Name: Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprende a capturar imágenes de superresolución de sinapsis inmunológicas de células NK usando microscopía STED y bicapas lipídicas soportadas en vidrio. Este protocolo permite visualizar el citoesqueleto de actina y gránulos líticos con detalle.

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Agradecemos a Emily Mace y Malini Mukherjee por el análisis de imágenes y deconvolución. El trabajo en el laboratorio de Liu fue financiado en parte por la Subvención de Apoyo Principal número AI36211 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, el Fondo Caroline Wiess Law para la Investigación en Medicina Molecular, el Fondo de Investigación Pediátrica del Hospital Infantil de Texas y el Programa de Investigación del Desarrollo del Linfoma SPORE del Colegio de Medicina Baylor y el Instituto de Investigación Metodista.

1. Preparación de liposomas <ol><li> Calcular la cantidad de soluciones madre de cloroformo-suspendido de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y biotinil 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-cap (biotina-PE) para hacer stocks diluido a la concentración final deseada. Para hacer concentraciones finales de 400 mM y 80 mM DOPC fosfolípidos biotina-PE en 10 ml cada uno, iniciar mediante la colocación de 629 l de 10 mg / ml DOPC y 88 l 10 mg / ml de biotina-PE en tubos de vidrio de cromatografía separadas. NOTA: es importante limpiar vidrio Hamilton jeringas y tubos de vidrio de cromatografía por la solución de (1 L 95% de etanol a 120 ml de agua que contiene hidróxido de potasio 60 g, KOH) de limpieza, durante la transferencia de solución de cloroformo-suspendido de DOPC y biotina-PE. </li><li> Se seca el cloroformo con una corriente de argón en la campana química. Sellar el tubo para cromatografía de parafina. </li><li> Someter los liposomas recién secadas a un alto vacío en un lyophilizer O / N para eliminar cualquier cloroformo residual. Para la finalización del mismo día, seco durante 60-90 min. </li><li> Mientras se ejecuta el liofilizador, preparar un poco de tampón de dilución. Para este protocolo, se preparan 25 ml que consta de 25 mM Tris, pH 8,0; NaCl 150 mM; y 2% (en peso) n-octil-β-D-glucopiranósido (OG) de detergente. Mezclar los dos primeros ingredientes juntos primero, a continuación, desplazar el oxígeno con argón antes de añadir el polvo OG seco. Después de la preparación, se filtra la solución OG con membrana de acetato de celulosa de 0,2 micras, y se almacena a 4 ° C. </li><li> Además, preparar dos botellas con tapa de rosca de 1 L de tampón Tris-solución salina en las mismas concentraciones, pero sin OG. Coloque una barra de agitación magnética limpiado de agua destilada en el fondo de cada uno. Preparar 6 litros adicionales de la tampón Tris-solución salina. Eliminar el oxígeno de todas las botellas con argón y colocarlos a 4 ° C también. </li><li> Después de la liofilización, disolver los lípidos secos en el búfer OG Tris-solución salina para hacer una solución 4 mM de cada uno. Siguiendo el ejemplovolúmenes, añadir 2 ml al tubo DOPC y 0,2 ml al tubo biotina-PE. </li><li> Mezclar los lípidos biotina-PE con los lípidos DOPC. Esto mejora la movilidad de la SLB, como la biotina acoplada puede afectar la fluidez de los grupos de cabeza de fosfato. Para hacer una concentración final de 80 mM biotina-PE, mezclar 0,2 ml de 4 mM biotina-PE y 1 ml de 4 mM DOPC. A continuación, añadir 8,8 ml del tampón de Tris-solución salina OG. </li><li> Para obtener una concentración final de 400 mM DOPC, simplemente mezclar 1 ml de 4 mM DOPC con 9 ml de Tris-solución salina OG. </li><li> Llenar el baño de ultrasonidos con agua con hielo. Poner el tubo de vidrio que contiene el fosfolípido diluido en el centro de la sonicador mediante el uso de una abrazadera de utilidad. Sonicar fosfolípido diluido durante 10 minutos hasta que la solución se aclare. NOTA: Agregar hielo en el baño de agua de ultrasonidos para mantener la temperatura baja, ya sonicación generará calor. </li><li> Llene los tubos con argón para desplazar el oxígeno en el aire por encima del líquido, y sellarlos con parafilm. </li></ol&gt; 2. La diálisis de liposomas <ol><li> Cortar dos secciones de tubo de diálisis seco (peso molecular de corte: 12-14,000, diámetro: 6,4 mm) de longitud adecuada (en este ejemplo, 40 cm), una para cada dilución de fosfolípidos, del rollo. </li><li> Rehidratar las secciones de tubo por lo que les permite remojo en un 200 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de vidrio de 2 min. </li><li> Microondas esto durante 5 minutos a un valor alto, o al menos hasta que el agua empiece a hervir. </li><li> Haga un nudo en un extremo de cada tubo y enjuagar el interior con unos pocos mililitros de tampón Tris-salina-OG. A partir de entonces, meticulosamente exprimir la mayor cantidad de este tampón de lavado como sea posible para reducir al mínimo la cantidad de tampón que queda dentro. </li><li> En una campana de flujo laminar, añadir los fosfolípidos diluidas en cada tubo y sujetar los extremos abiertos con un pequeño cierre del tubo de diálisis a fin de excluir todo el aire. La exclusión de aire completa requerirá el sacrificio de un pequeño volumen de la muestra por debajo de la sujeción y# 8220; la línea de agua &quot;. </li><li> Sumergir las muestras en las botellas de tampón Tris-solución salina previamente preparadas sin OG. Desplazar el oxígeno en la botella con argón antes de re-sellado y lugar para agitar O / N a 4 °. </li><li> Transferir el tubo en una nueva botella de tampón Tris-solución salina sin OG cada 12 h durante al menos 3 veces. </li><li> Poco antes de la extracción de los lípidos dializados, preparar una serie de pequeños tubos en el que los lípidos alícuota llenando cada uno con argón para desplazar el oxígeno. </li><li> Después de 36 h, tomar las botellas de diálisis en la campana de flujo laminar y retirar los tubos de diálisis de las botellas. Tener un pañal banco o vaso en la mano para recoger la escorrentía mojado. </li><li> Cortar el tubo de diálisis por encima del clip, a continuación, retire el clip y transferir cuidadosamente la solución de lípidos se dializa a través de una pipeta en alícuotas de 1 ml en tubos de pre-preparados llenos de gas argón en el hielo. </li><li> Alícuota de la solución acuosa de liposomas, use el flujo de argón para desplazar el oxígeno de nuevo in cada tubo. </li><li> Guarde los liposomas a 4 °. No lo congele. </li></ol> 3. Determinación de la densidad de anticuerpos en la bicapa lipídica <ol><li> Preparar una serie de diluciones de biotinilado, el anticuerpo marcado con fluorescencia-, 50 l de volumen para cada dilución, en las siguientes concentraciones: 0 nM (en blanco), 10 nM, 50 nM, 100 nM, y 500 nM. (De aquí en adelante referido como &quot;serie de muestras&quot;). </li><li> Añadir 1 l de perlas de sílice en 6 pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo en v. Asegúrese de agitar las bolas antes de pipeteado, ya que tienden a asentarse. NOTA: Si haber ordenado los granos secos en lugar de suspendido, siga las instrucciones del fabricante para diluir. </li><li> Para estas cuentas, añadir 2 l de DOPC mixta: fosfolípidos biotinil en una relación 1: 1. Haga esto para cada bien. </li><li> Pulso la placa en un agitador vórtex en resistencia media 3 veces durante 10 s cada uno para fomentar la interacción con los granos y los fosfolípidos. </li><li> Añadir 150 l de 5% CASein a cada pocillo. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo tres veces. </li><li> Deje que la placa se incuba en la solución de caseína durante 10 minutos, luego lavar a cabo. Para lavar, llenar cada pocillo para un volumen total de 250 l con solución salina tamponada con HEPES (HBS) con albúmina 1% de suero humano (HSA). Se centrifuga a 1.000 xg durante 2 min. Pipeta y deseche las 200 l de sobrenadante y repetir dos veces para un total de tres ciclos de lavado. </li><li> Añadir 50 l de estreptavidina a un / ml de concentración 333 ng. Pulso de la placa de nuevo 3 veces 10 segundos, y dejar que repose en un agitador durante 15 min. Lave 3x como en el paso 6 para eliminar estreptavidina no unida. </li><li> Añadir 50 l de anticuerpo biotinilado marcado con fluorescencia a partir de la serie de dilución preparada previamente (ver paso 3,1) a cada pocillo, y reemplazar la placa en el agitador durante 20-30 min. Lave 3x como en el paso 6 para eliminar el anticuerpo no unido. </li><li> Después del lavado final, resuspender las perlas en 100 l de HBS / 1% de HSA, a continuación, transferir a un tubo de FACS. Repita esto dos veces alasegurar la eliminación eficaz de todos los cordones del pozo, para un total de 300 l, y hacer esto para cada pozo. </li><li> Traiga los tubos resultantes para el citómetro de flujo. Es tiempo para leerlos. </li><li> Añadir 1 gota de la botella marcada &quot;B&quot; desde el kit de calibración de la intensidad de fluorescencia de perlas (FIC) (denominado en lo sucesivo como &quot;serie estándar&quot;) a un tubo de FACS, y se diluye con 300 l de HBS / 1% de HSA. </li><li> Leer este tubo, pero no hay que registrar los datos por el momento. Por ahora, sólo tiene que asegurarse de que las cuentas en blanco están correctamente puestos a cero. Hacer un histograma que muestra la fluorescencia de las perlas medidos en el canal adecuado, a continuación, cambiar el voltaje del láser de excitación hacia abajo hasta que el pico está en el lado extremo izquierdo del histograma. </li><li> Retire el tubo y añadir 1 gota de cada uno de los otros 4 tubos en la serie (con la etiqueta 1 a 4) al mismo tubo. Ahora, coloque el tubo en la máquina de nuevo, y registrar los datos resultantes, que deben aparecer como 5 picos distintos. </li&gt; <li> Lea cada tubo individual de la serie de muestras. </li><li> El uso de software de análisis de FACS, dibujar una puerta que abarca toda la anchura de cada pico en el histograma serie estándar en el punto semi-máxima. Esa es una puerta para cada pico. Haga lo mismo para cada muestra. Nota la IMF (intensidad media de