Name: Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprende a cuantificar la metilación de CPG en regiones genómicas específicas mediante secuenciación de amplicones de bisulfito. Este método de alta precisión permite analizar patrones epigenéticos en diferentes tejidos y organismos modelo.

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Los autores agradecen a Colleen Van Kirk por las muestras de retina y cerebelo de ratón, y a Peter Gregory por la generación de figuras. Los autores también agradecen a la Dra. Allison Gillaspy y al Laboratorio de Investigación de Biología Molecular y Citometría por el acceso al MiSeq. Este trabajo contó con el apoyo de las subvenciones de los NIH DA029405, EY021716 y AG026607 y la Fundación Donald W. Reynolds.

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Los autores no tienen nada que revelar.

BSAS permite centrado, precisa cuantificación de metilación del ADN con capacidades de alto rendimiento, tanto en número de muestras y número de objetivos. Además, esta generación biblioteca utilizando tagmentation transposome mediada requiere menos entrada de ADN, es más rápido y contiene menos pasos que esquila tradicional y técnicas de unión adaptador posteriores. Estas mejoras sobre los métodos existentes permiten precisa de nivel de base el análisis de metilación del ADN de cualquier diana de interés. Por otra parte, BSAS proporciona un nuevo método para la confirmación de las regiones de interés (regiones de metilación diferencialmente (DMR), islas CpG, regiones reguladoras) que han sido identificados utilizando todo el genoma de bisulfito 22 o capturar 23 enfoques. Utilizando métodos de confirmación ortogonales y más cuantitativamente métodos precisos mejora el rigor analítico de estudios epigenómicos. La profundidad máxima de lectura alcanzado con BSAS permite la cuantificación precisa en un intervalo de confianza estrecho, reresultante en la cuantificación precisa 16. Además, la capacidad de ejecutar muchas muestras en un solo experimento puede aumentar el tamaño de la muestra para la confirmación de los métodos de todo el genoma, lo que aumentará el poder estadístico; una debilidad de muchos estudios epigenéticos actuales. Es importante destacar que, BSAS proporciona una cuantificación de metilación CpG específicos de base, lo que permite la generación de hipótesis comprobables para la investigación epigenética. Hipótesis como el aumento de la metilación en un elemento de respuesta específica se traducirá en disminución de la unión de un factor de transcripción específico. BSAS, combinado con los datos de expresión de ARNm emparejados, proporciona un método para obtener tanto la regulación epigenética y la expresión del ARNm dentro de una sola pieza de tejido o población de células. Mediciones pareadas de regulación y expresión también aumentan el rigor científico y el impacto de los hallazgos. Los pasos críticos dentro del protocolo BSAS incluyen primer diseño, optimización de amplificación, y la generación de biblioteca /QC. PCR sesgo se introduce si cebadores no están diseñados adecuadamente y amplifican en diferentes eficiencias 8. El uso de estándares de metilación, como 100% y 0% de citosina metilados normas enzimáticamente generadas, se puede utilizar para determinar el grado, si alguno, de sesgo cuantificación de metilación, y es un control metodológico adecuado cuando la cuantificación de metilación 16. Del mismo modo, se debe tener cuidado cuando la optimización de las reacciones de PCR para generar un único amplicón de alta calidad. Si no está presente amplicón utilizando las directrices sugeridas se detallan en el protocolo, pasos de optimización incluyen un número creciente de ciclo de PCR o la cantidad de entrada bsDNA. Si hay múltiples productos de PCR, incluyendo dímeros de cebadores, pasos de optimización incluyen la disminución de la cantidad de entrada bsDNA, la disminución de las concentraciones de entrada de cebadores PCR molares, aumento de las temperaturas de recocido, o disminuyendo el número de ciclos de PCR. Uno o una combinación de estos procedimientos de optimización da resultados suficientes para generar un único higamplicón h calidad. Alternativamente, el rediseño de cebadores es un buen enfoque para conjuntos de cebadores que no producen un solo amplicón. Para aquellas regiones donde rediseño no es adecuado o posible, degenerar conjuntos de primer incluyendo tanto pueden trabajar de citosina y timina de CpG en los sitios en los cebadores directos y adenina y guanina de de en los sitios CpG en cebadores inversos. Sin embargo, estos conjuntos de cebadores necesitan una mayor optimización para asegurar que no se está produciendo PCR sesgo, un proceso fuera del alcance de este protocolo. Bibliotecas de calidad son extremadamente importantes para el éxito. Asegúrese de que las medidas de control de calidad se llevan a cabo para determinar el tamaño, la calidad y cantidad de las bibliotecas antes de la secuenciación. Las reacciones de secuenciación son propensos a fallas con el aporte de las bibliotecas de baja calidad. Sesgo en la cuantificación de metilación puede ser mitigado por garantizar que las frecuencias de metilación están presentes tanto en avance y retroceso secuenciación lee. Además, las puntuaciones de calidad de las bases de la alineación de los sitios CpG deben ser ≥Q30 para alta confidence en la cuantificación. Mientras que otros han demostrado previamente poco o ningún sesgo en las reacciones tagmentation de ADN convertido bisulfito 19, garantizando los parámetros descritos anteriormente permite la confirmación de la baja cuantificación metilación sesgo. BSAS actualmente mide la metilación en sitios CpG, sin embargo, las futuras ampliaciones de este método permitirá que las mediciones pareadas de CpG 5-HMC con la adición de etapas experimentales distinguiendo entre 5-mC y 5-HMC como la introducción de perrutenato de potasio antes de la conversión de bisulfito 24. Esto aumentará el impacto de utilidad BSAS permitiendo para la metilación emparejado, tanto los datos de expresión 5-mC y 5-HMC, y con el fin de determinar la expresión de genes funciones de regulación de la metilación del ADN. Preparación biblioteca mediada por transposome de amplicones de PCR da lugar a la disminución de la profundidad de secuenciación en los extremos de las regiones amplificadas. Por lo tanto, las regiones de alto interés deben ser diseñados para residir en el medio de amplicones. Cómonunca, porque BSAS genera secuenciación leer profundidades de&gt; 1000 X, la precisión cuantitativa de 5-mC mediciones cerca de los extremos de las regiones amplificadas sigue siendo alta.

