Utilizando adeno-asociado virus como una herramienta para estudiar las barreras de retina en la enfermedad

El objetivo general de este procedimiento es investigar la permeabilidad de la barrera hematorretiniana y la integridad de la membrana limitante interna en modelos animales de enfermedad retiniana. Esto se logra primero mediante la inyección de partículas de AAV que contienen un transgén GFP en el vítreo o en la circulación sanguínea. El segundo paso consiste en tomar muestras de sangre en diferentes momentos tras las inyecciones.

El muestreo sanguíneo se complementa con imágenes semanales del fondo de ojo in vivo. El paso final consiste en realizar inmunohistoquímica en preparaciones planas de retina y en secciones criostáticas de retina. Finalmente, se utiliza microscopía confocal y PCR para mostrar el patrón de transducción indicador de la integridad de la membrana limitante interna y para detectar partículas de AAV en la circulación sanguínea, demostrando así la permeabilidad de la barrera hematorretiniana.

La principal ventaja de esta técnica frente a nuestros métodos existentes es que el método de AAV permite obtener información sobre la permeabilidad de la barrera hematorretiniana que no proporcionan otros métodos celulares. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia génica mediada por AAV, ya que ayuda a garantizar la permeabilidad de la barrera hematorretiniana a las partículas de AAV, evitando así efectos secundarios indeseables. Este método puede aportar información sobre la integridad de la membrana limitante interna en modelos animales de otras enfermedades retinianas, como ratas diabéticas.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando observamos que la retina de nuestro modelo de ratón nulo DP 71, que muestra la ruptura de la barrera hematorretiniana, se transducía de manera más eficiente que la retina de tipo silvestre.

Comience por anestesiar ratones C-57 black-six J. Verifique la pérdida de tres reflejos: el reflejo de enderezamiento, el reflejo de retirada y la respuesta al pellizco de la cola.

La pérdida de estos reflejos confirma la anestesia. A continuación, dilate las pupilas aplicando neosinéfrina al 5% y midriático al 0,5% sobre la córnea mediante un gotero. Luego, use una pomada veterinaria para lubricar los ojos y evitar que se sequen en exceso. Ahora cargue una aguja desechable ultrafina de calibre 30 con la solución stock que contiene de uno a cuatro veces 10 a la 11 partículas de AAV-GFP.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque deben realizar la inyección intravítrea más segura sin tocar el cristalino ni la retina. A continuación, pase una aguja desechable ultrafina de calibre 30 a través del ecuador y junto a la limbo hacia la cavidad vítrea. Después de introducir la aguja en el ojo, inyecte un microlitro de solución mientras observa la aguja en el centro de la cavidad vítrea.

Utilice un ojo como control para los experimentos de la membrana limitante interna e inyecte ambos ojos para los experimentos de la barrera hematorretiniana. Después de la inyección, aplique un tratamiento tópico antiinflamatorio y antibacteriano a cada ojo inyectado. Una semana después, dilate las pupilas con neosinéfrina y midriático y realice exámenes de fondo de ojo con una cámara de fondo de ojo.

Realice un seguimiento de la expresión de GFP mediante observaciones a la semana, a las dos semanas, al mes y a los dos meses posteriores a la inyección. Después de extraer los ojos de un animal inyectado y sacrificado, seccione los ojos para eliminar el cristalino y la córnea. Luego, fije por inmersión el ojo disecado en paraformaldehído al 4% durante una hora. Tras una hora, crio-proteja los ojos en sacarosa al 10% durante otra hora a temperatura ambiente. A continuación, sumerja los ojos en sacarosa al 20% durante un tercio de hora a temperatura ambiente.

Finalmente, deje los ojos en solución de sacarosa al 30 % durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, incluya y congele las copas oculares en una resina de inclusión como matriz para criogenia. Luego, utilizando el criostato, realice secciones de 10 micrones y monte estas sobre portaobjetos preparados para tejido congelado.

Ahora permeabilice las secciones en los portaobjetos con detergente durante cinco minutos. A continuación, realice dos lavados breves en PBS. Luego bloquee los ojos durante una hora a temperatura ambiente.

