Name: Lesiones Embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprende a crear lesiones mecánicas vasculares en embriones de Danio rerio para estudiar hemostasia e inflamación. Este método permite visualizar en tiempo real procesos de reparación mediante microscopía.

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Los autores desean agradecer a los Dres. Stephen Wilson y Lisa Wilsbacher por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado en parte por los NIH HL054737.

NOTA: Procedimientos utilizando el pez cebra fueron aprobados por Institutional Animal Care de UCSF y el empleo. 1. Preparación de Herramientas <ol><li> Inserte el pasador de minucias en un soporte de pasador y sujete el pasador. </li><li> Con unas pinzas de punta fina, doble cuidadosamente la punta del pasador para crear un ligero gancho. </li><li> Para la manipulación y la estabilización del embrión durante la lesión, doblar el extremo de un calibre 28 ½ pulgadas aguja montada en una jeringa de insulina con unos alicates de punta fina. </li></ol> 2. Preparación de embriones de pez cebra para Lesiones <ol><li> Configure parejas reproductoras de pez cebra y recoger los huevos en el agua de huevo (sales acuario 60ug / mL) como se muestra previamente 22. </li><li> Añadir 0,003% N-feniltiourea (PTU) al agua de huevo cuando los embriones son aproximadamente 8 horas después de la fecundación (HPF) para evitar melanization. </li><li> Dechorionate dos día después de la fertilización (dpf), los embriones antes del experimento utilizando unas pinzas de punta fina. <br/&gt; NOTA: Los embriones se pueden lesionar en cualquier momento después de que comience la circulación. Los datos presentados aquí es para 2 dpf embriones, pero la técnica se ha aplicado con éxito en embriones hasta 5 dpf. </li><li> Anestesiar a los embriones con 0,02% tamponada de ácido 3-aminobenzoico (tricaína) aproximadamente 10 minutos antes de las manipulaciones. </li></ol> 3. Recipiente Mecánica Lesión de embriones <ol><li> Transferencia de embriones anestesiados a una diapositiva depresión en un microscopio estereoscópico de disección utilizando una pipeta de transferencia. </li><li> Usando el lado plano corto de la aguja de la jeringa para manipular el embrión con la mano dominante, posicionar el embrión en su lado con la superficie ventral de espaldas a la aguja. </li><li> Coloque el pasador de minucias con la punta apuntando directamente contra la superficie ventral de la posterior peces a la abertura urogenital. Coloque el pasador de minucias en un ligero ángulo tal que la punta curvada es capaz de perforar a través de la peridermis directamente en la vena caudal (Figura 1 &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Uso de la aguja de la jeringa para manipular el embrión, perforar la vena caudal con el pasador de minucias tocando el embrión en el pasador para enganchar el pasador ligeramente en la vena. </li><li> Uso de la aguja de la jeringa, tire el embrión lejos de la clavija de minucias para crear un pequeño desgarro en el recipiente. NOTA: Una lesión éxito dará lugar a sangrado inmediato de la vena. </li></ol> 4. Análisis de la hemostasia <ol><li> Elija sólo los embriones con visiblemente células sanguíneas circulantes para este procedimiento. </li><li> Preparar para iniciar el temporizador, tan pronto como el pasador de minucias se tira desde el recipiente. </li><li> Inicie el temporizador tan pronto como la pérdida de sangre puede ser visualizada de la herida. Cuando la pérdida de sangre de la herida cesa, detener el cronómetro y registrar el tiempo total como el tiempo de sangrado. Si se inhibe la coagulación, registrar el tiempo para cuando hay ya no visiblemente las células sanguíneas circulantes. </li></ol> 5. Análisis de Curación de Heridas <ol><li> Pos de Transferenciaanimales camiseta de lesiones en placas de formación de imágenes de fondo de vidrio para microscopía. </li><li> Eliminar la mayor parte del agua del huevo. </li><li> Cubra los embriones en 0,3 a 1,2% de baja fusión de agarosa disueltos en el agua de huevo, se calentó a entre 42 y 45 ºC y suplementadas con 0.02% tricaína. </li><li> Posición embriones en sus lados con fórceps. </li><li> Después de la agarosa se enfría, llenar el plato con un 0,02% tricaína en agua huevo. </li><li> Adquirir imágenes con campo claro, epifluorescencia, o microscopía confocal. </li><li> Retire embrión de la agarosa utilizando pinzas y traslado de regreso al agua huevo. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El pez cebra se han utilizado con éxito como un modelo para diferentes tipos de heridas incluyendo lesiones láser 13-15, trombosis inducida por láser 16, y epitelial hiriendo a 10. Se presenta un método de la herida mecánico que es fácil de ejecutar y produce una lesión controlada en un modelo in vivo que es altamente susceptible a la microscopía en tiempo real. Lesión resulta en una respuesta hemostática rápido y medible y un programa de reparación de heridas reproduci...