Ha pasado más de medio siglo desde el primer informe de origen natural modificaciones del ADN en forma de citosina metilación 1. Metilación de citosina es una base de nucleótido citosina modificada donde el 5º de carbono en el anillo de base tiene un grupo metilo (5-mC), que se producen con más frecuencia en el motivo dinucleótido CpG en genomas de mamíferos. La presencia funcional de 5-mC en los promotores de genes se asocia generalmente con la represión transcripcional, mientras que la ausencia se asocia con la actividad transcripcional 2. Grandes avances se han hecho en nuestra comprensión del papel de la metilación del ADN en desarrollo 3, propagación TransGeneration de perfiles epigenéticos 4, la patogénesis del cáncer de 5,6, y una serie de otras áreas de investigación. Muchos de estos avances han llegado en los últimos años a medida que se han desarrollado nuevas metodologías para perfilar la metilación del ADN 7. Con el advenimiento ypopularización de secuenciación (NGS) técnicas de última generación en la actualidad hay una serie de métodos para perfilar la metilación del ADN a través de todo un genoma o grandes regiones de un genoma 8. Estos enfoques abren la posibilidad de realizar estudios de descubrimiento que cuantifican los patrones y las diferencias en la metilación del ADN de metilación del ADN. Además de estos métodos de generación de hipótesis, hay una necesidad significativa de ADN pruebas de métodos de cuantificación de metilación específica / hipótesis. Pirosecuenciación, PCR específica de metilación y la secuenciación directa de ADN Sanger convertida bisulfito han sido los métodos más utilizados para el análisis de regiones específicas (es decir, una región promotora de un gen o de una isla CpG) 9-12. Todos estos métodos se basan en la conversión de bisulfito, una reacción química donde la desaminación de la citosina no metilada se convierten en uracilo de, mientras que la citosina metilados permanecen intactos 13,14. Amplificación por PCR de bisulfite-Los resultados de ADN convertidos en sustitución de de uracilo con timina 15 que permiten la metilación diferencial a leer como una diferencia de base. Aunque muy útil, las limitaciones a estos métodos incluyen baja precisión cuantitativa, la longitud de lectura corta, y bajo rendimiento de la muestra. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado un método que hemos llamado bisulfito Amplicon Secuenciación (BSAS) 16. El objetivo de este método es ser capaz de analizar diana regiones genómicas de interés en un gran número de muestras con alta precisión cuantitativa. BSAS utiliza elementos de los métodos existentes (la conversión de bisulfito y la amplificación por PCR específica de la región) y los combina con una construcción simple de próxima generación biblioteca (transposome mediada) 17 y de sobremesa NGS 18 (Figura 1). Este enfoque proporciona un método rendimiento más cuantitativa y superior para examinar la metilación de citosina en cualquier región de interés. Aquí presentamos elmétodo en detalle y describir enfoques para la resolución de problemas y la calidad de comprobar el proceso BSAS.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanlyzer</td><td>Agilent</td><td>G29393AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9200</td><td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP - PCR Purificación</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación básica PowerPac</td><td>Bio Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>twin.tech placa PCR 96&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>semifaldón</td></tr><tr><td>Película de termosellado</td><td>Eppendorf</td><td>0030127838</td><td></td></tr><tr><td>Lámina de termosellado</td><td>Eppendorf</td><td>0030127854</td><td></td></tr><tr><td>Termosellador</td><td>Eppendorf</td><td>5390000.024</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10 &#956; l Puntas</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.002</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &#956; l Puntas</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.045</td><td></td></tr><tr><td>50-1,000 &#956; l Consejos</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.100</td><td></td></tr><tr><td>MixMate&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5353000.014</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030121.023</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424000.010</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT Kit de preparación de muestras de ADN</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>24 rxn</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT Index Kit</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>24 índices</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/systems/miseq.html">MiSeq Desktop Sequencer</a></td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html">MiSeq Kit de reactivos v2</a></td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 ciclos</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Kit de qPCR universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA kit de ensayo</td><td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen Kit de ensayo de ARN</td><td>Life Technologies</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR ProFlex de 96 pocillos</td><td>Life Technologies</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Novex 6% Gel de ADN TBE</td><td>Life Technologies</td><td>EC6261BOX</td><td>10 pocillos</td></tr><tr><td>Novex TBE Running Buffer</td> Life <td>Technologies</td><td>LC6675</td><td>5x (1 L)</td></tr><tr><td>Novex Tampón de muestra TBE de alta densidad</td><td>Life Technologies</td><td>LC6678 5x</td><td>(10 ml)</td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell Life</td><td>Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10 mg/ml Bromuro de etidio</td><td>Life Technologies</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Sistema de PCR rápida en tiempo real</td><td>Life Technologies</td><td>4329001</td><td>bloque de 384 pocillos</td></tr><tr><td>DynaMag-96 con faldón lateral</td><td>Life Technologies</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>SpectroMax M2 Multimodo Lector de microplacas</td><td>Molecular Devices/VWR</td><td>89429-532</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep Mini kit de ADN/ARN</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de acero inoxidable</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>5 mm</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Software para tubería de metilación</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Retsch/Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato TRIS</td><td>Sigma</td><td>PHG0002-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de faldón completo de 384 pocillos, estándar</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1384</td><td></td></tr><tr><td>Sello absoluto qPCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Metilación-Kit de rayos</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>ZymoTaq ADN polimerasa</td><td>Zymo Research</td><td>E2001</td><td>50 rxn</td></tr></tbody></table>

