Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo capturar con éxito imágenes de súper resolución de las sinapsis inmunológicas de las células asesinas naturales o NK en la bicapa lipídica compatible. Esto se logra mediante la construcción de una bicapa lipídica plana soportada por vidrio que contiene anticuerpos contra el receptor activador de células NK CD 16 en portaobjetos de cámara. A continuación, las células NK previamente aisladas se añaden a la bicapa lipídica plana incluida en el anticuerpo, seguida de la tinción de las células con factina y perforina.

El paso final es la obtención de imágenes de las sinapsis de células NK resultantes utilizando el microscopio stead y, en última instancia, la obtención de imágenes de la sinapsis NK en la bicapa lipídica compatible. El uso de stead muestra la sinapsis de la célula NK con mayor detalle, lo que permite la visualización de la ultraestructura del citoesqueleto de actina y los gránulos líticos perran positivos colocados sobre regiones de baja densidad de actina F. Por lo tanto, la base de esta técnica es que la barrera lipídica lisa de soporte de vidrio puede imitar la membrana plus de la célula tuck, la proteína de esta barrera lipídica simple.

Pueden moverse lateralmente, lo que puede recapitular mejor de la formación de inmunosinapsis muy lógicamente relevante. Este mensaje puede ayudar a responder a los cristianos clave en el campo de la inmunología, permitiendo a los investigadores visualizar la formación de sinapsis de manera controlada con detalle, lo cual es inalcanzable mediante el uso de enfoques comerciales y microscópicos. Un becario postdoctoral de pintura y una beca para estudiantes de posgrado demostrarán el procedimiento para ensamblar la bicapa lipídica plana soportada por vidrio.

Primero, prepare 100 mililitros de solución de piraña mezclando peróxido de hidrógeno al 30% con ácido sulfúrico en una proporción de uno a tres en un vaso de precipitados en esta solución. Coloque dos cubreobjetos rectangulares con el número 1.5 durante 20 a 30 minutos mientras se limpian los cubreobjetos. Recupere un tubo de 400 lípidos DOPC micromolares previamente preparados y un tubo de lípidos PE de biotina de 80 micromolares previamente preparados.

Transpórtelos en hielo al tanque de argón después de desoxioxioxigenar un nuevo tubo de microcentrífuga con argón. Sume el DOPC y el PE de biotina en una proporción de uno a uno. El volumen específico variará en función de las necesidades experimentales, pero debe ser de al menos dos microlitros.

Cada desoxioxioxi oxigena el tubo de mezcla y los tubos de reactivos individuales antes de devolver la escalera al refrigerador. Una vez que hayan terminado de limpiar, enjuague a fondo los cubreobjetos con agua destilada. Coloque los deslizadores de la cubierta para que se sequen al aire durante unos minutos, luego extraiga 1,5 microlitros de la mezcla de liposomas y la alícuota en una sola gota en una de las cámaras de carril de un portaobjetos de cámara.

El uso de dos entregas por carril es típico, pero no necesario. Ahora, de forma rápida y eficaz, coloque el cubreobjetos seco sobre las gotas, asegúrese de que las gotas estén lo suficientemente espaciadas para que no se fusionen una vez colocado el cubreobjetos. Además, asegúrese de que las gotas permanezcan circulares y bien definidas sin tocar los bordes de las paredes de la cámara.

Presione firmemente entre y alrededor de cada carril para asegurar un sello hermético entre la cubierta. Desliza y desliza y marca las posiciones de las gotas con un rotulador. A continuación, pase 100 microlitros de carcasa acuosa al 5% a través de la cámara para bloquear la bicapa.

Trate de asegurarse de que no haya burbujas en la cámara de flujo. A continuación, inyecte 100 microlitros de estreptococo adina a una concentración de 333 nanogramos por mililitro en cada carril. Después de incubar durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, lavar haciendo correr tres mililitros de solución salina tamponada con 1% de albúmina sérica humana a través de cada carril.

Para eliminar el exceso de tritina, agregue 100 microlitros de anti CD 16 biotinilado marcado con fluorescencia a la concentración de proteína previamente determinada como se describe en el protocolo de texto después de la incubación en la oscuridad durante 20 a 30 minutos. Lavar de nuevo haciendo pasar tres mililitros de solución salina tamponada con 1% de albúmina sérica humana a través de cada carril. A continuación, haga fluir 100 microlitros de biotina D a una concentración de 25 nanomolares a través de la cámara para unir cualquier exceso de STR tabin y eliminar así la posibilidad de una unión no específica de STR tabin a las células.