pez cebra se han utilizado ampliamente para estudiar una variedad de temas en biología vascular, incluyendo el desarrollo vascular, la angiogénesis y el desarrollo y patología hematopoyética1-3. Los embriones desarrollan una circulación funcional, así como leucocitos y otros componentes del sistema inmune innato 1 día después de la fertilización (dpf) 1,4,5. La conservación de la respuesta inflamatoria y leucocitaria a la lesión ha convertido al embrión de pez cebra en un modelo informativo para procesos inflamatorios tan diversos como la infección tuberculosa, la enterocolitis y la regeneraciónde tejidos 6-9. Los embriones de pez cebra se han utilizado para estudiar la inflamación relacionada con lesiones, particularmente en el contexto de la herida epitelial y la respuesta de los neutrófilos10,11. La lesión del embrión da lugar a una respuesta celular altamente conservada de las células en el sitio de la lesión y de las células inmunitarias innatas reclutadas para responder a la lesión y regular su resolución11,12. Otros modelos de lesiones han utilizado pulsos láser enfocados para localizar espacialmente la lesión en tipos específicos de células, incluidas las neuronas, las células musculares y los cardiomiocitos13-15. 
Los embriones de pez cebra se han utilizado como modelo para estudiar la hemostasia y la trombosis en condiciones de manipulación farmacológica y genética, utilizando la formación de trombos tanto mecánicos como inducidos por láser16-19. Los componentes de la cascada de coagulación parecen estar bien conservados y los transgénicos han permitido estudios detallados de la deposición de trombocitos y fibrina en el sitio de coagulación17,20,21. El procedimiento presentado en este artículo complementa estos métodos al proporcionar un sistema para estudiar las lesiones mecánicas de los vasos que resultan en la ruptura del vaso, la formación y resolución de trombos y la reparación de los vasos.

<table><tbody><tr><td>Minutia Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10 Diámetro de</td> la <td>punta 0,0125 mm, diámetro de la varilla 0,1 mm</td></tr><tr><td>Soporte de alfileres</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas de punta fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Corredera de depresión de vidrio</td><td>Aquatic Eco-Systems</td><td>M30</td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Agarose</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>50081</td><td>Precalentado a 42 &ordm; C</td></tr><tr><td>N-feniltiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 3-aminobenzoico (tricaína)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7016</td><td></td></tr><tr><td>Platos de imagen con fondo de vidrio</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SZH10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>Sales de acuario</td><td>Jeringa</td> de insulina instantánea Ocean <td></td><td></td></tr><tr><td>con aguja de 28,5 G</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>329461</tr></tbody></table>

lesiones embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Los embriones de pez cebra (Danio rerio) han demostrado ser un poderoso modelo para estudiar una variedad de procesos de desarrollo y enfermedades. El desarrollo externo y la transparencia óptica hacen que estos embriones sean especialmente susceptibles a la microscopía, y se dispone de numerosas líneas transgénicas que etiquetan tipos específicos de células con proteínas fluorescentes, lo que convierte al embrión de pez cebra en un sistema ideal para visualizar la interacción de los tipos de células vasculares, hematopoyéticas y de otro tipo durante la lesión y la reparación in vivo. La genética directa e inversa en el pez cebra está bien desarrollada y es posible la manipulación farmacológica. Describimos un modelo de lesión vascular mecánica utilizando técnicas de micromanipulación que explota varias de estas características para estudiar las respuestas a la lesión vascular, incluyendo la hemostasia y la reparación de vasos sanguíneos. Utilizando una combinación de microscopía de video y timelapse, demostramos que este método de lesión vascular da como resultado respuestas medibles y reproducibles durante la hemostasia y la reparación de heridas. Este método proporciona un sistema para estudiar la lesión vascular y la reparación en detalle en un modelo animal completo.

Lesión de los vasos mecánica se realizó el 2 de fdd embriones (Figura 2A - C). Lesión resulta en una respuesta rápida y fiable de la coagulación como medidas por el tiempo hasta el cese de la hemorragia (Figura 2D). Para determinar si o no diferencias en la respuesta de coagulación se podrían medir, la hirudina anticoagulante se administró a los embriones mediante inyección en el conducto de Cuvier inmediatamente antes de heridas (5-10 nl de 1 unidad por l hirudina disu...