fluorescencia) para cada puerta. </li><li> El uso de un programa de hoja de entrada de los valores de MFI medidos en el lugar apropiado. También la entrada MESF (moléculas de equivalente de Soluble Fluorocromo) valores (número promedio de moléculas fluorescentes que recubren cada perla) para cada botella en la serie estándar. Esta información se puede encontrar siguiendo las instrucciones de la plástica jar los tubos entraron. </li><li> Utilice la hoja de cálculo se trazar la IMF en contra de los valores MESF, la creación de una correlación lineal entre el número de fluoróforos y de la intensidad medida. </li><li> Utilice el módulo de &#39;proteínas y etiquetas&#39; en el espectrofotómetro micro-volumen para determinar la relación de medio de contraste para proproteína en el anticuerpo marcado. </li><li> Introduzca el etiquetado de eficiencia de la proteína de la muestra, el diámetro medio de las perlas recubiertas con lípidos, y el valor de MFI para cada entrada. La hoja de cálculo utilizará automáticamente la fórmula del gráfico de línea generada en la etapa 3.16 para calcular los valores MESF para cada dilución de la proteína y la densidad de siembra de la proteína de la muestra en cada concentración. </li></ol> 4. aislar y cultivar células NK humanas <ol><li> Alícuota de 15 ml de sangre periférica o de la capa leucocitaria en un tubo cónico de 50 ml. Diluir esta sangre con PBS que contenía 1% de FBS en la proporción de 1: 1. </li><li> Añadir 13 ml de Ficoll suavemente a la parte inferior del tubo con una pipeta serológica de 10 ml. </li><li> Centrífuga este tubo durante 20 minutos a 1200 xg con el acelerador y el descanso fuera o en sus valores más bajos. </li><li> Después de la centrifugación, utilizar una pipeta serológica para recoger la capa media flotante blanca turbia de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), wHICH debe sentarse y la intersección entre una capa superior clara amarilla y una capa inferior de color pálido más nublado, ambos de los cuales se sienta encima de una capa inferior de glóbulos rojos (GR). NOTA favor no recoge ningún glóbulos rojos en la recogida de las PBMC. </li><li> Colocar las PBMCs recogidos en un nuevo tubo cónico de 50 ml y diluir a la capacidad con PBS que contenía 1% de FBS. Centrifugar de nuevo, esta vez con el freno y el acelerador al máximo, durante 5 min a 300 x g. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de PBS que contenía 1% de FBS. </li><li> Contar las células, mientras que la centrifugación una vez más con los mismos parámetros que en el paso 4.6. </li><li> Descartar el sobrenadante una vez más, y resuspender las células en medio R10 a una densidad de 10 millones de células / ml. </li><li> Tomar 30 millones de células en un tubo de poliestireno de 5 ml, y aislar las células NK utilizando un kit de separación magnética, siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras el aislamiento, contar las células y resuspender uno más a una densidad de 500,000 células / ml en medio completo R10 (88% RPMI; 10% de FBS; 1% de HEPES; 1% de piruvato de sodio) suplementado con IL-2 (100 U / ml). Cultura a 37ºC en una incubadora de CO 2, y reemplazar medio 2-3 veces a la semana. </li></ol> 5. Montaje de la apoyada por el cristal planar bicapa lipídica <ol><li> Preparar la solución Piranha 100 ml mediante la mezcla de peróxido de hidrógeno al 30% con ácido sulfúrico en una proporción de 1: 3 en un vaso de precipitados. NOTA: Siempre llevar a cabo el trabajo con agentes nocivos como el ácido sulfúrico en una campana de extracción química correctamente designada. </li><li> En esta solución, sumerja 2 rectangulares # 1.5 cubreobjetos en solución de pirañas durante 20-30 min. NOTA: Es esencial para limpiar los cubreobjetos por solución de pirañas. </li><li> Mientras que los cubreobjetos se están limpiando, tome 1 tubo de preparado previamente 400 mu M lípidos DOPC y 1 tubo de 80 mM previamente preparado lípidos biotina-PE. Transportarlos en el hielo en el tanque de argón. </li><li> Desplazar el oxígeno en un nuevo tubo de centrífuga con argón,luego sumar el DOPC y biotina-PE en una relación 1: 1. Volumen específico variará en función de las necesidades experimentales, pero debe estar en un mínimo de 2 l cada uno. Desplazar el oxígeno en el tubo de mezcla una vez más con gas argón, y los tubos de reactivos individuales, así, antes de devolver el último a la nevera. </li><li> Después de que hayan terminado de limpiar, enjuagar bien los cubreobjetos con agua destilada. Establecer los cubreobjetos fuera secar al aire durante unos minutos. </li><li> Retirar 1,5 l de la mezcla de liposoma preparado en la etapa 5.4 y alícuota en una sola gota en una de las cámaras de carril de la diapositiva cámara. El uso de 2 gotas por carril es típico, pero no necesario. </li><li> De forma rápida y eficiente colocar el cubreobjetos seco sobre las gotitas. Asegúrese de que las gotas están suficientemente separados para que no se combinan una vez que se coloca el cubreobjetos. Además, asegúrese de que las gotas permanezcan circular y bien definido, sin tocar los bordes de las paredes de la cámara. Presione hacia abajo con firmezaen entre y alrededor de cada carril para asegurar un sello hermético entre el cubreobjetos y portaobjetos. </li><li> Marque las posiciones de las gotas usando un rotulador </li><li> Pasar 100 l de solución acuosa al 5% de caseína través de la cámara para bloquear la bicapa. Trate de asegurarse de que no hay burbujas en la cámara de flujo. </li><li> Inyectar 100 l de estreptavidina a una concentración de 333 ng / ml en cada carril. Se incuba durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. A partir de entonces, se lava mediante la ejecución de 3 ml de HBS / 1% de HSA a través de cada carril para eliminar el exceso de estreptavidina. </li><li> Añadir 100 l de biotina marcado con fluorescencia anti-CD16 tales como Alexa Fluor 568 en la concentración de proteína determinada previamente para ser más eficaces en la sección 3. Incubar en la oscuridad durante 20-30 min. Lavar a continuación mediante la ejecución de 3 ml de HBS / 1% de HSA a través de cada carril. </li><li> El flujo 100 l de D-biotina en una concentración de 25 nM través de la cámara a fin de obligar cualquier exceso de estreptavidina y por lo tanto eliminar la posibilidad de unión no específica de streptavidin a las células. </li><li> Contar las células NK y resuspender en una concentración de 500.000 / ml en HBS / 1% de HSA. </li><li> Mientras desacelerándose las células, lavar la D-biotina fuera de la cámara con otro 3 ml de HBS / 1% de HSA por carril. </li><li> Compruebe la movilidad de los ligandos en el SLB por FRAP (FRAP) en un total de fluorescencia interno de reflexión (TIRF) o microscopía confocal antes de añadir las células NK. </li><li> Una vez que las células han terminado de hilado y han sido resuspendieron a la concentración deseada, añadir 100 l de cada carril. </li><li> Coloque la cámara en un incubador de CO2 37 ° 5% durante 30-60 minutos. </li><li> Después de este período de incubación, fijar las células con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 10-20 min. Lavar mediante la ejecución de 3 ml de PBS a través de cada carril para eliminar el paraformaldehído. </li><li> Añadir 400 l de tampón de bloqueo (5% de suero normal de burro y 0,2% Tritron X-100 en PBS). Incubar a TA durante 30 min. </li><li> Manchas F-actina y perforina por anuncioding 200 l de diluirse phalloidin fluorescente marcada con (1 unidad / ml phalloidin etiquetado) y la etiqueta fluorescente-anti-perforina MAB (500 mAb ng / ml anti-perforina). Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lave ejecutando 3 ml de PBS. La cámara está listo para la formación de imágenes. </li></ol> 6. Obtención de imágenes de la Synapse NK en bicapa lipídica usando STED <ol><li> Encienda todos los módulos de hardware necesarios. </li><li> Iniciar el software de análisis de imágenes. Habilitar tanto de exploración resonante y módulos STED. Después de hacer estas selecciones, espere aproximadamente 3-5 minutos para que el software para iniciar. </li><li> Haga clic en la pestaña &quot;Configuración&quot; en la parte superior de la pantalla. </li><li> Seleccione &quot;Laser Config&quot; y encienda la luz blanca y STED 592 láseres nm. </li><li> Elija el objetivo 100x, y alinear el haz láser de excitación con el láser agotamiento 592 nm. </li><li> Seleccione el módulo &quot;Laser Config&quot;, apague el agotamiento 592láser, y a su vez en el láser agotamiento 660 nm. </li><li> Colocar el portaobjetos en el escenario, sobre el lente. Traiga las células unidas en la región bicapa demarcada en el foco usando la lámpara de luz blanca y los oculares. </li><li> Vuelva a la ficha &quot;Adquisición&quot;, directamente a la derecha de la pestaña &quot;Configuración&quot;. </li><li> Haga clic en la pestaña &quot;Cambiar a WhiteLight&quot;, a continuación, convertir ese módulo en y arrastre la línea láser de excitación a la longitud de onda apropiada. </li><li> Seleccione el detector deseado de la lista de los disponibles, a continuación, establecer el rango de detección para abarcar la gama de longitudes de onda apropiada. NOTA: NUNCA ponga el rango de detección directamente debajo del haz de excitación. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Seqential&quot; en la izquierda &quot;Adquirir&quot; barra de herramientas para abrir el diálogo de escaneo secuencial en la parte inferior de la barra de herramientas de la izquierda. Esto permite al usuario añadir múltiples secuencias, cada unacon un haz de excitación diferente para un color diferente. Haga clic en &quot;Entre Marcos&quot;, a continuación, establecer la frecuencia de excitación, detector, y el rango de detección para cada color adicional que en los pasos 6.9 y 6.10. </li><li> Una vez que todos los ajustes están optimizados, pulsar &quot;Start&quot; para iniciar el proceso de adquisición. </li><li> Aplicar el software libre deconvolución (Huygens) utilizando un entorno diseñado para STED deconvolución, como se ha descrito previamente 13. </li></ol>

