Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

El objetivo general de este procedimiento es generar enteroides humanos a partir de tejidos intestinales. Esto se logra primero mediante la disección de la mucosa intestinal a partir del tejido submucoso subyacente. El segundo paso consiste en incubar la mucosa con EDTA para favorecer la disociación del epitelio del tejido conectivo.

A continuación, las criptas intestinales se separan del epitelio disociado. Finalmente, las criptas intestinales se cultivan en una matriz de membrana basal. En última instancia, se utilizan técnicas de inmunohistoquímica para mostrar la organización epitelial, así como marcadores epiteliales específicos de los OID cultivados.

Las implicaciones de este método radican en el hecho de que ahora podemos generar OID a partir de biopsias específicas del paciente, lo que significa que ahora podemos utilizar ese tejido en el laboratorio para estudiar enfermedades intestinales y diagnósticos, algo que hasta ahora nunca habíamos podido hacer. Después de preparar los tampones y los reactivos según el protocolo descrito, descongele la membrana basal sobre hielo y preincube una placa de 24 pocillos en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius cuando se haya recibido el tejido. Use PBS sin calcio ni magnesio de KO o DPBS para lavar el tejido hasta que el DPBS esté claro.

Coloque el tejido en una placa de Petri de vidrio recubierta con silicona, llena con DPBS frío con hielo, con el lado mucoso hacia arriba, y sujételo con alfileres minucin, estirándolo y fijándolo. A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, utilice tijeras de disección microscópica y pinzas curvas de punta fina para separar la mucosa subyacente de la submucosa y el tejido conectivo. Luego, con el lado mucoso hacia arriba, estire y fije la mucosa diseccionada sobre la placa de Petri de vidrio recubierta con silicona, manteniéndola plana.

Con pinzas curvas, raspe suavemente la superficie de la mucosa. Este paso es necesario para mejorar la calidad de la preparación. Cubra la mucosa con tampón de quelación de EDTA dos milimolar recién preparado.

Luego, después de lavar el tejido en hielo de tres a cuatro veces según el protocolo descrito en el texto bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas curvas para raspar suavemente la mucosa y liberar los criptas intestinales con una pipeta. Retire cuidadosamente la suspensión de criptas de la placa de Petri y transfiera a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, revise el tejido para asegurarse de que casi todos los criptas hayan sido eliminados de la mucosa.

Filtre la suspensión de criptas a través de un filtro de 150 micrómetros dos veces y utilice un microscopio para verificar el flujo. Después de lavar la suspensión de criptas y transferir el número de criptas necesario a un tubo redondo de cinco mililitros, según el protocolo descrito, centrifugue la fracción de criptas durante 10 minutos a 150 G y cuatro grados Celsius. Luego, retire el sobrenadante utilizando puntas de pipeta previamente enfriadas y matriz de membrana basal. Reuspenda el botón de criptas.

Aplique 50 microlitros de suspensión de criptas en matriz de membrana basal por pocillo a la placa precalentada, eyectando lentamente la matriz de membrana basal en el centro del pocillo. Incube la placa en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 30 minutos para permitir la polimerización completa de la matriz de membrana basal. A continuación, cubra la matriz de membrana basal con 500 microlitros de medio completo para intestino humano en miniatura, suplementado con 2,5 micromolar de CHIR 9 0 2 2 1 cada uno.

Y Thien incuba el tejido cambiando el medio después de dos días, y luego cada dos días a partir de entonces. Esta figura muestra un ejemplo típico de criptas recién aisladas a partir de tejido completo. El número de criptas aisladas de una biopsia es menor que en el tejido completo.

Se realizan generalmente dos tomas de biopsia en un solo paso. Cada toma de biopsia produce una superficie de 10 milímetros cuadrados con un promedio de 50 a 100 criptas por biopsia. Después de cultivarlas en matriz de membrana basal durante cinco a seis días, las criptas se redondean para formar enterosferas en el intestino delgado y colonosferas en el colon, y se pasan después de siete días.

Los enteroides u OIDs establecidos a partir de biopsias que se muestran aquí experimentan el mismo desarrollo, pero con una densidad menor al sembrarse. Por lo tanto, el envasado generalmente se realiza después de 10 a 12 días en cultivo. Como se muestra aquí, tanto los OIDs como los enteroides presentan un lado luminal y están revestidos con un epitelio.

Las células proliferativas pueden observarse dentro de los OID y se localizan en las puntas de los brotes. La imagen confocal de OID teñidos con e-catrín, mostrado aquí en verde, muestra las células epiteliales. Esta figura muestra enteroides en crecimiento procedentes de un paciente con fibrosis quística y una enteropatía en mechones debida a una mutación congénita en el gen del marcador de adhesión celular epitelial.

Tras seguir este procedimiento o el método como la PCR en tiempo real o la transferencia Western, se puede utilizar sangre para responder preguntas adicionales sobre un gen o sonda de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar de manera consistente células CRISPR humanas para poder generar eficientemente entidades en su laboratorio y responder preguntas específicas de sus pacientes.