dirigida análisis de metilación del adn mediante secuenciación de próxima generación

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

El papel de los procesos epigenéticos en el control de la expresión génica se conoce desde hace varios años. La metilación del ADN en los residuos de citosina es de particular interés para los estudios epigenéticos, ya que se ha demostrado que es un regulador dinámico y duradero de la expresión génica. Los esfuerzos para examinar los cambios epigenéticos en la salud y la enfermedad se han visto obstaculizados por la falta de métodos cuantitativamente precisos y de alto rendimiento. Con el advenimiento y la popularización de las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), estas herramientas ahora se aplican a la epigenómica, además de las metodologías genómicas y transcriptómicas existentes. Para las investigaciones epigenéticas de la metilación de la citosina en las que se han identificado regiones de interés, como promotores de genes específicos o islas CpG, y existe la necesidad de examinar un número significativo de muestras con alta precisión cuantitativa, hemos desarrollado un método llamado secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS). Este método combina la conversión de bisulfito con la amplificación dirigida de regiones de interés, la construcción de bibliotecas mediada por transposomas y la NGS de sobremesa. BSAS ofrece un método rápido y eficiente para el análisis de hasta 10 kb de regiones objetivo en hasta 96 muestras a la vez que puede ser realizado por la mayoría de los grupos de investigación con conocimientos básicos de biología molecular. Los resultados proporcionan una cuantificación absoluta de la metilación de la citosina con especificidad de bases. El BSAS se puede aplicar a cualquier región genómica de cualquier fuente de ADN. Este método es útil para estudios de prueba de hipótesis de regiones objetivo de interés, así como para la confirmación de regiones identificadas en análisis de metilación de todo el genoma, como la secuenciación de bisulfito de genoma completo, secuenciación de bisulfito de representación reducida y secuenciación de inmunoprecipitación de ADN metilado.