Este artículo describe un método para crear una lesión mecánica en un vaso en embriones de pez cebra. Este modelo de lesión proporciona una plataforma para estudiar la hemostasia, la inflamación relacionada con la lesión y la cicatrización de heridas en un organismo ideal para la microscopía en tiempo real.

Lesiones Embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

El objetivo general del siguiente procedimiento consiste en crear una lesión mecánica en el vaso sanguíneo de embriones de pez cebra. Esto se logra perforando la vena caudal del embrión de pez cebra mediante un alfiler de minutia. A continuación, se evalúa la hemostasia midiendo el tiempo durante el cual la sangre fluye activamente desde la herida.Luego se realiza microscopía de lapso de tiempo para visualizar aspectos de la cicatrización de heridas, como la reparación vascular. Los resultados muestran que la lesión mecánica de vasos en embriones de pez cebra puede utilizarse para medir de manera reproducible aspectos de la hemostasia y la reparación de heridas, tales como los tiempos de sangrado y el tiempo necesario para restablecer el flujo sanguíneo. La principal ventaja de esta técnica frente a los modelos de lesión estándar en ratón y otros es que, en el embrión de pez cebra, la inflamación, la hemostasia y la reparación pueden visualizarse fácilmente mediante microscopía en tiempo real.Para comenzar, inserte un alfiler de minutia en un soporte para alfileres y sujete el alfiler con pinzas finas. Doble cuidadosamente la punta del alfiler para crear un pequeño gancho que permita manipular y estabilizar el embrión durante la lesión. Utilice alicates de punta para doblar el extremo de una aguja de calibre 28, de media pulgada de longitud, montada en una jeringa de insulina.A continuación, prepare embriones de pez cebra estableciendo parejas de apareamiento y recolectando huevos en agua para huevos como se mostró previamente. Cuando los embriones alcancen entre ocho y 24 horas post-fecundación (HPF), agregue PTU al agua para huevos para prevenir la pigmentación a los dos días post-fecundación (DPF). Utilice pinzas finas para desenfundar los embriones y anestesiarlos usando una concentración final de 0,02 % de trica tamponada para lesionar mecánicamente los vasos sanguíneos embrionarios.Utilice una pipeta de transferencia para colocar embriones anestesiados sobre un portaobjetos con cavidad. Coloque el embrión de lado bajo un microscopio estereoscópico, sosteniendo con la mano dominante la parte corta y plana de la aguja de una jeringa, con la superficie ventral orientada alejándose de la aguja. A continuación, coloque el alfiler de minutia con la punta dirigida directamente contra la superficie ventral del pez, posterior a la abertura urogenital.Sosténgalo con un ligero ángulo para que la punta curva pueda atravesar el peridermo directamente hacia la vena coddle. Luego, utilice la aguja de la jeringa para manipular el embrión. Use la aguja fina para perforar la vena coddle golpeando suavemente el embrión contra la aguja, de modo que esta se enganche ligeramente en la vena con ayuda de la aguja de la jeringa.Retire el embrión del alfiler de minutia para crear un pequeño desgarro en el vaso. Una lesión exitosa resultará en sangrado inmediato desde la vena. Para este procedimiento, seleccione únicamente embriones con células sanguíneas que circulen visiblemente.Con el alfiler de precisión en su lugar, extráigalo del vaso sanguíneo y, tan pronto como se visualice la pérdida de sangre por la herida, inicie un cronómetro. Cuando cese la pérdida de sangre por la herida, detenga el cronómetro y registre el tiempo total como tiempo de sangrado; si la coagulación está inhibida, registre el tiempo en el que ya no se observen células circulantes de forma visible. Transfiera los animales después de la lesión a placas de imagen con fondo de vidrio para microscopía y retire la mayor parte del agua de huevo, luego agregue agarosa de bajo punto de fusión al 0,3-1,2 % suplementada con trica al 0,02 % y calentada a una temperatura entre 42 y 45 grados Celsius. Cubra los embriones.Utilice pinzas para colocar los embriones de lado. Después de que el aro se enfríe, llene el recipiente con trica al 0,02 % en agua de huevo. Utilice microscopía de campo brillante, epifluorescencia o confocal para adquirir imágenes tras el análisis de imágenes.Utilice pinzas para transferir los embriones de nuevo al agua de huevo. Este video muestra una lesión mecánica del vaso realizada en un embrión PF 2D. Se puede observar una pérdida activa de sangre seguida por la cesación de la hemorragia; la lesión provoca una respuesta de coagulación rápida y confiable, medida por el tiempo hasta la cesación de la hemorragia, para determinar si se podían medir diferencias en la respuesta de coagulación.El anticoagulante odin se administró a los embriones mediante inyección en el conducto de QVA inmediatamente antes de provocar la lesión. Como se muestra aquí, el fármaco aumentó significativamente los tiempos de sangrado en comparación con el control vehicular. En este video, se puede observar inmediatamente después de la lesión evidencia de daño vascular y coagulación utilizando líneas transgénicas para marcadores de células endoteliales y de glóbulos rojos.Las imágenes se adquirieron cada cinco minutos durante un período de 12 horas, mostrando las diferentes etapas de la reparación de la herida. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo provocar una lesión mecánica en embriones de pez cebra.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El método que aquí se presenta incluye el daño exacto de embriones de pez cebra en vivo con pulsos láser de alta energía y el posterior análisis de estas lesiones y su recuperación con el tiempo. También mostramos cómo genéticamente etiquetado individual o grupos de células del músculo esquelético se puede seguir durante y después de la luz láser daño inducido.