A continuación, cuente las células NK humanas y vuelva a suspenderlas a una concentración de 500.000 por mililitro en montones de solución salina tamponada con 1% de albúmina sérica humana. Lave la biotina D de la cámara con otros tres mililitros de solución salina tamponada con 1% de albúmina sérica humana por carril. Una vez que las células se hayan resuspendido a la concentración deseada, agregue 100 microlitros a cada carril.

Coloque la cámara en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Después de este período de incubación, fije las células con aldehído paraformado al 4% a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos. Lávese pasando tres mililitros de solución salina tamponada con fosfato a través de cada carril para eliminar el aldehído paraforme.

A continuación, añada 400 microlitros de tampón de bloqueo antes de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, tiñir la f actina y la perforina añadiendo dos microlitros de Phin diluido marcado con fluorescencia y anticuerpo monoclonal anti perran marcado con fluorescencia e incubar a temperatura ambiente durante una hora antes del lavado haciendo pasar tres mililitros de solución salina tamponada con fosfato a través de la cámara. La cámara está lista para que comiencen las imágenes.

Encienda todos los módulos de hardware necesarios del microscopio stead. Inicie el software de análisis de imágenes y habilite los módulos de escaneo resonante y stead. Después de realizar estas selecciones, espere entre tres y cinco minutos para que se inicie el software.

Haga clic en la pestaña de configuración en la parte superior de la pantalla, seleccione configuración láser. A continuación, encienda la luz blanca y los láseres de 592 nanómetros. Elija el objetivo 100 x y alinee el rayo láser de excitación con un láser de agotamiento de 592 nanómetros.

Seleccione el módulo de configuración del láser, apague el láser de agotamiento 592 y encienda el láser de agotamiento de 660 nanómetros. Coloque la diapositiva sobre el escenario sobre la lente. Enfoca las células unidas en la región bicapa demarcada con la lámpara de luz blanca y los oculares.

A continuación, vuelva a la pestaña de adquisición, directamente a la derecha de la pestaña de configuración. Haga clic en la pestaña cambiar a luz blanca y, a continuación, encienda ese módulo y arrastre la línea del láser de excitación a la longitud de onda adecuada. Después de seleccionar el detector deseado y configurar el rango de detección, haga clic en el botón secuencial en la barra de herramientas de adquisición de la izquierda para que aparezca el cuadro de diálogo de escaneo secuencial en la parte inferior de la barra de herramientas de la izquierda.

Esto permite al usuario agregar múltiples secuencias, cada una con un haz de excitación diferente para un color diferente. Haga clic entre fotogramas y luego configure el detector de frecuencia de excitación y el rango de detección para cada color adicional. Una vez que todas las configuraciones estén optimizadas, presione iniciar para comenzar el proceso de adquisición.

La imagen de triple color de la sinapsis de la célula NK en la bicapa lipídica plana con soporte de vidrio muestra que el anticuerpo anti CD 16 que se muestra en rojo se acumula en la bicapa lipídica desencadenando la formación de Factina, y la polarización y penetración de la perforina que se muestra en azul a través de la malla de f actina en el panel focal. Utilizando este enfoque combinado, se pueden observar limpiamente los micro grupos de anti CD 16 marcados con fluorescencia dentro de la bicapa lipídica con soporte de vidrio, que refleja directamente la agrupación de CD 16 en la célula NK. En comparación con la imagen confocal convencional, la estructura del anillo del cúmulo central CD 16 se distingue más fácilmente en la imagen sustitutiva debido a la fluorescencia ambiental agotada.

Además, la ultraestructura del citoesqueleto de actina se observa con una resolución significativamente mejorada. De acuerdo con las observaciones previas, los gránulos líticos positivos para perina se observan posicionados sobre regiones de baja densidad de actina F. En lugar de la imagen, un detalle crucial que se pierde en su mayor parte en la imagen confocal Una vez dominada, esta técnica se puede realizar alrededor de cuatro horas si se hace correctamente mientras se recorre.

Es importante recordar mantener la muestra desoxigenada desplazando repetidamente el oxígeno con argonne y, al montar la cámara, colocando rápidamente el cubreobjetos sobre la muestra y sumergiéndola en la solución de la carcasa.