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<li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La novedad de este estudio es que combina la técnica de SLB con STED para estudiar las sinapsis de las células NK. Estudios anteriores han fotografiado la bicapa lipídica con TIRF para estudiar la formación de sinapsis de células T 8 y señalización tráfico molécula en la membrana plasmática 6. Otros han descrito STED de formación de imágenes de las sinapsis de células NK utilizando portaobjetos de vidrio recubiertas de anticuerpos 13,14. El método híbrido descrito en este documento además se basa en estos esfuerzos por imágenes de la sinapsis de las células NK con la mayor claridad ofrecida por imágenes de super-resolución en la superficie bicapa lipídica, que mejores modelos de la superficie dinámica de un APC. Aunque SLBS son membranas artificiales que carecen de citoesqueleto, balsas de lípidos, y otros ligandos que células diana, actuales o APCs poseen, esta técnica puede recapitular características importantes tales como la movilidad y la orientación de los ligandos. Esto permite que el sistema SLB para servir como un enfoque reduccionista en la disección de tque la contribución de los receptores y ligandos individuales para la formación de la SI y la dinámica de la IS. La característica más importante de SLBS es que los investigadores pueden combinar esta técnica con enfoques de imágenes de alta resolución, como la microscopía confocal y TIRF. La introducción de la microscopía STED aumenta aún más esta ventaja, y proporciona información sin precedentes en es la investigación y sus aplicaciones clínicas. Una crítica potencial de este sistema es que el SLB no imita adecuadamente el complejo de superficie de una APC, dando así lugar a características anatómicas potencialmente no fisiológicas en las sinapsis resultantes. Si bien es cierto que el limitado repertorio de moléculas de superficie en el SLB no recapitula totalmente la superficie heterogénea poblado de un APC, este límite también puede ser ventajoso en que permite a los investigadores determinar la influencia de las interacciones de los receptores y el ligando individuales en la formación de sinapsis . Taquí hay varios pasos cruciales en el proceso. Entre los más crítico es que la oxidación de los liposomas puede prevenir mediante el uso constante de argón para desplazar el oxígeno en el tubo y solución, tal como en los pasos 1.10, 2.6, y 2.11. La oxidación de los lípidos dará lugar a la movilidad de los lípidos disminuido, impidiendo así la capacidad de las proteínas de la superficie de moverse libremente y participar en la estructuración sináptica. Del mismo modo, también es crucial para eliminar todo el cloroformo en el liposoma mediante liofilización (paso 1.2). En la determinación de la densidad de proteína en la bicapa lipídica, que es de importancia para dispersar primero los granos de silicio en una suspensión homogénea libre de clusters. Si es necesario, la sonicación de las perlas se puede aplicar. En el montaje de la SLB, los primeros pasos (05.01 a 05.08) en los que los cubreobjetos se limpian, las gotas se colocan, y cubreobjetos está fijado son vitales. Un error en cualquiera de estos puede requerir de comenzar el experimento más (desde el inicio de la sección 5). Por esta razón, esbuenas prácticas para limpiar más cubreobjetos que serán necesarios para ahorrar tiempo en caso de un percance. No agrupación es el problema más frecuente cuando se trabaja con este sistema. Si, al visualizar las células en la etapa final, uno no puede encontrar ningún sinapsis fluorescentes, hay algunos pasos que se pueden tomar. Otra mancha para el receptor de la superficie celular cognado se puede añadir a la cámara para verificar que la célula no se ha formado una sinapsis con la bicapa mientras que las células pueden adherirse de forma no específica a la superficie de cubreobjetos de vidrio o bicapa, proteínas de la superficie sinápticamente implicados-debería aparecerá como grupos distintos en el plano de la interfaz célula-bicapa, mientras que las proteínas de superficie unengaged deben aparecer como tinción difusa alrededor del perímetro de la célula. En caso de que este método falla, se debe comprobar sus células a través de citometría de flujo para asegurar que el concreto marcador uno tiene la esperanza de estudiar se expresa en abundancia adecuada en la superficie celular. Cierta prote superficieins se sabe que son las reguladas por encima de largo plazo en la cultura vivo. Si bien los detalles de este protocolo específicamente cómo visualizar la formación de sinapsis de las células NK, el sistema SLB puede ser usado para estudiar la formación de sinapsis en cualquier inmunocitos imaginable simplemente por sustitución del ligando primario en el paso 5,11. Múltiples ligandos también se pueden añadir simultáneamente. Uno también no necesita utilizar un sistema de estreptavidina-biotina para adherir las proteínas de la superficie dentro de la bicapa. Níquel-NTA: interacciones de histidina también son viables. Sin embargo, debido a la alta resistencia y especificidad de la estreptavidina: interacción biotina, nuestro laboratorio prefiere este sistema. Uno puede también variar la concentración de células añadidas en la bicapa de la densidad prescrita en el paso 5,13, ​​así como la duración del periodo de incubación posterior a fin de observar las sinapsis en diferentes etapas de maduración. Esto se puede hacer incluso en directo, aunque esto, por supuesto, excluye la posibilidad de visualizar str intracelulaructures (a menos que ya están etiquetados con una etiqueta fluorescente fundido; nuestro laboratorio utiliza un par de dichas líneas celulares alterados). Debido al alto grado de personalización posible en este protocolo, se puede utilizar la técnica básica SLB, junto con imagen STED, para hacer frente a una gama muy variada de preguntas en inmunología, biología celular y bioquímica, incluyendo la dinámica de lípidos básicos 15, la formación de sinapsis 16, de señalización intracelular 17, y la metástasis de las células tumorales 18.