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Después de la transección de la médula, el pez cebra adulto tenga la recuperación funcional a las seis semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas de la transparencia de las larvas y una recuperación más rápida, se presenta un método para seccionar la médula espinal de las larvas. Después de transección, se observa la recuperación sensorial a partir de los 2 días después de la lesión, y el movimiento C-doble por 3 días después de la lesión.

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Para arrojar luz sobre los mecanismos celulares y moleculares de la neurogénesis y regeneración del pez cebra adulto, desarrollamos un protocolo para la cirugía invasiva que causa lesiones mecánicas en el telencéfalo adulto del pez cebra y el posterior seguimiento de los cambios en el hemisferio apuñalado mediante inmunohistoquímica o hibridación in situ.

Puñalada de Lesiones de la herida del pez cebra Telencéfalo adultos: un método para investigar Vertebrados Cerebro neurogénesis y Regeneración

El pez cebra es un excelente sistema modelo para estudios genéticos y de desarrollo. La implantación de perlas es una valiosa técnica de manipulación de tejidos que puede utilizarse para interrogar los mecanismos de desarrollo mediante la introducción de alteraciones en los entornos celulares locales. Este protocolo describe cómo realizar la implantación de microperlas en el embrión de pez cebra.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

El objetivo de este protocolo es detallar un método novedoso para la evaluación de la función cardíaca segmentaria en peces cebra embrionarios tanto en condiciones fisiológicas como patológicas.

El análisis de desplazamiento de la deformación mecánica miocárdica (DIAMOND) revela la heterogeneidad segmentaria de la función cardíaca en el pez cebra embrionario

Modificamos el modelo de caída de peso de Marmarou para peces cebra adultos para examinar una amplia gama de patologías después de una lesión cerebral traumática por fuerza contundente (LCT) y los mecanismos subyacentes a la regeneración neuronal posterior. Este modelo de LCT de fuerza contundente es escalable, induce una LCT leve, moderada o grave y recapitula la heterogeneidad de lesiones observada en una LCT humana.

Un modelo escalable para estudiar los efectos de la lesión por fuerza contundente en peces cebra adultos

Se describe un nuevo método de inyección intraperitoneal (IP) en pez cebra adulto. Cuando se manipulan compuestos tóxicos como la doxorrubicina, este procedimiento es más eficaz que los dos métodos IP descritos anteriormente. La técnica está diseñada para ser fácilmente adoptada por investigadores con experiencia limitada en el modelo de pez cebra.

Una técnica de inyección intraperitoneal en peces cebra adultos que minimiza el daño corporal y la mortalidad asociada

Este protocolo describe un método para injertar una perla magnética en el corazón del pez cebra en desarrollo a través de la microcirugía, lo que permite la manipulación de fuerzas mecánicas in vivo y desencadena la afluencia de calcio dependiente del estímulo mecánico en las células endocárdicas.

Manipulación de fuerzas mecánicas en el corazón de pez cebra en desarrollo utilizando perlas magnéticas

Este protocolo describe un método de microscopía óptica de bajo costo para evaluar la morfología y función cardíaca en embriones de pez cebra, lo que permite una evaluación reproducible de la cardiotoxicidad del desarrollo sin la necesidad de sistemas de imágenes avanzados.

Imágenes cardíacas funcionales en embriones de pez cebra mediante microscopía estándar y análisis de video: aplicaciones en investigación ambiental y biomédica

Aprende a crear lesiones mecánicas vasculares en embriones de Danio rerio para estudiar hemostasia e inflamación. Este método permite visualizar en tiempo real procesos de reparación mediante microscopía.

Lesiones Embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra

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