Tridimensional Modelo Co-cultura para la interacción tumor estromal

El objetivo general de este procedimiento es investigar las interacciones celulares entre células de cáncer de pulmón y fibroblastos asociados al cáncer mediante un método de co-cultivo tridimensional. Esto se logra mediante el cultivo primario de fibroblastos asociados al cáncer de pulmón humano a partir de tejido pulmonar recolectado que se pica en trozos de un milímetro de tamaño. El segundo paso consiste en preparar geles de colágeno embebidos con fibroblastos mezclando una solución de colágeno utilizando las células oculares de tripsina, y transfiriéndola a una placa de seis pocillos para su gelatinización.

A continuación, se siembran células de adenocarcinoma pulmonar sobre la superficie de cada gel para preparar un cultivo co-cultivo tridimensional de células cancerosas y fibroblastos, y se separa el gel del borde del pocillo para generar un cultivo flotante. El paso final consiste en realizar el cultivo en interfase aire-líquido y el ensayo de invasión mediante la exposición de los geles contraídos al aire, colocándolos sobre una malla situada en una placa de seis pocillos. Finalmente, se utilizan exámenes histológicos para evaluar la invasión de las células cancerosas y los cambios morfológicos.

La principal ventaja de este procedimiento frente a métodos existentes como el cultivo en monocapa bidimensional es que se pueden investigar las interacciones multicelulares en un cultivo tridimensional de condiciones. Este procedimiento comienza con el cultivo primario de fibroblastos a partir de tejido pulmonar recolectado, tal como se describe y referencia en el protocolo escrito. En este video, se utilizan pulmones de ratón en lugar de tejido de cáncer pulmonar humano.

Coloque la muestra de tejido pulmonar sobre una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros sin medio de cultivo. Corte el tejido en pequeños fragmentos de aproximadamente un milímetro de tamaño utilizando fórceps estériles y un escalpelo. Durante este proceso, evite que el fragmento se seque, ya que de lo contrario se verá afectada la eficiencia del crecimiento celular. Coloque los pequeños fragmentos de tejido pulmonar separados entre sí para mantener un área vacía alrededor de cada pieza.

Realice rayaduras sobre la superficie de la placa de cultivo de tejidos utilizando una hoja de bisturí. Alternativamente, la cobertura con fragmentos de tejido mejora la eficacia de la migración celular y la propagación celular tras varios pases. Coloque primero grasa de silicona en dos puntos separados por 1,5 centímetros en cada pocillo.

A continuación, coloque individualmente los trozos de tejido picado en el centro de cada pocillo. Luego fije el cubreobjetos a la superficie de la placa utilizando grasa de silicona. Añada suavemente el medio de cultivo al recipiente o placa de seis pocillos antes de que las secciones de tejido se sequen.

La eficiencia en la migración celular se pierde en su mayor parte. Si las muestras se secan, no vierta el medio demasiado rápidamente para evitar la desprendimiento de las secciones de tejido durante la formación del gel de colágeno. Lave los fibroblastos con solución salina tamponada con fosfato al 1x o PBS y agregue tripsina para separar las células migrantes tras la tripsinización durante aproximadamente cinco minutos.

A 37 grados Celsius, desprenda las células utilizando nueve mililitros de DMEM suplementado con 10 %FBS, recolecte las células suspendidas en el medio en un tubo de 10 mililitros y centrifúgelas a 200-300 ×g para formar pellets celulares. Resuspenda los pellets resultantes en FBS al 100 % a una densidad de medio millón de células por mililitro. Enfríe los reactivos, pipetas y tubos para la preparación del gel de colágeno en un refrigerador antes de la preparación del gel de colágeno.

A continuación, prepare el gel de colágeno mezclando vigorosamente la suspensión de fibroblastos en colágeno tipo I A de FBS, DMEM 5X y tampón de reconstitución mediante pipeteo para asegurar una mezcla homogénea, evitando la formación de burbujas durante el proceso de pipeteo. Luego, agregue tres mililitros de la mezcla a cada pocillo de una placa de seis pocillos y deje que gelifique en el incubador a 37 grados Celsius sin perturbar durante 30 a 60 minutos para el cultivo de células cancerosas sobre el gel de colágeno Resus. Suspenda las células cancerosas en el medio de co-cultivo 3D a una densidad de un por diez a la quinta células por mililitro.

Coloque dos mililitros de la solución de células de adenocarcinoma pulmonar A549 resuspendida sobre la superficie de cada gel. Modifique el número de células cancerosas o de fibroblastos en cultivo conjunto según las condiciones experimentales para realizar la contracción del gel. Incube los geles durante la noche a 37 grados Celsius para que las células cancerosas se adhieran al gel de colágeno.

Luego, separe cada uno y genere una cultura flotante en cada pocillo. De la placa de seis pocillos, utilice una aguja de calibre 21 con ángulo o una espátula pequeña para separar cada gel del borde del pocillo cada dos o tres días. Renovar los pocillos con dos mililitros de medio de cultivo co-cultivo 3D.

Mida el tamaño de cada gel cada día durante cinco días. Finalmente, consulte el protocolo escrito para el análisis del gel de colágeno. Después de cultivar los geles de colágeno a 37 grados Celsius durante cinco días.

Exponga los geles contraídos al aire colocándolos sobre una malla. En nuevas placas de seis pocillos, prepare la malla a partir de filtros celulares comercialmente disponibles utilizados para citometría de flujo. Llene suavemente cada pocillo con 11 mililitros de medio de co-cultivo 3D.

Coloque los geles sobre la malla utilizando una cuchara estéril y elimine cualquier medio residual de los geles en esta condición. Los geles quedan sumergidos en el medio mientras que su superficie superior queda expuesta al aire. Defina esta condición de cultivo como interfase aire-líquido.

Este método de co-cultivo que imita el microambiente tumoral es una herramienta útil para investigar las interacciones entre células cancerosas y fibroblastos incluidos en geles de colágeno. Unas 5 49 células se co-cultivaron sobre un gel de colágeno que contenía los fibroblastos, y la capa de las 5 49 células se expuso al aire colocando el gel sobre una malla en medio. Se muestra aquí una imagen representativa del gel colocado sobre la malla en un pocillo de una placa de seis pocillos para análisis histológicos con hematoxilina, eosina y eoin.

La tinción de secciones transversales de un gel cultivado tridimensionalmente reveló la invasión de células 5 49 en el gel de colágeno embebido con fibroblastos asociados al cáncer de pulmón. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la expresión génica o la inhibición génica para responder preguntas adicionales, como la función específica de un gen en la interacción con el estroma tumoral.