La sinapsis inmunológica (IS) se encuentra en una coyuntura crítica para la activación de las células y la función 1. Es el medio principal por el cual la presentación de antígenos y la inmunidad mediada por células se llevan a cabo. Los estudios microscópicos tempranos de la formación de sinapsis utilizan un sistema conjugado célula-célula 2. La principal limitación de este enfoque es que la mayoría de los conjugados será visto &#39;en el perfil&#39;, por así decirlo, restringiendo así la vista del observador de la propia estructura sináptica. En 1999, el laboratorio Dustin dirigida esta limitación mediante la utilización de la técnica de 3 bicapa lipídica apoyado de vidrio (SLB), que había sido pionero anteriormente por el laboratorio de 4,5 McConnel. Este enfoque dispuesto de las células presentadoras de antígenos (APC) en favor de una superficie plana apoyado lípidos de vidrio, en la que las proteínas se podrían unir y se mueven libremente en dos dimensiones. Usando este método, Dustin y sus colegas fueron capaces de mirar directamente hacia arriba en tél sinapsis mediante microscopía de fluorescencia de alta resolución, y por primera vez conseguir una mirada &quot;cara a cara&quot; en la estructura de la SI. Con el uso del sistema SLB, el detalle con que la SI puede ser visualizado se ha restringido solamente por las limitaciones de las técnicas de imagen actuales 6-8. El uso de técnicas de iluminación estándar, la resolución mínima (es decir, la distancia mínima entre dos objetos distintos en el que se pueden distinguir) ha sido &lt;200 nm sobre la base del criterio de Rayleigh 9. Este límite impide la formación de imágenes de estructuras a escala molecular muy finos que componen la sinapsis, y hasta el desarrollo de técnicas de imagen super-resolución 10-12, la visualización de estas estructuras se limita a la obtención de imágenes de células fijadas mediante microscopía electrónica. Con el reciente advenimiento de una variedad de técnicas de super-resolución, como SIM (microscopía de iluminación estructurada), PALM (microscopía fotoactivado localización), STORM (microscopía óptica reconstrucción estocástico), y STED 10-12, los investigadores pueden ahora estudiar estas estructuras sinápticas en un detalle sin precedentes, que tiene a su vez proporciona una comprensión cada vez aclarado de la SI. Las ventajas de microscopía STED se han descrito antes del 13. Aquí describimos super-resolución de imagen con microscopía STED equipado con el láser de 660 nm agotamiento de nuevo desarrollo. En comparación con el láser convencional agotamiento de 592 nm, el láser de 660 nm permite una selección más amplia de colorantes fluorescentes (ver http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), especialmente en estos fluoróforos rojos. Otras publicaciones han descrito la imagen STED de las sinapsis de las células NK en portaobjetos de vidrio recubiertas de anticuerpos 13,14. Aquí, el sistema SLB se combina con super-resolución STED microscopía para estudiar la sinapsis de las células NK. Esta técnica tiene la ventaja sobre anticuerpoportaobjetos recubiertos de ser un mosaico fluido, en el que las proteínas de la superficie embebidos pueden moverse libremente en una superficie bidimensional plana (plano xy). Esto imita más fielmente la superficie orgánica y móvil de una célula diana, y en consecuencia mejor recapitula la formación de una sinapsis inmune fisiológicamente relevante. El objetivo de este protocolo es proporcionar al usuario final con una descripción detallada de cómo reproducir la sinapsis inmunológica de las células NK mediante la combinación del sistema SLB y super-resolución STED microscopía. Además, proporcionará al usuario final con las medidas necesarias para: preparar los liposomas, construir bicapas proteínas incrustado, determinar la densidad de la proteína en las bicapas lipídicas, y adquirir imágenes de super-resolución mediante microscopía STED. Estas técnicas no se limitan al campo de la inmunología, y pueden ser ampliamente utilizados en una variedad de disciplinas.

