Name: La transfección, selección y Colonia-cosecha de células madre humanas pluripotentes inducidas TALEN dirigidos con un gen GFP en el puerto seguro AAVS1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprende a editar el genoma de células madre pluripotentes humanas mediante TALEN en el locus AAVS1 para integrar GFP. Este protocolo permite generar clones estables con expresión uniforme del marcador fluorescente.

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Esta investigación fue apoyada por el Fondo Común de los NIH y el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Artritis, Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel.

1. Preparación del Sótano matriz de la membrana y de revestimiento de Material de plástico <ol><li> Coloque la matriz de la membrana basal madre congelada de -20 ° C en hielo y descongelar la noche a 4 ° C. </li><li> Después de la descongelación, la pipeta 2 mg alícuotas de matriz de membrana basal en tubos Eppendorf pre-refrigerados. Almacenar estos en -20 ° C hasta que se necesite. </li><li> Para preparar las placas de matriz recubierto de la membrana basal, descongelar una alícuota sobre hielo hasta el último trozo de hielo en la que desaparezca tubo Eppendorf (normalmente dentro de ~ 2 h). </li><li> Después de la descongelación, añadir matriz de membrana basal a 12 ml de frío (4 ° C) DMEM / F12 para obtener una solución de revestimiento de matriz de la membrana basal. </li><li> Añadir solución de matriz de membrana basal al recipiente de cultivo apropiado. Para una placa de 6 pocillos, prescindir de 1 ml por pocillo. Agite la placa para asegurarse de que la solución de la matriz de la membrana basal cubre completamente cada pocillo. </li><li> Parafilm sellar la membrana basal de la matriz recubierta de placa / placa, y se incuba a Room temperatura durante 1 hora antes de su uso. Alternativamente, las placas de matriz recubiertos tienda membrana basal / platos a 4 ° C y utilizar dentro de 2 semanas de recubrimiento. NOTA: Añadir DMEM extra / F12 a la membrana basal de la matriz recubierta de placa / placa para evitar el secado. Antes de usar 4 ° C membrana basal almacenado matriz recubiertos plato / plato, colóquelo en una cabina de seguridad biológica y deje que llegue a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. </li><li> Aspirar matriz de membrana basal completamente antes de la adición de células y medio. </li></ol> 2. Preparación del medio E8 <ol><li> Preparar medio de cultivo E8 descongelando suplemento E8 la noche a 4 ° C. </li><li> Extraiga 10 ml de medio basal E8 de la población de 500 ml y desechar. </li><li> Pipetear todo el vial de 10 ml de suplemento E8 directamente en 490 ml de medio basal E8. No entibie medio completo E8 en un baño de agua a 37 ° C, como las fluctuaciones de temperatura repetidos pueden degradar el bFGF en el complemedio te E8. </li><li> Utilice un medio completo E8 dentro de 2 semanas de la adición del suplemento. </li></ol> 3. La descongelación de iPSCs <ol><li> Retirar un vial de iPSCs congelados de nitrógeno líquido y colocar en hielo seco. </li><li> Rápidamente descongelar el vial en un baño de agua a 37 ° C; agitar el vial en el baño de agua hasta que sólo un pequeño fragmento de los restos de hielo. </li><li> Rocíe el vial con etanol y la transferencia del 70% de una cabina de seguridad biológica. </li><li> Añadir 1 ml de la temperatura ambiente E8 medio gota a gota directamente al vial. </li><li> Usando una pipeta de 2 ml, transferir la suspensión celular en gota a gota 9 ml de medio de E8 en un tubo cónico de 15 ml. Agitar el tubo de frecuencia para asegurarse de que las células y el medio se mezclan bien rápidamente. </li><li> Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en un volumen apropiado de E8 suplementado con 10 mM Y-27632. </li><li> Añadir las células a un número adecuado de sótano membrane matriz recubiertos pozos, y colóquelo en un 37 ° C, 5% de CO2 durante la noche. Se recomienda a la placa al menos 0,2 x 10 6 IPSC por pocillo de una placa de 6 pocillos para permitir una rápida recuperación después de la descongelación. </li></ol> 4. Mantenimiento y pases de rutina de iPSCs <ol><li> Actualizar medio E8 diaria. </li><li> Monitorear la morfología y la confluencia de las células con un microscopio invertido. iPSCs de alta calidad crecen en colonias planas con bordes bien definidos; colonias individuales poseen una apariencia &quot;empedrado&quot;. </li><li> Passage las células iPSCs cuando llegan a ~ 70% de confluencia. </li><li> Preparar una solución pases EDTA mediante la adición de 0,9 g de NaCl y 500 l 0,5 