonade y la Beca de la Fundación St. Baldrick's para CK.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, te detallamos un método versátil y reproducible para la generación de nuevos modelos de GBM mediante la integración SB transposase- mediada de ADN plásmido oncogénica en células que rodean la zona subventricular de ratones recién nacidos. Se presenta un protocolo para generar plásmidos transposón con nuevos genes de interés, ilustramos cómo monitorizar la progresión de los tumores en los animales vivos, y cómo caracterizar rasgos histopatológicos y inmunohistoquímicos de estos tumores. <p class="jo...

El glioblastoma multiforme (GBM) es el (60%) tumor cerebral primario más común en adultos, con una supervivencia media de 15-21 meses cuando fueron tratados con cirugía, radioterapia, y quimioterapia 1. Terapias novedosas para GBM son imprescindibles. Las terapias experimentales requieren pruebas en modelos animales que reproducen adecuadamente las características más destacadas de la enfermedad humana. Estrategias para inducir GBM en roedores incluyen mutagénesis química con agentes alquilantes, línea germinal o alteraciones genéticas somáticas, o el trasplante usando líneas celulares de glioma 2. Los modelos más utilizados emplean la implantación de líneas celulares de glioma, ya sea ortotópicamente, en el cerebro o por vía subcutánea utilizando células singénicas en animales con idéntico genotipo; o células xenogénicas, líneas más comúnmente humanos de células GBM, implantados en ratones inmunes comprometidos 3. Los xenoinjertos ofrecen muchas ventajas para el estudio de tumores intracraneales: conveniencia de la reproducibilidad, standatasas de crecimiento rdized, momento de la muerte y el tumor de localización. Sin embargo, estos modelos tienen limitaciones debido al abordaje quirúrgico artificial, invasivo utilizado para implantaciones y capacidad limitada para reproducir con precisión histológica rasgos característicos de GBM humana (OMS grado IV): necrosis pseudo-pallisading, atipias nucleares, invasión difusa, la proliferación de micro-vascular y la formación de anomalías vascular glomeruloide 4-7. La inducción de GBM por alterar el genoma de las células somáticas con ADN oncogénico, ya sea con vectores virales 8-12, o con la integración mediada por transposón 13, reproduce más estrechamente la etiología de la enfermedad humana y recapitula características histopatológicos de GBM humano. Históricamente, los tumores del SNC han sido clasificados sobre la base de la célula de origen percibida, que se observó, sería un factor predictivo para la supervivencia 14. GBMs se clasifican en primaria y secundaria. Emergentes tod pruebasay apunta a la naturaleza altamente heterogéneo de glioblastoma primaria 15. GBM secundaria (15%), el resultado de la transformación maligna de los astrocitomas de grado bajo (OMS grado I) y astrocitomas anaplásicos (OMS grado II), están asociados con la aparición temprana de la enfermedad, mejor pronóstico y un patrón de &quot;proneural&quot; de la expresión génica , mientras que GBM primaria (85%) muestran una aparición tardía, mal pronóstico y glial (clásica), neural o patrones de expresión mesenquimales. Si estos patrones de expresión génica se correlacionan con la célula real de origen del tumor todavía se está investigando activamente. La acumulación de los datos muestra que la combinación de mutaciones genéticas asociadas con GBMs son predictivo para la supervivencia. Por ejemplo, la pérdida de heterocigosidad (LOH) de los cromosomas 1p / 19q, mutaciones IDH1, PDGFRa amplificaciones, están asociados con GBMs secundarias, patrón de expresión proneural y mejor pronóstico, mientras que la sobreexpresión de EGFR, Notch y activación de la vía hedgehog sonic, Nf1 y PTEN pérdida y las mutaciones de p53 se correlacionan con los nervios, clásica, o GBM primaria mesenquimales y peor pronóstico 16,17. El advenimiento de los grandes proyectos de secuenciación de escala y la acumulación de numerosas muestras de pacientes disponibles para la prueba trae una gran cantidad de nueva información con respecto a las mutaciones genéticas y las vías implicadas en GBM patogenia y la progresión y la posibilidad de la medicina individualizada, donde las terapias pueden ser adaptados específicamente a las anomalías genéticas del paciente. En última instancia, para