<table><tbody><tr><td>18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850375C</td><td>Preparación de liposomas</td></tr><tr><td>18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinyl) (sal sódica</td><td>)Avanti&nbsp;</td><td>870273C&nbsp;</td><td>Preparación de liposomas</td></tr><tr><td>Gas argón,</td><td>gas de aire comprimido&nbsp;</td><td>UN1006</td><td>Preparación de liposomas</td></tr><tr><td>A liofilizador</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>Zona franca 7740020</td><td>Preparación de liposomas</td></tr><tr><td>Tubos liofilizadores</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>7540200</td><td>Preparación de liposomas</td></tr><tr><td>Columnas de cromatografía</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205558</td><td>Preparación de liposomas</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9856</td><td>Preparación de liposomas</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9759</td><td>Preparación de liposomas</td></tr><tr><td>Octyl-&beta;-D-glucopiranósido</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>O1008</td><td>Preparación de liposomas</td></tr><tr><td>Tubo de diálisis</td><td><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html? LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html; FrName=Espectros%2FPo+RC+Tubos; rtm=Kit;#KIT">Spectrum Labs&nbsp; </a></td><td>132676</td><td>Preparación de liposomas</td></tr><tr><td>Placa de poliestireno con fondo en V de 96 pocillos (sin tratar)</td><td>Determinación de la densidad de anticuerpos Corning</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de sílice no funcionalizadas</td><td>Bangs Laboratories&nbsp;</td><td>Determinación de la densidad de anticuerpos</td> <td>SS06N</td></tr><tr><td>tubos FACS</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-2A&nbsp;</td><td>Determinación de la densidad de anticuerpos</td></tr><tr><td>QuantumTM MESF</td><td>perlas Bangs Laboratories Determinación variable de</td><td></td><td>la densidad de anticuerpos</td></tr><tr><td>Caseína&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C0875</td><td>Preparación de bicapa lipídica</td></tr><tr><td>HEPES solución salina tamponada + 1% HSA</td> Preparación <td>casera</td><td></td> de <td>bicapa lipídica</td></tr><tr><td>Estreptavidina&nbsp;</td><td>Tecnologías para la vida&nbsp;</td><td>434301</td><td>Preparación de bicapas lipídicas</td></tr><tr><td>Proteína biotinilada marcada con fluorescencia&nbsp;</td><td>Preparación casera</td><td></td><td>de bicapa lipídica</td></tr><tr><td>ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>80608</td><td>Preparación bicapa lipídica</td></tr><tr><td>25x75 mm cubreobjetos de vidrio</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>10812</td><td>Preparación de bicapa lipídica</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (30%)</td><td>Fisher Scientic&nbsp;</td><td>BP2633</td><td>Preparación de bicapa lipídica</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>258105</td><td>Preparación de bicapa lipídica</td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>B20656</td><td>Preparación de la bicapa lipídica</td></tr><tr><td>Papel para lentes</td><td>VWR&nbsp;</td><td>54826-001</td><td>Para la imagen</td></tr><tr><td>Aceite de inmersión tipo F</td><td>Leica&nbsp;</td><td>11 513 859</td><td>Para la adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Un microscopio Leica TCS STED</td><td>Leica</td><td></td><td>Para la adquisición de imágenes</td></tr></tbody></table>