M EDTA a 500 ml de DPBS. Mezclar bien para disolver NaCl, y el filtro de vacío para esterilizar. Calentar una parte alícuota de la solución de los pases en un 37 ° C baño de agua antes de pases. </li><li> Para pasaje, aspirado pasó medio de cultivo y lavar las células una vez con un volumen igual de pas calientessaging solución. Aspirar, y pipetear suficiente de solución EDTA pases para recubrir las células (1 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos). </li><li> Coloque las células bajo un microscopio invertido y observar las colonias de IPSC. La aparición de agujeros dentro de las colonias y bordes elevados debe ser evidentes dentro de 2 a 5 min. </li><li> Aspirar con cuidado la solución passaging EDTA. </li><li> Usando una pipeta de 10 ml, dispensar 4 ml de medio E8 (si se utiliza una placa de 6 pocillos) a alta presión directamente en cada pocillo para ser pasado. </li><li> Recoge los grupos IPSC, y dividido en un número apropiado de pocillos en función de la relación de división de 1: 8 a 1:12. No sobre-pipeta, como desagregación de los grupos de células que puede reducirse el viabilidad. </li><li> Colocar la placa en una incubadora, y el rock de la placa posterior y hacia adelante y de lado a lado varias veces para dispersar las células. </li></ol> 5. Preparación de MEFs y iPSCs para Tansfection <ol><li> 48 horas antes de la transfection, iPSCs paso a ~ 1: 6 en cuatro o más pocillos de una placa de 6 pocillos de la membrana basal de la matriz recubiertos, por lo que serán 70% confluentes aquí a dos días. </li><li> El día siguiente, se descongele DR4 MEFs en el medio de MEF que consiste en DMEM (alta glucosa) suplementado con 10% de FBS y 1x MEM-NEAA. </li><li> Placa DR4 MEFs en dos placas de 10 cm a ~ 2 x 10 4 células / cm 2 y se incuba durante la noche a 37 ° C. </li><li> En el día de la transfección, cambio de medio MEF a E8 suplementado con 10 mM Y-27632 30 min antes de realizar la transfección en células iPS. </li><li> Opcional: Si se desea análisis de citometría de flujo de iPSCs después de la transfección, quitar una placa de matriz recubiertos con membrana basal de 4 ° C y el lugar a temperatura ambiente. </li><li> Opcional: 4 h antes de la transfección, suplemento pre-transfección cultura IPSC con Y-27632 en la concentración final de 10 mM. </li></ol> 6.-La disociación celular Gentle reactivo de tratamiento unand La transfección de células iPS usando un sistema de electroporación <ol><li> Retire la solución de transfección de células primarias P3 de 4 ° C y deje que llegue a temperatura ambiente durante ~ 30 min. Añadir todo el suplemento de 100 l a la solución de transfección antes de su uso. </li><li> Calentamiento celular suave reactivo de disociación en un baño a 37 ° C. </li><li> Obtener AAVS1 Talens (pZT-AAVS1-L1 y pZT-AAVS1-R1) y AAVS1-CAG-EGFP donante de -20 ° C. </li><li> Retire iPSCs del incubador y lavar una vez con DPBS. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo de disociación de células suave por pocillo, y se incuba iPSCs a 37 ° C durante 5 min, o hasta mayor que 50% de las células se han disociado del recipiente de cultivo. </li><li> Pipetear las células arriba y abajo un par de veces con una pipeta p1000 disociar las células restantes del recipiente de cultivo, y para romper los grumos IPSC. </li><li> Añadir 2 ml de medio E8 a cada pocillo, y pipeta hacia arriba y abajo varias veces con una pipeta de 10 ml a Fürther deshacer los agregados celulares en células individuales NOTA: La eficacia de transfección disminuye significativamente si los agregados celulares no son suficientemente desagregada. </li><li> Recoger iPSCs en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 100 xg durante 3 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en una cantidad mínima de medio de E8. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro después de la aplicación de un colorante vital, tales como 0,4% de azul de tripano. Asegúrese de que las células están suficientemente disociados mientras cuenta (1-3 células por &quot;grupo&quot;). </li><li> Prescindir de 3 x 10 6 células en cada uno de dos tubos de 15 ml cónicos, y girar de nuevo a 100 g durante 3 min. NOTA: centrifugación a baja velocidad reduce el estrés celular y permite un fácil resuspensión de iPSCs antes de la electroporación. </li><li> Ajuste el sistema de electroporación para el programa específico de tipo celular de la línea de células madre embrionarias humanas H9 (Programa CB-150). </li><li> Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante de la cell pellets. Para una pastilla, añadir 10 g de la donante de