Transposón mediada Integración de ADN plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma

El objetivo de este procedimiento es crear nuevos modelos para los glioblastomas y, en última instancia, desarrollar nuevos enfoques terapéuticos mediante la inducción de la formación de glioblastomas que albergan mutaciones genéticas específicas en ratones. Esto se logra creando primero plásmidos transposónicos, codificando los genes específicos de interés. Los siguientes pasos son preparar los plásmidos con un reactivo de transfección e inyectarlos en el ventrículo lateral de ratones neonatos.

A continuación, se monitoriza la captación en la progresión tumoral mediante luminiscencia. Cuando los animales se vuelven más abundantes, se sacrifican para el análisis histológico e inmunohistoquímico. Por lo tanto, se inducen nuevos glioblastomas con alteraciones genéticas específicas en el tipo salvaje o en antecedentes genéticos específicos.

Estos tumores pueden ser estudiados in vivo o utilizados in vitro para generar nuevas líneas celulares susceptibles de análisis bioquímicos y experimentos de citotoxicidad utilizando agentes quimioterapéuticos. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, como por ejemplo, las inyecciones ortotópicas de la línea celular de glioblastoma, es que los tumores son inducidos por la transformación maligna de células endógenas en un animal inmunocompetente mediante alteraciones genéticas que se eligen de forma muy específica. Este proceso reproduce más de cerca la etiología de la enfermedad humana y recapitula las características histopatológicas sobresalientes de la MBG humana.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurooncología, como cuáles son las mutaciones conductoras responsables de inducir diferentes tipos de glioblastoma multiforme, clásico, preneural, neuronal en adultos o en tumores pediátricos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la GPM desde los nuevos quimioterápicos. Las terapias inmunitarias radiológicas o una combinación de ellas pueden probarse con relativa rapidez in vivo o in vitro utilizando este modelo.

La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando lo discutí con mi colega, el Dr. John de la Universidad de Minnesota, quien había desarrollado el modelo inicial de tumor cerebral utilizando la integración mediada por transposiciones de la bella durmiente de oncogenes, un inhibidor de genes supresores de tumores en el ADN genómico del huésped. Pensé que esta metodología sería muy poderosa para estudiar el impacto de nuevas mutaciones en la progresión tumoral y ayudar en el desarrollo de terapias dirigidas para el cáncer cerebral. Tres o cuatro semanas antes del experimento, configuré una jaula de cría de ratones con un macho y una hembra, incluí un iglú de plástico de colores para enriquecer el entorno y aumentar las posibilidades de apareamiento. Retire al macho una vez que se haya confirmado un embarazo y, 18 días después del día de apareamiento, comience a monitorear a la hembra para el parto.

Asegúrese de que haya una madre sustituta disponible en el momento del parto. En el primer día postnatal, realizar las inyecciones intraventriculares. Prepare primero la solución inyectable Ali, citando 20 microlitros de la mezcla de ADN que contiene la transpuesta en plásmidos a una concentración final de 0,5 microgramos de ADN por microlitro.

A continuación, se colocan una alícuota de 20 microlitros de solución de PEI en la solución de ADN y se dejan incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos a una hora, después de lo cual la mezcla debe almacenarse en hielo. Para la aguja de inyección, conecte una jeringa de 10 microlitros a una aguja hipodérmica de calibre 30, biselada a 12,5 grados. A continuación, conecte la jeringa a una microbomba con inyección automática.

Pruebe la configuración con 10 microlitros de agua y asegúrese de vaciar la jeringa. Ahora, enfríe la etapa estereotáxica neonatal con una mezcla de hielo seco y alcohol. Cuando se enfríe entre dos y ocho grados centígrados, proceda con las inyecciones.

Primero, anestesia a un cachorro colocándolo en hielo durante dos minutos. Mientras el cachorro está en hielo, cargue la jeringa con la solución inyectable. Una vez anestesiado, transfiera al cachorro al marco e inmovilice su cabeza entre las barras de los oídos cubiertas con gasa.

Comprueba que la cara dorsal del cráneo esté horizontal y paralela a la superficie de la montura. Además, las suturas craneales deben ser claramente visibles. Si la cabeza del cachorro no está inmovilizada con suficiente firmeza, se moverá durante la inyección.

Mientras que si se aprieta con demasiada firmeza entre las barras de las orejas del marco, la lambda no será visible y la presión dentro de la cabeza obligará a que la solución inyectada se escape. Con el cachorro agarrado firmemente por el marco, limpie la cabeza con etanol al 70%, luego baje la aguja y ajuste su posición para que entre en contacto con la lambda. A continuación, levanta la aguja y muévela 0,8 milímetros lateralmente y 1,5 milímetros cuenta. Luego bájalo de nuevo hasta que haga un ligero hoyuelo en la piel.