evaluar el valor predictivo de estas mutaciones y las vías de manera sistemática, y para probar posibles tratamientos en cada caso, requiere modelos animales de GBM con alteraciones genéticas predeterminados. Transposón de integración mediada de ADN genómico ofrece un enfoque viable. El sistema transposón Bella Durmiente, miembro de la / clase mariner Tc1 de transposones, se &quot;despierta&quot; (construido) en un proce múltiples pasosss de mutagénesis específica de sitio de un gen de transposasa salmónidos, que se convirtió en estado latente hace más de 10 millones años 18,19. En esencia, transposones de ADN flanqueados por secuencias específicas (repeticiones invertidas / repeticiones directas: IR / DR) se pueden integrar en el genoma de una manera de &quot;cortar y pegar&quot; por medio de la actividad de la transposasa Bella Durmiente. La transposasa reconoce los extremos de los sitios de IR, escinde el transposón y la integra aleatoriamente en otro sitio de ADN entre las bases T y A, bases que se duplican en cada extremo del transposón durante la transposición (Figura 1a). La transposasa Bella Durmiente se compone de tres dominios, un dominio de unión transposón, una secuencia de localización nuclear y un dominio catalítico. Se requieren cuatro moléculas de transposasa para llevar a los dos extremos del transposón juntos y permitir la transposición, sin embargo, si demasiadas moléculas de transposasa están presentes, pueden dimerizar y tetramerizarse para inhibirla reacción de transposición 20. Una reacción de transposición eficiente requiere una relación óptima de transposasa de transposones. El ADN que codifica la transposasa puede ser entregado en el mismo plásmido con el transposón (en cis) o en un plásmido diferente (en trans). Para asegurar la relación óptima entre la transposasa y los transposones, un promotor con una actividad adecuada puede ser elegido para la expresión de la transposasa (para el modelo &quot;cis&quot;) o la proporción de los plásmidos en la solución de inyección pueden ser optimizados (para el modelo &quot;trans&quot;). El sistema transposón Bella Durmiente puede ser utilizado con éxito para la genómica funcional, mutagénesis de inserción, la transgénesis y la terapia génica somática 21. Al ser una construcción sintética re-ingeniería a una molécula funcional de una variante salmonoides latente, la transposasa Bella Durmiente no se une a otros transposones en seres humanos u otros mamíferos 20. Desde su descubrimiento, la ingeniería molecular tiene enhanced la eficacia transposición del sistema de transposón SB a través de cambios en las secuencias de IR y adición de dinucleótidos TATA que flanquea el transposón, resultando en los transposones pT2. Estos transposones han optimizado la unión de la SB para el sitio de infrarrojos y una mayor eficacia de la escisión. La transposasa SB también se sometió a una mejora significativa; la transposasa utilizado en los experimentos presentados en el presente documento es el SB100X, una transposasa hiperactiva generado por una estrategia de barajado de ADN seguido por una pantalla genética a gran escala en células de mamíferos 22. En este informe se presenta un método rápido, versátil y reproducible para inducir GBM intrínseca en ratones con la integración no viral, transposón mediada de ADN plásmido en células de la zona sub-ventricular de ratones recién nacidos 23. Presentamos una manera simple de crear transposones con nuevos genes susceptibles para la integración genómico utilizando la transposasa Bella Durmiente y demostrar cómo supervisar plásmido captación yprogresión de la enfermedad utilizando bioluminiscencia. También nos caracterizamos características histológicas e inmunohistoquímicos de la MBG reproducido con este modelo. Además, se presenta un método rápido para generar líneas de células primarias de GBM de estos tumores. El modelo de la Bella Durmiente, en el que los tumores son inducidas a partir de células originales al animal, permite la evaluación funcional de la función de los genes candidatos GBM en la inducción y progresión de los tumores. Este sistema también es muy adecuado para el ensayo de nuevos tratamientos GBM, incluyendo terapias inmunes en ratones inmunocompetentes, sin la necesidad de procedimientos quirúrgicos invasivos inflamatorias, que pueden alterar el microambiente local.