Para facilitar la disección de montajes planos de retina, fije los ojos enucleados en paraformaldehído al 4% durante 15 a 30 minutos. Esta fijación y la fijación posterior a la disección deben realizarse adecuadamente, ya que son fundamentales para preservar la fluorescencia de GFP. Transcurridos entre 15 y 30 minutos del periodo de fijación, seccione los ojos, retire la córnea y el cristalino.

Seccione la retina del epitelio pigmentario retiniano y de la esclerótica cortando alrededor de la ora serrata y del nervio óptico. Después de la disección, sumerja las retinas en paraformaldehído al 4 % durante otros 30 minutos para fijar el tejido y la proteína fluorescente en las células retinianas transducidas. Tras la fijación, lave la muestra durante cinco minutos en PBS estéril a pH 7,4.

Luego, cambie el PBS por tampón de bloqueo e incube las retinas durante cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Comience el paso de marcado incubando las muestras con los anticuerpos primarios en tampón de bloqueo durante cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Después de aplicar el anticuerpo primario, lave los tejidos tres veces con PBS, luego incube los tejidos en una dilución uno a 500 de anticuerpos conjugados con Alexa Fluor en tampón de bloqueo.

Incubar durante una hora para cortes criostáticos o dos horas para preparaciones en montaje plano. Realizar esto a temperatura ambiente y protegerlo de la luz. Después de aplicar el anticuerpo secundario, eliminarlo mediante tres lavados con PBS como antes.

Ahora, realice cortes de alivio en la retina para que pueda montarse plana sobre un portaobjetos, con los fotorreceptores o las células ganglionares de la retina orientadas hacia arriba. Aplique un medio de montaje acuoso y un cubreobjetos. Las preparaciones pueden almacenarse a cuatro grados Celsius antes de la obtención de imágenes mediante microscopía confocal.

Comience generando un control positivo para partículas de AAV circulantes. Primero, tome una muestra de sangre de 10 a 20 microlitros antes de inyectar el AAV. Luego, una vez anestesiado, inyecte 100 microlitros de la solución vírica stock en el torrente sanguíneo.

La forma más sencilla de inyectar sustancias en el torrente sanguíneo es a través de la vena peniana. En esta captura de video, inyectamos un tinte azul como control visual de la inyección. Durante los próximos tres días, continúe tomando periódicamente una pequeña muestra de sangre y luego sacrifique el ratón. A partir de una muestra de tejido, extraiga el ADN genómico de las muestras utilizando un kit comercial; con el ADN, realice una amplificación por PCR con un par de cebadores para GFP. Realice 30 ciclos con extensiones de 45 segundos y un paso de hibridación a 55 grados Celsius. Se esperaba que el patrón de transducción del vector SHH 10 aumentara en los ratones nulos para DP 71. Si el modelo animal mostró alteraciones en la estructura de la membrana limitante interna, los ratones nulos para DP 71 presentan barreras retinianas comprometidas y son por tanto una comparación útil: en los ratones nulos para DP 71, la inyección intravítrea de SHH 10 dirige con mayor eficacia las células gliales de Müller.

Esto indica una desestabilización de la membrana limitante interna en esta línea de ratones transgénicos en comparación con los controles de tipo salvaje. La inyección de AAV5-GFP también demostró permeabilidad de la membrana limitante interna. El AAV5 fue ineficaz mediante inyección intravítrea en ratones de tipo salvaje, pero se volvió altamente eficaz en la entrega génica a los fotorreceptores en ratones con barreras retinianas comprometidas, como en los ratones nulos para DP71.

Mediante análisis por PCR, la barrera hematorretiniana en ratones nulos para DP71 permanece selectiva frente a partículas de AAV, ya que no se encontró rastro alguno de AAV en sus muestras de sangre tras la inyección intravítrea. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el virus asociado a adenovirus para evaluar la integridad de la membrana limitante interna o la permeabilidad de la barrera hematorretiniana, analizando el patrón de transducción de la retina o la presencia de partículas de AAV en la circulación sanguínea.