Registre las coordenadas de esta posición. A continuación, baje la aguja, 1,5 milímetros a través de la piel y el cráneo hasta la corteza en el ventrículo lateral. Inyecte 0,75 microlitros durante 90 segundos y espere un minuto para que la solución se disperse mientras espera.

El próximo cachorro que se inyecte puede ser anestesiado. Después del peso, levante lentamente la aguja, luego transfiera al cachorro a un lugar de recuperación bajo una lámpara de calefacción. El tiempo desde la anestesia hasta el calentamiento debe ser inferior a 10 minutos.

Cuanto más rápido, mejor controle su respiración y, si es necesario, frote suavemente las extremidades para estimular la respiración. Una vez que el cachorro se haya calentado, tenga un color rosado y respire firme, devuélvalo a su madre. Por lo general, esto tarda de cinco a siete minutos desde la inyección.

Si se inyectan varios cachorros, todos deben recuperarse antes de devolverlos a la madre. Si después de media hora todos los cachorros no están listos, devuélvale la mitad y luego devuelva el resto más tarde al final del procedimiento, controle la madre. Después de devolver los cachorros.

Si no responde a las crías, agregue a la madre sustituta a la jaula. De 24 a 72 horas después de la inyección, controle la absorción de plásmidos y transfiera todas las crías a seis placas de cultivo de tejidos, una cría por pocillo. Luego cargue una jeringa de un mililitro con 30 miligramos por mililitro de Lucifer en solución salina o PBS y coloque una aguja hipodérmica de calibre 30.

Inyecte 30 microlitros de solución por vía subcutánea entre los omóplatos de cada cachorro para evitar lastimar al cachorro, inyecte la solución debajo de un pequeño pliegue de piel. Transfiera inmediatamente a las crías a un sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo. Configure una secuencia para adquirir cuatro imágenes consecutivas a intervalos de un minuto con exposición automática, gran inclinación y una apertura de una. Más tarde.

Después de unos 17 días, los animales podrían comenzar a formar tumores macroscópicos detectables por bioluminiscencia e histología. También puede llevar hasta seis semanas controlar los tumores. Inyecte 100 microlitros de solución luciferina intraperitoneal con una aguja de calibre 26.

Después de tres minutos, anestesiar a los animales en una cámara de anestesia con oxígeno y flúor ISO y colocar a los animales en la cámara de imágenes equipada con conos para dispersar el flúor ISO. Adquiera una serie de seis imágenes a intervalos de dos minutos con un tiempo de exposición automático, agrupación media y un número F de apertura abierta de uno. La región de interés suele ser un óvalo sobre la cabeza, medido la intensidad de luminiscencia en cada animal utilizando los mismos ajustes para caracterizar las características histopatológicas de los glioblastomas inducidos por SB.

Se inyectaron seis ratones neonatos negros C 57 en P one con un plásmido y luciferasa de recubrimiento en combinación con transposones Inod de plásmidos T grandes NRA S y SV 40 con ADN oncogénico. Alternativamente, se inyectó un plásmido que codifica una horquilla corta P 53 con PDGF beta y un reportero de GFP A en combinación con NRAS. La necrosis pseudopalis era evidente, perivascular y difusa en el cerebro.

Los glioblastomas de parénquima también se monitorizaron con bioluminiscencia. Los animales suelen sucumbir a la carga tumoral. Cuando la luminiscencia alcanzó una intensidad de 10 a la séptima a 10 a la novena unidades calibradas.

La supervivencia media de los animales dependió previsiblemente de las combinaciones de transposones oncogénicos inyectados en el cerebro neonatal. Los tumores más agresivos fueron inducidos con NRS y los tumores de novo con antígeno T grande SV 40 se caracterizaron por la expresión de moléculas características. Los tumores nacientes hechos para expresar GFP inducida con SHP 53 y nras expresaron el marcador de células madre neurales nestón, y algunos también expresaron proteína ácida gliofibrilar.

Después de 56 días, se encontró un tumor rodeado de numerosos astrocitos GFAP positivos. Estas células tumorales expresaban neína, pero no GFAP. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir la formación de glioblastomas, que albergan mutaciones genéticas específicas a través de inyecciones intraventriculares en ratones neonatos, y cómo monitorear la progresión de la enfermedad con bioluminiscencia.

En el artículo, encontrará detalles sobre cómo clonar fácilmente nuevos plásmidos trans pro, que codifican genes de interés, y también cómo monitorear los tumores y analizarlos con histología e inmunohistoquímica. Además, encontrará un método detallado sobre cómo generar nuevas líneas celulares de glioblastoma a partir de animales con tumores modificados genéticamente. Esperamos que este artículo ayude a acelerar el descubrimiento de nuevas terapias para esta devastadora enfermedad humana.