super-resolución de imagen de la célula natural killer inmunológica synapse en un apoyada-glass planar bicapa lipídica

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

El sistema de bicapa lipídica plana soportada por vidrio se ha utilizado en una variedad de disciplinas. Una de las aplicaciones más útiles de esta técnica ha sido en el estudio de la formación inmunológica de sinapsis, debido a la capacidad de las bicapas lipídicas planas soportadas en vidrio para imitar la superficie de una célula diana mientras forman una interfaz horizontal. Los recientes avances en imágenes de superresolución han permitido a los científicos ver mejor los detalles finos de la estructura de la sinapsis. En este estudio, se utiliza una de estas técnicas avanzadas, el agotamiento de emisiones estimuladas (STED), para estudiar la estructura de las sinapsis de las células asesinas naturales (NK) en la bicapa lipídica soportada. Aquí se proporciona un protocolo fácil de seguir que detalla: cómo preparar fosfolípidos sintéticos crudos para su uso en la síntesis de bicapas soportadas por vidrio; cómo determinar la densidad de la proteína de una concentración dada en los sitios de unión de la bicapa; cómo construir una bicapa lipídica soportada que contenga anticuerpos contra el receptor CD16 activador de células NK; y, por último, cómo obtener imágenes de células NK humanas en esta bicapa utilizando microscopía de superresolución STED, centrándose en la distribución de gránulos líticos positivos para perforina y actina filamentosa en las sinapsis NK. Por lo tanto, combinando el sistema de bicapa lipídica plana soportada por vidrio con la técnica STED, demostramos la viabilidad y aplicación de esta técnica combinada, así como las estructuras intracelulares en la sinapsis inmunológica NK con superresolución.