<table><tbody><tr><td>Stoelting's Lab Standard con adaptadores para ratas y ratones</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>Otras empresas producen marcos similares, cualquiera de ellos con adaptadores de ratón pequeños son adecuados&nbsp;</td></tr><tr><td>Inyector estereotáxico por excelencia (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Las inyecciones se pueden hacer sin él, ,pero &nbsp; &nbsp; &nbsp; El inyector automático permite una mayor reproducibilidad y comodidad</td></tr><tr><td>10 &mu; l Jeringa de MICROLITROS ajustada a mano de la serie 700</td><td>Hamilton</td><td>Modelo 701</td><td>Este modelo de jeringa suministrará de 0,5 a 500 ul de solución de forma fiable. También se pueden utilizar otras jeringas (por ejemplo 5 ul, Modelo 75) aguja</td></tr><tr><td>hipodérmica de calibre 30 (1,25", 15o bisel)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>S/O# 197462</td><td>Esta aguja es ideal para perforar la piel y el cráneo de un ratón neonatal sin necesidad de otros procedimientos invasivos. Si se vuelve opaco (no entra fácilmente en la piel), debe ser reemplazado.</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>201-10G</td><td>Alícuota en pequeños volúmenes y mantener a -20 oC&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Luciferina, Sal de Potasio</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>Otras fuentes de lucifirerasa de lucilucicerasa son igual de adecuadas</td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina,</td><td>Harris Modified Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Ciencias</td><td>de la Microscopía Electrónica Compuesta 62550-01</td><td></td><td>Para la inclusión de cerebros para la criosección y la inmunohistofemistry</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 avanzado, sin glutamina</td><td>Life Tecnologías</td><td>12634-010</td><td>Para la cultura de las neurosferas</td></tr><tr><td>B-27&uml; Suplemento (50X), sin suero&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Suplemento sin suero para el cultivo de neuroesferas</td></tr><tr><td>N2 Suplemento (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Suplemento sin suero para el cultivo de neuroesferas</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>Agente anti-micoplasma para el cultivo de neurosferas</td></tr><tr><td>Egf humano recombinante</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>Suplemento de factor de crecimiento para el cultivo de&nbsp; neurospheres</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basic</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>Suplemento de factor de crecimiento para el cultivo de&nbsp; neurospheres</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&nbsp; Reactivo de desapego de células&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>Para la disociación de neurosferas</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Pellet Mortle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>Para la disociación de tumores recién disecados</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers tamaño de malla 70 mmm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Para generar suspensiones unicelulares de neurosferas disociadas</td></tr><tr><td>Xilenos Grado histológico</td><td>Fisher Scientific</td><td>C8H10</td><td></td></tr><tr><td>Protocolo Harris Hematoxilina Libre de mercurio (acidificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>Protocolo Eosyn Y Solución (intensificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

transposón mediada integración de adn plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Existe una necesidad urgente de probar la contribución de nuevos genes a la patogénesis y progresión de los glioblastomas humanos (GBM), el tumor cerebral primario más común en adultos con pronóstico sombrío. Nuevas terapias potenciales están emergiendo rápidamente de los laboratorios y requieren pruebas sistemáticas en modelos experimentales que reproduzcan fielmente las características más destacadas de la enfermedad humana. En este trabajo describimos en detalle un método para inducir nuevos modelos de GBM con integración de ADN plasmídico mediada por transposones en células de la zona subventricular de ratones neonatos. Presentamos una forma sencilla de clonar nuevos transposones susceptibles de integración genómica utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente e ilustramos cómo monitorear la absorción de plásmidos y la progresión de la enfermedad utilizando bioluminiscencia, histología e inmunohistoquímica. También describimos un método para crear nuevas líneas celulares primarias de GBM. Idealmente, este informe permitirá una mayor difusión del sistema de transposones de la Bella Durmiente entre los investigadores de tumores cerebrales, lo que conducirá a una comprensión profunda de la patogénesis y progresión de la GBM y al diseño y prueba oportunos de terapias efectivas para los pacientes.

Para caracterizar rasgos histopatológicos de glioblastomas inducidos-SB, los ratones neonatales C57 / BL6 fueron inyectados en P1 con un plásmido que codifica la luciferasa (pT2 / SB100x-Luc) en combinación con plásmidos que codifican transposones con ADN oncogénico, es decir, las ANR (pT / CAGGS -NRASV12) y SV40 LgE (pT / CMVSV40-LgE) (Figura 3c) o un plásmido que codifica un p53 de horquilla corta con PDGFβ y un reportero GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) en combinación con las ANR (Figu...

Aquí describimos un protocolo eficiente y versátil para inducir, monitorizar y analizar nuevos glioblastomas (GBM) utilizando ADN transposón inyectado en los ventrículos de ratones neonatos. Las células de la zona subventricular, que absorben el plásmido, se transforman, proliferan y generan tumores con características histopatológicas de GBM humano.