BSAS lee correctamente alineado con la secuencia de referencia convertida se parecerá a la Figura 5. Dinucleótidos CpG pueden ser claramente identificados y estados de metilación pueden estimarse mediante la observación de base de las llamadas en los sitios CpG en lee el mapeado. Por ejemplo, con controles de metilación, 0% de metilación se traducirá en todo el lecturas asignan a sitios que contienen CpG de T (Figura 5A). 100% de los controles de metilación se traducirá en todo el mapeado lee lee a los sitios que contienen CpG de C (Figura 5B). La cuantificación de la frecuencia de la citosina (C T / C +) en los sitios CpG se obtiene la frecuencia de metilación en la muestra original. Una curva estándar generada representante de los controles de metilación de todo el genoma (n = 3 de relación / metilación) muestra la linealidad de la cuantificación de metilación, así como precisión en la cuantificación en cada relación de metilación (Figura 6). Como un ejemplo de este método en total, ARN y ADN fueron co-iso<html> lada de cerebelo de ratón y la retina (n = 4 / grupo). Expresión rodopsina, expresado selectivamente en tejido de la retina, se midió utilizando qPCR. Expresión sólo se detectó en la retina (Figura 7A). Usando BSAS, los niveles de metilación de CpG se cuantificaron en la región promotora de la rodopsina. Los niveles de metilación acumulados a través de la región del promotor fueron&gt; 80% en el cerebelo en comparación con &lt;15% en la retina (p &lt;0,001, t-test paramétrico) (Figura 7B). BsAs beneficios de cuantificación de metilación metilación cuantificación específica de sitio, y los niveles de metilación se pueden comparar de forma específica de CpG a través de cualquier región genómica dado. Niveles de metilación CpG en todo el promotor rodopsina fueron significativamente mayores en las muestras del cerebelo cuando se compara con muestras de retina (p &lt;0,001, paramétrica t-test en cada sitio CpG) (Figura 7C). 1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Esquemática del método de BSAS En este método, el ADN genómico es bisulfito convertida para modificar las citosinas no metilación a uracilos. Posteriormente, durante la PCR estos uracilos se cambian a timinas. La amplificación por PCR se dirige contra las regiones de interés y altamente enriquece por sólo estas secuencias. Los amplicones de PCR resultantes se convierten en bibliotecas de doble indexado a través de un proceso de tagmentation simple. Posteriormente, las bibliotecas están secuenciados en un secuenciador de última generación de sobremesa y la secuenciación lee se asignan a la secuencia de referencia in silico convertido y ciento metilación de la citosina de se determina de forma-base específica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> Figura 2:. En silico conversión de bisulfito de región de interés Cualquier región de interés de toda referencia genómica puede ser selected para in silico bisulfito de conversión. Citosinas no CpG se sustituyen con la timina de la secuencia de referencia. Citosinas CpG permanecen citosinas en el bisulfito convierten referencia. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Cebadores colocación Primer bisulfito de PCR se diseñan contra un bisulfito en silico secuencia de referencia convertidos. Los cebadores deben ser diseñados de manera que no se superpongan dinucleótidos CG, o diseñado junto a dinucleótidos CG. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> Figura 4: Ejemplos de amplicones altas y pobres de PCR calidad y bibliotecas de secuenciación rastros electropherogram representativos y gel espectáculo (A) amplicón ideal para la generación de bibliotecas transposome mediada con un solo alto.producto de concentración. (B) Biblioteca generada a partir de este amplicón muestra una alta concentración y una distribución uniforme de tamaño. (C) Mala amplicones de PCR de calidad puede ser baja en tamaño, concentración y contiene múltiples productos y / o dímeros de cebadores. Estos amplicones de mala calidad dará lugar a (D) no generación biblioteca con baja concentración y distribución de baja capacidad. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> Figura 5: Ejemplos de salidas de secuenciación de los controles de metilación. (A) En silico convierte secuenciación de referencia con sitios CpG resaltado en rojo. 0% de control de la metilación del mapeado lee a los timinas seleccionados región mostrando (iluminaciones codicia) de mapeo en sitios CpG. De control (B) 100% metilación asignada lee mostrar (punto culminante azul) mapeo de citosina en los sitios CpG. Figura 6:. Cuantificación de metilación a través de una gama de controles de metilación controles de metilación de todo el genoma mezclados en proporciones de metilación (n = 3 / ratio) de 0% a 100% se cuantificaron utilizando BSAS. Trazado de cuantificación de espera frente cuantificada demuestra la linealidad de la cuantificación de control de la metilación. En todos los controles, hubo una alta precisión en la cuantificación de metilación. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> Figura 7: Ejemplo de la metilación del ADN y la expresión génica análisis pareado de muestras de tejido. (A) La rodopsina relativa expresión de mRNA de cerebelosa ratón y tejido de la retina. (B) La rodopsina promedio metilación promotor cuantificado por BSAS entre cerebelo y el ADN de la retina (*** p &lt;0,001, paramétrica t-test). &lt;strong&gt; los niveles de metilación C) sitio-específica CpG través promotor rodopsina (-244 a 6, en relación al sitio de inicio de transcripción [SST]) en el cerebelo del ratón y ADN retina.

La secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS) es un método para cuantificar la metilación de citosina en regiones genómicas específicas de interés. Este método utiliza la conversión de bisulfito emparejada con la amplificación por PCR de las regiones objetivo antes de la secuenciación de próxima generación para producir una cuantificación absoluta de la metilación del ADN a un nivel específico de base.

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la metilación de CPG en regiones diana de interés a partir de ADN genómico aislado de tejidos o células de interés. Esto se logra primero diseñando cebadores específicos de PCR para bisulfito que amplifiquen las regiones de interés a partir de ADN genómico convertido con bisulfito. En el segundo paso, se amplifica la región de interés convertida con bisulfito y se generan bibliotecas de secuenciación de nueva generación o NGS a partir de los amplicones cons.A continuación, se realiza la secuenciación de las bibliotecas y se generan archivos FASTQ para el análisis. En el último paso, las lecturas de secuenciación se alinean con la secuencia diana de referencia convertida por bisulfito, y el porcentaje de 5mC se calcula finalmente mediante la secuenciación de amplicones de bisulfito o BS A S, que puede realizarse para cuantificar con precisión y exactitud la metilación de CPG en cualquier región de interés de cualquier organismo modelo. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como la secuenciación de Sanger es que BS A S proporciona una cuantificación precisa y exacta de la metilación de CPG de manera rápida y de alto rendimiento, ofreciendo la posibilidad de analizar múltiples regiones en un gran número de muestras.Después de identificar el objetivo y diseñar el cebador, ensamble la reacción para la optimización de la amplificación del objetivo de un solo amplicón, y luego selle una placa de PCR con una película termosellada para visualizar los amplicones mediante electroforesis en gel. A continuación, cargue los pozos adecuados con 30 microlitros de las reacciones de PCR o con marcador de peso molecular, y luego corra el gel a 200 voltios durante aproximadamente 45 minutos. Cuando el primer tinte alcance el extremo del gel, detenga la reacción y luego cubra todo el gel con cinco microgramos por mililitro de bromuro de AUM recién preparado.Después de cinco minutos, obtenga una imagen del gel mediante un transiluminador UV con una longitud de onda de excitación de 482 nanómetros. Utilice la escalera para determinar el tamaño de los AMPLICONES de PCR y así evaluar la especificidad de la reacción. Busque múltiples bandas distintas del tamaño esperado del amplicón para determinar el tamaño promedio de los picos de la biblioteca detectados y una estimación de la molaridad.A continuación, ejecute las bibliotecas en un chip de electroforesis capilar para determinación de tamaño de ADN con un ensayo de ADN de alta sensibilidad según las instrucciones del fabricante. Para cuantificar las bibliotecas mediante qPCR, use cebadores diseñados frente a las secuencias de adaptador en las bibliotecas generadas y estándares con una concentración conocida en un instrumento en tiempo real, utilizando la configuración de cuantificación absoluta según las instrucciones del fabricante.Luego, utilice el tamaño de las bibliotecas y la cuantificación molar proveniente de la QPCR para calcular las concentraciones molares de las bibliotecas. Después de la secuenciación, importe los archivos fastQ comprimidos en la tubería de análisis de secuenciación adecuada, seleccione importar y luego seleccione el método de secuenciación utilizado para generar las lecturas, a fin de conservar las puntuaciones Q para las aplicaciones de recorte de lecturas. Importe los archivos de lecturas fastQ comprimidos apropiados y, a continuación, en las opciones generales, desactive descartar las puntuaciones de calidad.Seleccione una ubicación para las lecturas importadas y haga clic en finalizar. Luego, en las herramientas principales de NGS, seleccione recortar secuencias. Resalte las lecturas que se van a recortar, conservando únicamente las lecturas que contienen