Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la metilación de CPG en regiones específicas de interés a partir del ADN genómico, aislado de tejido o células de interés. Esto se logra diseñando primero cebadores de PCR específicos para sulfitos para amplificar regiones de interés a partir de ADN genómico convertido en bisulfito. En el segundo paso, se amplifica la región de interés convertida en bisulfito y se generan secuenciaciones de próxima generación o bibliotecas NGS a partir de los amplicones cons.

A continuación, se secuencian las bibliotecas y se generan archivos FASTQ para su análisis. En el paso final, las lecturas de secuenciación se alinean con la secuencia objetivo de referencia convertida en bisulfito, y el cinco mc por ciento se calcula en última instancia mediante secuenciación de amplicón de sulfito o se puede realizar una media base para cuantificar con precisión y exactitud la metilación de CPG en cualquier región de interés de cualquier organismo modelo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la secuenciación de Sanger, es que BS A S proporciona una cuantificación precisa y precisa de la metilación de CPG de una manera rápida y de alto rendimiento, lo que brinda la oportunidad de analizar múltiples regiones en un gran número de muestras.

Después de identificar el objetivo y diseñar el cebador, ensamble la reacción para la optimización de la amplificación del objetivo de un solo amplicón y, a continuación, selle una placa de PCR con una película termosellada para visualizar los amplicones mediante electroforesis de página. A continuación, cargue los pocillos apropiados con 30 microlitros de reacciones PCR o escalera, y luego haga correr el gel a 200 voltios durante aproximadamente 45 minutos. Cuando el primer tinte llegue al final del gel, detenga la reacción y luego cubra todo el gel con cinco microgramos por mililitro de bromuro AUM recién preparado.

Después de cinco minutos, obtenga una imagen del gel a través de un transluminador UV a una longitud de onda de excitación de 482 nanómetros. Utilice la escalera para dimensionar los amplicones de PCR para determinar la especificidad de la reacción. Busque varias bandas distintas del tamaño de amplicón esperado para determinar el tamaño promedio de los picos de la biblioteca detectados y una estimación de la molaridad.

A continuación, ejecute las bibliotecas en un chip de dimensionamiento de ADN por electroforesis capilar con un ensayo de ADN de alta sensibilidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cuantificar las librerías por QPCR. Utilice cebadores diseñados contra las secuencias de adaptadores en las bibliotecas y estándares generados con una concentración conocida en un instrumento en tiempo real, utilizando los ajustes de cuantificación absoluta de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

A continuación, utilice el tamaño de las bibliotecas y la cuantificación molar de la QPCR para calcular las concentraciones molares de las bibliotecas. Después de la secuenciación, importe los archivos Q rápidos comprimidos en la canalización de análisis de secuenciación adecuada, seleccione importar y, a continuación, seleccione el método de secuenciación utilizado para generar las lecturas para conservar las puntuaciones Q para las aplicaciones de recorte de lectura. Importe los archivos de lectura rápida Q comprimidos adecuados y, a continuación, en opciones generales, anule la selección de descartar puntuaciones de calidad.

Seleccione una ubicación para las lecturas importadas y haga clic en finalizar. A continuación, en Herramientas principales de NGS, seleccione secuencias de recorte. Resalte las lecturas que se van a recortar, conservando solo las lecturas que contengan puntuaciones mayores o iguales a Q 30.

A continuación, seleccione el recorte utilizando las puntuaciones de calidad y establezca el límite en 0,001. Para seleccionar solo las cañas que contengan menos o igual a un nucleótido ambiguo. Seleccione recortar nucleótidos ambiguos y establezca el número máximo de ambigüedades en uno.

A continuación, seleccione una ubicación para guardar las lecturas recortadas y haga clic en finalizar para asignar la resolución recortada a la referencia de gen in silico por sulfito convertido. En Herramientas principales de NGS, seleccione Lecturas de mapas. Como referencia, seleccione las lecturas recortadas que se van a asignar y haga clic en Siguiente.

A continuación, en Enmascaramiento de referencia, seleccione la secuencia de referencia convertida y seleccione sin enmascaramiento. Haga clic en Siguiente y, a continuación, asigne una puntuación de tres para las discrepancias, las inserciones y las eliminaciones. Asigne una puntuación de uno para la fracción mínima del mapa de longitud de lectura a la referencia y asigne una puntuación de 0,9 para la fracción mínima de identidad entre el mapa, la lectura y la referencia en Manejo de coincidencias no específicas, seleccione, ignore y haga clic en Siguiente en las opciones de salida.

A continuación, seleccione Crear asignaciones de lectura independientes. A continuación, en Gestión de resultados, haga clic en Guardar. Seleccione una ubicación para guardar la asignación de lecturas y haga clic en finalizar para ejecutar la llamada a la variante en las lecturas asignadas.

En Análisis de resecuenciación, seleccione la detección de variantes de baja frecuencia y elija la asignación de lectura que se va a analizar. Haga clic en siguiente y, a continuación, en el parámetro de variante de baja frecuencia, introduzca 0,01% y haga clic en siguiente. En filtros generales, establezca la cobertura mínima en 1000 para asegurarse de que la secuencia esté a una profundidad mayor o igual que 1000 x.

Finalmente, haga clic en siguiente y, a continuación, en opciones de salida, seleccione crear tabla anotada y seleccione una ubicación para guardar el archivo de tabla de variantes, haga clic en finalizar y use las frecuencias de variantes en los sitios de CPG anotados en la región de interés del archivo de tabla de variantes para calcular la frecuencia de la metilación de la citosina en una citosina de referencia en el contexto de CG mediante lecturas de secuenciación de amplicones de sulfito correctamente alineadas con la secuencia de referencia convertida se parecerán a las ilustradas en la figura. Los dinucleótidos de CPG se pueden identificar claramente y los estados de metilación se pueden estimar observando las llamadas de base en los sitios de CPG. En las lecturas asignadas, la metilación del 0% dará como resultado lecturas mapeadas que contienen timina asignada a los sitios CPG.

Los controles de metilación del 100% darán como resultado lecturas mapeadas que contienen citosinas mapeadas a sitios CPG. En este experimento, el ARN y el ADN se aislaron conjuntamente de un ratón, un cerebelo y una retina. La expresión de opsina expresada selectivamente en el tejido de la retina se midió mediante QPCR, como se esperaba.

El ARN de opsina se detectó solo en la retina después de la cuantificación de los niveles de metilación de CPG en la región promotora de opsina mediante secuenciación de amplificación de bisulfito. Sin embargo, los niveles acumulativos de metilación a través de la región promotora fueron superiores al 80% en el cerebelo en comparación con menos del 15% en la retina. La cuantificación de la metilación de B SAS se beneficia de la cuantificación de metilación específica del sitio, lo que permite la comparación de los niveles de metilación sobre una base específica de CPG en cualquier región genómica dada.

De hecho, en este experimento, se encontró que los niveles de metilación de CPG a través del promotor de opsina eran significativamente más altos en las muestras cerebelosas en comparación con las muestras de retina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la metilación de CPG en regiones específicas de interés a partir del ADN genómico, aislado de tejidos o células.