Transposón mediada Integración de ADN plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

El objetivo de este procedimiento es crear nuevos modelos para glioblastomas y, en última instancia, desarrollar nuevos enfoques terapéuticos mediante la inducción de la formación de glioblastomas que porten mutaciones genéticas específicas en ratones. Esto se logra primero creando plásmidos transposón que codifican los genes específicos de interés. Los siguientes pasos consisten en preparar los plásmidos con un reactivo de transfección e inyectarlos en el ventrículo lateral de ratones neonatos.La incorporación en la progresión tumoral se monitorea entonces mediante luminiscencia. Cuando los animales presentan signos más evidentes, se sacrifican para análisis histológicos e inmunohistoquímicos. De este modo, se inducen nuevos glioblastomas con alteraciones genéticas específicas en fondos genéticos de tipo salvaje o con modificaciones genéticas dirigidas.Estos tumores pueden estudiarse in vivo o utilizarse in vitro para generar nuevas líneas celulares susceptibles de análisis bioquímicos y experimentos de citotoxicidad mediante agentes quimioterapéuticos. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, como por ejemplo, las inyecciones ortotópicas de líneas celulares de

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Este video describe una técnica eficiente para inducir glioblastomas (GBM) utilizando ADN transposónico inyectado en los ventrículos de ratones neonatos. Las células de la zona subventricular, que absorben el plásmido, se transforman, proliferan y generan tumores con características histopatológicas de la MBG humana.

Inducción de glioblastoma mediante transposición mediada por SB: una técnica para generar un nuevo modelo de ratón mediante la integración mediada por transposones de plásmido SB en el cerebro de ratón neonatal

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

Hemos establecido un modelo ortotópico de glioblastoma cortical en ratones para intravital microscopía de dos fotones que recapitula las limitaciones biofísicas normalmente en juego durante el crecimiento del tumor. Una ventana de cristal crónica reemplazando el cráneo por encima de la del tumor permite el seguimiento de la progresión del tumor con el tiempo por microscopía de dos fotones.

El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones

Este procedimiento muestra cómo dirigirse a las interneuronas en el prosencéfalo del ratón en desarrollo mediante electroporación en el útero. Esta técnica fue particularmente eficiente para lograr la expresión génica selectiva en subtipos de interneuronas destinadas a las capas superficiales de la corteza.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

Aquí demostramos una técnica para la transducción neuronal generalizada mediante inyección intraventricular de virus adenoasociados en el cerebro de ratón neonatal.  Este método proporciona una manera rápida y fácil de lograr la expresión de por vida de los transgenes administrados viralmente.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

Se presenta aquí un método sencillo para el aislamiento y análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes que produce datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de las células inmunes que entran en el microambiente tumoral temprano del cerebro.

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Funciones célula Autónoma de genes en el cerebro pueden ser estudiadas mediante la inducción de la pérdida o ganan de función en poblaciones dispersas de las células. Aquí, describimos en el útero la electroporación para entregar recombinase de Cre en poblaciones escasas de desarrollo de las neuronas corticales con genes floxed a causar la pérdida de función en vivo.

Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero

La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.

Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

La utilización de un modelo tumoral autóctono inmunocompetente impulsado por mutaciones comunes de los pacientes para las pruebas preclínicas es fundamental para las pruebas inmunoterapéuticas. Este protocolo describe un método para generar modelos de ratón con tumores cerebrales utilizando la administración de ADN plasmídico basado en electroporación que representa mutaciones comunes de los pacientes, proporcionando así un modelo de ratón preciso, reproducible y consistente.

Modelado de tumores cerebrales in vivo mediante la administración basada en electroporación de ADN plasmídico que representa las firmas de mutación del paciente

La sepsis se refiere a un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica resultante de una infección microbiana, y puede ser simulado por una técnica quirúrgica denomina ligadura cecal y punción (CLP). Aquí se describe un método para utilizar CLP inducida modelo animal para cribar hierbas medicinales para agentes terapéuticos.

El uso de modelos animales de sepsis para evaluar nuevas terapias a base de plantas

Aprende a inducir glioblastomas en ratones recién nacidos mediante integración de transposones en la zona subventricular. Este método permite monitorizar la progresión tumoral con bioluminescencia y analizar mutaciones genéticas específicas.

Transposón mediada Integración de ADN plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma (Video) | JoVE Journal

Transposón mediada Integración de ADN plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma

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