puntuaciones mayores o iguales a Q 30.Luego, seleccione el recorte utilizando las puntuaciones de calidad y establezca el límite en 0.001. Para seleccionar además solo las lecturas que contengan menos de o igual a un nucleótido ambiguo, seleccione recortar nucleótidos ambiguos y establezca el número máximo de ambigüedades en uno.A continuación, seleccione una ubicación para guardar las lecturas recortadas y haga clic en finalizar para mapear las lecturas recortadas con la referencia génica convertida in silico mediante sulfito. En las herramientas principales de NGS, seleccione mapear lecturas. Como referencia, seleccione las lecturas recortadas que se van a mapear y haga clic en siguiente.Luego, bajo la mascaración de referencia, seleccione la secuencia de referencia convertida y seleccione sin mascar. Haga clic en siguiente y luego asigne una puntuación de tres para desajustes, inserciones y eliminaciones. Asigne una puntuación de uno para la fracción mínima de la longitud de lectura que se asocia a la referencia y asigne una puntuación de 0,9 para la fracción mínima de identidad entre el segmento asociado, la lectura y la referencia; bajo el manejo de coincidencias no específicas, seleccione ignorar y haga clic en Siguiente en las opciones de salida.A continuación, seleccione Crear mapeos independientes de lecturas. Luego, en el manejo de resultados, haga clic en guardar. Seleccione una ubicación para guardar el mapeo de lecturas y haga clic en finalizar para ejecutar la identificación de variantes sobre las lecturas mapeadas.En el análisis de re-secuenciación, seleccione la detección de variantes de baja frecuencia y elija el mapeo de lecturas que se analizará. Haga clic en siguiente y luego, en los parámetros de variantes de baja frecuencia, ingrese 0,01 % y haga clic en siguiente. En los filtros generales, establezca la cobertura mínima en 1000 para asegurar que la secuencia tenga una profundidad mayor o igual a 1000 x.Finalmente, haga clic en siguiente y luego, bajo opciones de salida, seleccione crear tabla anotada y elija una ubicación para guardar el archivo de tabla de variantes. Haga clic en finalizar y utilice las frecuencias de variantes en los sitios CPG anotados en la región de interés del archivo de tabla de variantes para calcular la frecuencia de metilación de citosina en una citosina de referencia en contexto CG. Las lecturas de secuenciación por amplicón con bisulfito alineadas correctamente a la secuencia de referencia convertida tendrán un aspecto similar al ilustrado en la figura. Los dinucleótidos CPG pueden identificarse claramente y los estados de metilación pueden estimarse observando las llamadas de bases en los sitios CPG. En las lecturas alineadas, una metilación del 0 % dará lugar a lecturas alineadas que contienen timina en los sitios CPG.Los controles de metilación al 100 % darán como resultado lecturas alineadas que contienen citosinas alineadas a sitios CPG. En este experimento, se coaislaron ARN y ADN de un ratón, del cerebelo y de la retina. Luego, se midió la expresión de opsinas, expresadas selectivamente en el tejido retinal, mediante QPCR, tal como se esperaba.El ARN de opsina se detectó únicamente en la retina tras la cuantificación de los niveles de metilación de CPG en la región promotora de Opsin mediante secuenciación de amplificación con bisulfito. Sin embargo, los niveles acumulados de metilación a lo largo de la región promotora fueron superiores al 80 % en el cerebelo, en comparación con menos del 15 % en la retina. La cuantificación de metilación mediante B SAS se beneficia de la cuantificación específica por sitio, permitiendo la comparación de los niveles de metilación en una base específica de CPG en cualquier región genómica dada.De hecho, en este experimento, se encontró que los niveles de metilación de CPG en el promotor de la opsina eran significativamente más altos en las muestras cerebelosas en comparación con las muestras de retina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la metilación de CPG en regiones diana de interés a partir de ADN genómico, aislado de tejidos o células.

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