Tridimensional Modelo Co-cultura para la interacción tumor estromal

El objetivo general de este procedimiento es investigar las interacciones celulares entre las células de cáncer de pulmón y los fibroblastos asociados al cáncer en un método de cocultivo tridimensional. Esto se logra a través del cultivo primario de fibroblastos asociados al cáncer de pulmón humano a partir de tejido pulmonar recolectado que se pica en trozos de un milímetro de tamaño. El segundo paso es preparar geles de colágeno incrustados con fibroblastos mezclando una solución de colágeno utilizando las células oculares de tripsina y transfiriéndolos a una placa de seis pocillos para gelatinizar.

A continuación, las células de adenocarcinoma de pulmón se colocan en la superficie de cada gel para preparar un cocultivo dimensional de células cancerosas y fibroblastos, y el gel se separa del borde del pocillo para generar un cultivo flotante. El paso final es realizar el cultivo de interfaz aire-líquido y el ensayo de invasión a través de la exposición de los geles contraídos al aire colocándolos en una malla situada en una placa de seis pocillos. En última instancia, los exámenes histológicos se utilizan para evaluar la invasión de células cancerosas y los cambios morfológicos.

La principal ventaja de este procedimiento sobre los métodos existentes, como el cultivo bidimensional de monocapas, es que las interacciones multicelulares se pueden investigar en el cultivo tridimensional de la condición. Este procedimiento comienza con el cultivo primario de fibroblastos a partir de tejido pulmonar recolectado, tal como se describe y se hace referencia en el protocolo de texto. En este video, se utilizan pulmones de ratón en lugar de tejido de cáncer de pulmón humano.

Coloque la muestra de tejido pulmonar en una placa de cultivo de tejido de 10 centímetros sin medio de cultivo. Corte el tejido en pequeñas secciones de aproximadamente un milímetro de tamaño con pinzas estériles y un bisturí Durante este proceso, evite secar la sección, de lo contrario, la eficiencia del crecimiento celular se ve afectada. Coloque pequeñas secciones de tejido pulmonar separadas entre sí para mantener un área vacía alrededor de cada pieza.

Haz arañazos en la superficie de la placa de cultivo de tejidos con una hoja de bisturí. Alternativamente, la cobertura de las piezas de tejido mejora la eficacia del crecimiento celular y la propagación celular después de varios pasajes. Primero coloque la grasa de silicona en dos puntos, a 1,5 centímetros de distancia en cada pocillo.

A continuación, coloque los trozos de tejido picados individualmente en el centro de cada uno. Bueno, luego fije el cubreobjetos a la superficie de la placa con grasa de silicona. Agregue suavemente el medio de cultivo al plato, o una placa de seis pocillos antes de que las secciones de tejido se sequen.

El crecimiento eficiente de las células se pierde en su mayor parte. Si las muestras se secan, no vierta el medio demasiado rápido para evitar el desprendimiento de las secciones de tejido para la formación de gel de colágeno. Lave los fibroblastos con una solución salina tamponada con fosfato o PBS y añádala probando una para separar las células que crecen después de la tripsinización durante aproximadamente cinco minutos.

A 37 grados Celsius, separe las celdas usando nueve mililitros de DMEM suplementado con 10% FBS, recoja las celdas suspendidas en el medio en un tubo de 10 mililitros y centrifugue a 200 a 300 veces G para formar gránulos de celdas. Resus. Suspenda los pellets resultantes en 100%FBS a una densidad de medio millón de células por mililitro. Enfríe los reactivos, pipetas y tubos para la preparación del gel de colágeno en un refrigerador antes de la preparación del gel de colágeno.

A continuación, prepare el gel de colágeno mezclando la suspensión de fibroblastos en FBS Tipo uno A colágeno cinco X-D-M-E-M y tampón de reconstitución pipeteando enérgicamente para asegurar una mezcla homogénea evitando la creación de burbujas durante el proceso de pipeteo. Luego agregue tres mililitros de la mezcla a cada pocillo de una placa de seis pocillos y deje gelatinizar en la incubadora a 37 grados centígrados sin perturbación durante 30 a 60 minutos para el cultivo de células cancerosas en el gel de colágeno Resus. Suspender las células cancerosas en el medio de cocultivo 3D a una densidad de una vez 10 a la quinta célula por mililitro.

Pobres dos mililitros de la solución de células de adenocarcinoma de pulmón resuspendidas, A 5 49 en la superficie de cada gel. Modificar el número de células cancerosas o fibroblastos en cocultivo en función de las condiciones experimentales para realizar la contracción del gel. Incubar los geles durante la noche a 37 grados centígrados para que las células cancerosas puedan adherirse al gel de colágeno.

A continuación, separe cada uno y genere un cultivo flotante en cada pozo. De los seis pocillos, placa con una aguja en ángulo de calibre 21 o una pequeña espátula para separar cada gel del borde del pocillo cada dos o tres días. Refrescar los pozos con dos mililitros de medio de cocultivo 3D.

Mida el tamaño de cada gel todos los días durante cinco días. Por último, consulte el protocolo de texto para el análisis de gel de colágeno. Después de cultivar, el colágeno se gelifica a 37 grados centígrados durante cinco días.

Exponga los geles contraídos al aire colocándolos sobre una malla. En las nuevas placas de seis pocillos, la malla se fabrica a partir de filtros de células disponibles en el mercado que se utilizan para la citometría de flujo. Llene suavemente cada pocillo con 11 mililitros de cocultivo 3D. Medio.

Coloque los geles en la malla con una cuchara estéril y elimine cualquier medio restante de los geles en esta condición. Los geles se sumergen en el medio mientras que la superficie superior del gel se expone al aire. Defina esta condición de cultivo como interfaz aire-líquido.

Este método de cocultivo que imita el microambiente tumoral es una herramienta útil para investigar las interacciones entre las células cancerosas y los fibroblastos incrustados en los geles de colágeno. Se co-cultivaron 5 49 células en un gel de colágeno incrustado con los fibroblastos y la capa de 5 49 células se expuso al aire colocando el gel en una malla en medio. Aquí se muestra una imagen representativa del gel colocado en la malla en un pocillo de una placa de seis pocillos con hemat, toin y eoin.

La tinción de secciones transversales de un gel cultivado tridimensionalmente reveló la invasión de 5 49 células en el gel de colágeno incrustado con fibroblastos asociados al cáncer de pulmón. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la expresión génica o la eliminación, para responder a preguntas adicionales como la función específica de los genes en la interacción entre tumores y tormentas.