Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

El objetivo general de este procedimiento es generar entradas humanas a partir de tejidos intestinales. Esto se logra diseccionando primero la mucosa intestinal del tejido submucoso subyacente. El segundo paso es incubar la mucosa con EDTA para promover la disociación del epitelio del tejido conectivo.

A continuación, se separan las criptas intestinales del epitelio disociado. Finalmente, las criptas intestinales se cultivan en matriz de membrana basal. En última instancia, se utilizan técnicas de inmunohistoquímica para mostrar la organización epitelial, así como los marcadores epiteliales específicos de los OID cultivados.

Las implicaciones de este método es el hecho de que ahora podemos generar OID a partir de biopsias específicas del paciente, lo que significa que ahora podemos usar ese tejido en el laboratorio para observar enfermedades intestinales y diagnósticos, lo que hasta ahora nunca habíamos podido hacer. Después de preparar los tampones y reactivos, de acuerdo con el protocolo de texto, descongele la membrana basal en hielo y preincube una placa de 24 pocillos en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius cuando se haya recibido el tejido. Use el PBS de KO sin calcio y magnesio o DPBS para lavar el tejido hasta que el DPBS esté limpio.

Coloque el pañuelo en una placa de Petri de vidrio recubierta de silicona llena de DPBS helado con el lado de la mucosa hacia arriba y con alfileres de minuchina asegure el tejido estirándolo y sujetándolo con alfileres. A continuación, bajo un microscopio de disección, utilice unas tijeras de microdisección y unas pinzas curvas de punta fina para extraer la mucosa subyacente de la submucosa y el tejido conectivo. Luego, con el lado de la mucosa hacia arriba, estire y sujete la mucosa diseccionada sobre la placa de Petri de vidrio recubierta de silicona.

Con pinzas curvas, raspe suavemente la superficie de la mucosa. Este paso es necesario para mejorar la calidad de la preparación. Cubra la mucosa con un tampón de quelación de EDTA de dos milimolares recién preparado.

Luego, después de lavar el tejido con hielo, tres o cuatro veces de acuerdo con el protocolo de texto bajo un microscopio de disección, use pinzas curvas para raspar suavemente la mucosa y liberar las criptas intestinales con una pipeta. Retire suavemente la suspensión de la cripta de la placa de Petri y transfiérala a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, revisa el tejido para asegurarte de que se han extraído casi todas las criptas de la mucosa.

Filtre la suspensión de la cripta a través de un filtro de 150 micrómetros dos veces y use un microscopio para verificar el flujo Después de lavar la suspensión de la cripta y transferir el número de criptas necesarias a un tubo de fondo redondo de cinco mililitros, de acuerdo con el protocolo de texto, centrifugar la fracción de la cripta durante 10 minutos a 150 Gs y cuatro grados Celsius. A continuación, retire el sobrenadante con las puntas de pipeta preenfriadas y la matriz de membrana basal Resuspend. La bolita de la cripta.

Aplique 50 microlitros de suspensión de cripta en la matriz de la membrana basal por pocillo a la placa de precalentamiento expulsando lentamente la matriz de la membrana basal en el centro del pocillo. Incubar la placa en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante 30 minutos para permitir una polimerización completa de la matriz de la membrana basal. A continuación, superponga la matriz de la membrana basal con 500 microlitros de medio intestinal humano mini completo, complementado con 2,5 micromolares de CHIR 9 0 2 2 1.

Y ellos incuban el tejido cambiando el medio después de dos días, luego cada dos días a partir de entonces. Esta figura muestra un ejemplo típico de criptas recién aisladas de tejido entero. El número de criptas aisladas de una biopsia es menor que en el tejido completo.

Por lo general, se realizan dos mordidas de biopsia en una sola pasada. Cada mordida de biopsia da como resultado una superficie de 10 milímetros cuadrados con un promedio de 50 a 100 crips por biopsia. Después del cultivo y la matriz de la membrana basal durante cinco a seis días, los Crips se redondean para formar enteroesferas para el intestino delgado y esferas colono para el colon y se dejan pasar después de siete días.

Las entradas o OID establecidas a partir de las biopsias que se muestran aquí experimentan el mismo desarrollo a una densidad más baja en la siembra. Por lo tanto, el envasado se suele realizar después de 10 a 12 días en cultivo. Como se muestra aquí, tanto los OID como los OID presentan un lado luminal y están recubiertos con un epitelio.

Las células proliferativas se pueden observar dentro de los OID y se encuentran dentro de las puntas de las yemas. Las imágenes confocales de los OID teñidos con e catrin aquí en verde muestran las células epiteliales. En esta figura se muestran los brotes en crecimiento de un paciente con fibrosis quística y una enteropatía en penacho debido a una mutación congénita en el gen de la molécula de adhesión de las células epiteliales.

Siguiendo este procedimiento o el método como la PCR en tiempo real o la sangre occidental, se puede utilizar para responder preguntas adicionales sobre un gen o problema de interés. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar constantemente a los Crips humanos para poder generar entradas de manera eficiente en su laboratorio para responder a las preguntas específicas de su paciente.