La Figura 1 muestra el resultado de la densidad de anticuerpo sobre la bicapa lipídica. El principio es usar perlas estándar para hacer la curva estándar de MESF frente a MFI a través de citometría de flujo (A). El MFI de la serie de muestras se convirtió en MESF utilizando la curva estándar. La densidad de anticuerpo sobre la bicapa lipídica se correlaciona linealmente con la concentración de anticuerpo (B). Figura 2 muestran la triple-color de la imagen STED de NK sinapsis sobre el vidrio de soporte de bicapa lipídica planar. El anticuerpo anti-CD16 en la bicapa de lípidos se acumula, provocando la formación de F-actina y la polarización y la penetración de perforina a través de la malla de F-actina en el panel focal de sinapsis inmunológica en las células NK. El uso de este enfoque combinado, se puede observar limpiamente los microclusters de la etiqueta fluorescente anti-CD16 en el SLB, que refleja directamente la agrupación de CD16 sobre la célula NK. En comparación con la imagen confocal convencional, la estructura de CD16 Central grupo se discierne más fácilmente en la imagen STED debido a la fluorescencia ambiente empobrecido. Además, la ultraestructura del citoesqueleto de actina se ve con mejorado significativamente resolución. De acuerdo con observaciones anteriores 16,17, los gránulos líticos perforina-positivas se ven posicionado sobre las regiones de baja densidad de F-actina en la imagen STED, un detalle crucial que se pierde en su mayoría en la imagen confocal. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> Figura 1. Densidad del anticuerpo 3G8 en bicapa lipídica. (A) La correlación lineal entre MESF y MFI para la serie estándar. (B) La correlación lineal entre la densidad de la proteína y la concentración para la serie de dilución de proteína de la muestra, que muestra el número de monómeros de proteínas marcadas con fluorescencia por unidad de área como una función del aumento de la concentración de lípidos sobre el Si recubiertosperlas lica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> Figura 2. STED obtención de imágenes de NK sinapsis en bicapa lipídica planar. Células NK primaria se estimularon en el SLB que contiene biotina marcado con fluorescencia anti-CD16 (rojo), fijaron, permeabilizaron y tiñeron con faloidina (azul) y anti-F-actina (verde). Una célula individual fue fotografiada primero bajo el ajuste normal confocal, y luego el ajuste STED. Confocal de imágenes y STED se deconvoluted utilizando el software Huygens. Barra de escala, 1 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Describimos aquí una combinación de la técnica de bicapa lipídica soportada por vidrio para formar sinapsis inmunológicas con la técnica de imagen de superresolución de la microscopía de depleción por emisión estimulada (STED). El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios las instrucciones necesarias para llevar a cabo con éxito estas dos técnicas.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo capturar exitosamente imágenes de superresolución de las sinapsis inmunológicas de células asesinas naturales o células NK sobre una bicapa lipídica soportada. Esto se logra mediante la construcción de una bicapa lipídica plana soportada en vidrio que contiene anticuerpos contra el receptor activador de células NK CD16 en portaobjetos con cámaras. Luego, se añaden a la bicapa lipídica plana embebida con anticuerpos las células NK previamente aisladas, seguido de la tinción de las células con f-actina y perforina.El paso final consiste en la obtención de imágenes de las sinapsis de células NK resultantes mediante el microscopio stead, obteniendo finalmente imágenes de la sinapsis de células NK sobre una bicapa lipídica soportada. El uso de stead muestra la sinapsis de células NK con un detalle mejorado, lo que permite la visualización de la ultraestructura del citoesqueleto de actina y de gránulos líticos positivos para perran posicionados sobre regiones de baja densidad de actina F. Así, el principal beneficio de esta técnica es que la barrera lipídica plana sobre soporte de vidrio puede imitar la membrana plasmática de la célula diana, así como las proteínas presentes sobre esta barrera lipídica plana.Pueden moverse lateralmente, lo que puede recapitular mejor la formación de la sinapsis inmune, muy relevante desde un punto de vista lógico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, permitiendo a los investigadores visualizar la formación de la sinapsis de manera controlada y con detalle, algo inalcanzable mediante enfoques comerciales y microscópicos. Un becario posdoctoral y una estudiante de posgrado demostrarán el procedimiento para ensamblar la bicapa lipídica planar soportada sobre vidrio.Primero, prepare 100 mililitros de solución de piraña mezclando peróxido de hidrógeno al 30 % con ácido sulfúrico en una proporción de uno a tres en un vaso de precipitados. Coloque dos cubreobjetos rectangulares número 1.5 durante 20 a 30 minutos mientras se limpian. Recupere un tubo de lípidos DOPC previamente preparados a 400 micromolares y un tubo de lípidos biotina-PE previamente preparados a 80 micromolares.Trasporte a hielo hasta el tanque de argón tras desoxigenar con argón un nuevo tubo de microcentrífuga. Mezcle juntos DOPC y biotina PE en una proporción uno a uno. El volumen específico variará según las necesidades experimentales, pero debe ser al menos dos microlitros.Desoxigenar cada tubo de mezcla y los tubos individuales de reactivo antes de devolver la escalera al refrigerador. Una vez que hayan terminado, enjuagar minuciosamente las laminillas con agua destilada. Dejar secar las laminillas al aire durante unos minutos, luego retirar 1,5 microlitros de la mezcla de liposomas y distribuirlos en una sola gota dentro de una de las cámaras de carril de una placa con cámara.El uso de dos gotas por carril es habitual, pero no necesario. Ahora, coloque rápidamente y de manera eficiente la laminilla seca sobre las gotas, asegurándose de que las gotas estén suficientemente espaciadas para que no se fusionen una vez colocada la laminilla. Además, asegúrese de que las gotas permanezcan circulares y bien definidas sin tocar los bordes de las paredes de la cámara.Presione firmemente entre y alrededor de cada carril para asegurar un sello hermético entre la cubierta. Deslice y marque las posiciones de las gotas usando un rotulador. Luego, haga pasar 100 microlitros de solución acuosa al 5% de casing a través de la cámara para bloquear la bicapa.Trate de asegurarse de que no haya burbujas en la cámara de flujo. Luego, inyecte 100 microlitros de strept adin a una concentración de 333 nanogramos por mililitro en cada canal. Después de incubar durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, lave pasando tres mililitros de solución salina tamponada con heaps que contenga 1 % de albúmina sérica humana a través de cada canal.Para eliminar el exceso de tritina, agregue 100 microlitros de anticuerpo anti-CD16 marcado con biotina y fluorescentemente etiquetado a la concentración proteica previamente determinada, según se describe en el protocolo del texto, tras una incubación en la oscuridad de 20 a 30 minutos. Lave nuevamente pasando tres mililitros de solución salina tamponada con HEPES que contenga 1 % de albúmina sérica humana a través de cada canal. Luego, haga fluir 100 microlitros de D-biotina a una concentración de 25 nanomolar a través de la cámara con el fin de unir cualquier exceso de STR-tabin y así eliminar la posibilidad de unión no específica de STR-tabin a las células.A continuación, cuente las células NK humanas y resuspenda en una concentración de 500.000 por mililitro en solución salina amortiguada con HEPES que contenga 1% de albúmina sérica humana. Lave la D-biotina de la cámara con otros tres mililitros de solución salina amortiguada con HEPES que contenga 1% de albúmina sérica humana por canal. Una vez que las células hayan sido resuspendidas en la concentración deseada, agregue 100 microlitros a cada canal.Coloque la cámara en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos. Después de este período de incubación, fije las células con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos. Lave pasando tres mililitros de solución salina tamponada con fosfato por cada canal para eliminar el paraformaldehído.Luego, agregue 400 microlitros de tampón bloqueante antes de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, tiña la f-actina y la perforina agregando dos microlitros de faloína marcada con fluoróforo y anticuerpo monoclonal anti-perforina marcado con fluoróforo, incube a temperatura ambiente durante una hora antes de lavar pasando tres mililitros de solución salina tamponada con fosfato a través de la cámara. La cámara está lista para comenzar la adquisición de imágenes.Encienda todos los módulos de hardware necesarios del microscopio stead. Inicie el software de análisis de imágenes y active tanto el escaneo resonante como los módulos stead. Después de realizar estas selecciones, espere aproximadamente de tres a cinco minutos para que el software se inicie.Haga clic en la pestaña de configuración en la parte superior de la pantalla y seleccione configuración del láser. Luego encienda la luz blanca y los láseres stead de 592 nanómetros. Elija el objetivo de 100 x y alinee el haz del láser de excitación con un láser de depleción de 592 nanómetros.Seleccione el módulo de configuración del láser, apague el láser de agotamiento de 592 y encienda el láser de agotamiento de 660 nanómetros. Coloque la preparación sobre la platina, encima del objetivo. Enfoque las células unidas a la región de bicapa demarcada utilizando la lámpara de luz blanca y los oculares.Luego regrese a la pestaña de adquisición directamente a la derecha de la pestaña de configuración. Haga clic en la pestaña de luz blanca y luego encienda ese módulo y arrastre la línea láser de excitación hasta la longitud de onda adecuada. Después de seleccionar el detector deseado y establecer el rango de detección, haga clic en el botón secuencial en la barra de herramientas de adquisición izquierda para abrir el cuadro de diálogo de escaneo secuencial en la parte inferior de la barra de herramientas izquierda.Esto permite al usuario agregar múltiples secuencias, cada una con un haz de excitación diferente para un color distinto. Haga clic entre los cuadros y luego configure el detector de frecuencia de excitación y el rango de detección para cada color adicional. Una vez que todos los ajustes estén optimizados, pulse inicio para comenzar el proceso de adquisición.La imagen estable de tres colores de la sinapsis de células NK sobre una bicapa lipídica planar soportada en vidrio muestra que el anticuerpo anti-CD16, mostrado en rojo, se acumula en la bicapa lipídica, desencadenando la formación de F-actina y la polarización y penetración de perforina, mostrada en azul, a través de la malla de F-actina en el plano focal. Mediante este enfoque combinado, se pueden observar claramente los microagregados de anticuerpo anti-CD16 marcado con fluorescencia dentro de la bicapa lipídica soportada en vidrio, lo que refleja directamente el agrupamiento de CD16 en la célula NK. En comparación con la imagen confocal convencional, la estructura en anillo del agregado central de CD16 se distingue más fácilmente en la imagen STEAD debido al menor fondo de fluorescencia.Además, la estructura ultrafina del citoesqueleto de actina se observa con una resolución significativamente mejorada. En concordancia con observaciones previas, los gránulos líticos positivos para perin se sitúan sobre regiones de baja densidad de actina F. En la imagen STEAD, un detalle crucial que generalmente se pierde en la imagen de confocal. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cuatro horas si se lleva a cabo correctamente.Es importante recordar mantener su muestra desoxigenada desplazando repetidamente el oxígeno con argón, y al ensamblar la cámara colocando rápidamente la cubeta sobre su muestra e inmersa en la solución de encapsulamiento.

super-resolution-imaging-natural-killer-cell-immunological-synapse-on

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Apoyado bicapas planas son potentes herramientas que pueden ser utilizados para modelar las interacciones moleculares en una sinapsis inmunológica. Aquí, se muestra los métodos para el anclaje de las proteínas de adhesión celular sabe que modulan la formación de sinapsis en el folleto superior de la bilyer lípidos y visualizar la formación de sinapsis mediante microscopía TIRF.

El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis virológicas.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

En este video, describimos la técnica de microscopía de lámina de luz reticular para visualizar las interacciones entre las células T vivas y las células presentadoras de antígenos. El método consiste en enfocar una lámina de luz reticular ultradelgada en un par de células que interactúan para obtener una serie de imágenes bidimensionales, que se combinan para obtener imágenes cuatridimensionales de alta resolución que revelan la dinámica espacio-temporal de la interacción célula-célula.

Microscopía de lámina de luz reticular para visualizar las interacciones receptor-ligando en células vivas

Este video muestra una técnica para visualizar la formación de la sinapsis inmunológica en células asesinas naturales (NK) en una bicapa lipídica (SLB) soportada. El SLB se marca primero con un ligando del receptor activador de células NK marcado con fluoróforos, seguido de la incubación con células NK. Posteriormente, las células se tiñen para obtener actina polimerizada y gránulos líticos perforin-positivos. Este enfoque permite la visualización de la formación de sinapsis mediante...

Imágenes de superresolución de la formación de sinapsis inmunológica de células NK en una bicapa lipídica soportada

Este video muestra una técnica in vitro para estudiar la formación de sinapsis inmune entre las células T humanas primarias y las bicapas lipídicas soportadas (SLB). Las proteínas de la superficie de las células T interactúan con los respectivos ligandos inmovilizados en SLB para formar una sinapsis inmunitaria, seguida del movimiento de los gránulos líticos hacia la sinapsis, que se visualiza mediante microscopía de fluorescencia.

Una técnica in vitro para estudiar la interacción de las células T con bicapas lipídicas planas soportadas

Aquí se ilustra el protocolo para obtener imágenes de dos colores STED nanoscopía la sinapsis inmune citotóxica de las células NK recapitulado sobre vidrio. Con este método se obtiene la resolución nm sub-100 de las proteínas de la sinapsis y el citoesqueleto.

La visualización de la sinapsis inmunológica mediante gated-Tiempo color dual Emisión Estimulada de Agotamiento (STED) Nanoscopia

Aquí se muestra la preparación de bicapas lipídicas planas funcionalizadas con proteínas, la determinación de la movilidad de las proteínas en su interior y la medición de las densidades de las proteínas. Se esboza una hoja de ruta para la construcción de un microscopio de reflexión interna total con reducción de ruido, que permite visualizar fluorocromos residentes de una sola capa con alta resolución espacio-temporal.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

La inmunidad adaptativa está controlada por 'sinapsis inmunológicas' dinámicas formadas entre las células T y las células presentadoras de antígenos. Este protocolo describe métodos para investigar las células endoteliales, tanto como APC fisiológicas poco estudiadas como un nuevo tipo de "modelo de APC celular plana".

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

El protocolo describe una técnica para estudiar la capacidad del primario policlonal T las células humanas para formar sinápticas interfaces con bicapas lipídicas planares. Utilizamos esta técnica para mostrar la capacidad de formación de sinapsis diferencial de las células T humanas principal derivado de los ganglios linfáticos y la sangre periférica.

Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía para visualizar la dinámica de receptores de superficie en células vivas. Aquí se muestran los receptores de células T en CD4+ células T primarias.

Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

Este protocolo analiza tanto la formación de la sinapsis inmunológica como el posterior tráfico secretor polarizado posterior hacia la sinapsis inmunológica. Se formaron conjugados celulares entre una célula Raji con pulso de superantígenos (que actúa como una célula que presenta antígenos) y un clon de Jurkat (actuando como un linfocito T auxiliar del efector).

Imagen de la Sinapsis Inmunológica Humana

Aprende a capturar imágenes de superresolución de sinapsis inmunológicas de células NK usando microscopía STED y bicapas lipídicas soportadas en vidrio. Este protocolo permite visualizar el citoesqueleto de actina y gránulos líticos con detalle.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

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