recursos humanos como muestra de control. Para el otro pellet añadir 10 g de la donante HR, junto con 5 g de cada uno TALEN (PZT-AAVS1-L1 y PZT-AAVS1-R1) como muestra experimental. </li><li> Resuspender cada sedimento celular en 100 l de solución de transfección de células primarias P3, y transferir a una cubeta. </li><li> Realice la transfección y añadir inmediatamente 500 l de medio E8 temperatura ambiente a cada cubeta. </li><li> Transferir el iPSCs gota a gota transfectadas a uno de 10 cm de plato que contiene MEFs DR4 preparados en la etapa 5.4. </li><li> Opcional: Añadir varias gotas de cada experimento en un pocillo de una placa de 6 pocillos de la membrana basal de la matriz recubierto si se desea citometría de flujo anaylsis de la eficiencia de la transfección. </li><li> Repita los pasos 06.15 a 06.17 para terminar ambas muestras. El día siguiente, lavar las células con DPBS dos veces y cambiar el medio de cultivo a NutriStem, que parece apoyar la cultura IPSC en alimentadores mejor que E8. </li><li> Trpicos de expresión EGFP ansient en de 48 a 72 horas después de la transfección; evaluar la eficiencia de transfección como se desee. </li></ol> 7. Puromicina Selección de iPSCs Targeted <ol><li> Comience selección puromicina 72 horas después de la transfección cuando las iPSCs alcanzan el 70% de confluencia. </li><li> Para NCRM5 iPSCs, comenzará la selección puromicina a 0,5 mg / ml de puromicina (1/2 de la dosis completa) diluido en medio de cultivo NutriStem. La concentración óptima puromicina puede variar desde 0,25 hasta 1 mg / mIL para algunas líneas de IPSC. </li><li> IPSCs Cultura en NutriStem + 0,5 mg / ml de puromicina durante 3 días, refrescantes del medio día. </li><li> Después de 3 días, aumentar la concentración de puromicina a 1 mg / ml. </li><li> IPSCs Cultura menores de 1 mg / ml puromycin selección durante otros 7 a 8 días, o hasta que las colonias distintas parecen lo suficientemente grande para picking colonia. </li></ol> 8. Colonia Picking y ampliación de iPS específicas <ol><li> Uso de la membrana basalmatriz para recubrir una placa de 96 pocillos mediante la supresión de 50 l de solución de revestimiento de matriz de la membrana basal (2 mg matriz de membrana basal diluido en 12 ml de DMEM / F12) en cada pocillo. Guarde la placa a 4 ° C durante la noche antes de su uso. </li><li> Después de permitir que la placa de matriz recubiertos con membrana basal para llegar a la temperatura ambiente, aspirar la matriz de la membrana basal y dispensar 100 l E8 suplementado con 10 mM Y-27632 en cada pocillo. </li><li> Publicar un microscopio invertido en una cabina de seguridad biológica, y rociar ligeramente con EtOH al 70% para esterilizar. </li><li> Saque una pipeta Pasteur de vidrio sobre un mechero Bunsen para obtener una herramienta de colonias de picking ideal que tiene un &quot;gancho&quot; minúscula en la punta. Esterilizar con EtOH al 70%, y el lugar en la campana para secar. </li><li> Retirar la cápsula que contiene colonias IPSC dirigidos de la incubadora, y colocar en el capó bajo el microscopio. </li><li> Escoja iPSCs trazando un círculo alrededor de la frontera colonia con la herramienta de colonias de picking.</li><li> Use el &quot;gancho&quot; de la herramienta de colonias de picking para raspar suavemente y quitar la colonia IPSC de la superficie de la placa. Para las colonias más grandes, dibujando una X con la herramienta de colonias de recoger a trimestre la colonia facilitará el crecimiento celular después de la re-enchapado. </li><li> Una vez que grupos de células se separan y libremente flotante, utilice una pipeta p200 ajustado a ~ 30 l para recoger las células iPS. Células de la placa directamente en la placa de 96 pocillos. </li><li> Opcional: utilizar una pipeta p20 ajustado a ~ 5 l para recoger las células iPS en un tubo Eppendorf, a continuación, añadir 50 l de reactivo de disociación de células suave de digerir durante 5 minutos a 37 ° C. Después de la digestión, añadir 500 l medio E8 en el tubo eppendorf para diluir el reactivo de disociación de células suave y centrifugar las células a 200 xg en una microcentrífuga de sobremesa estándar para 5 min. Entonces aspirar la mayor parte del medio y dejar ~ 30 l de volver a suspender y transferir las células en la placa de 96 pocillos. NOTA: Esteenfoque facilitará la disociación del grupo celular y la rápida expansión de la colonia recogido. </li><li> Continuar picking colonia hasta que se hayan recogido un número suficiente de colonias IPSC (más o menos se recomienda 20 a 30 colonias por experimento). </li><li> Después de la recolección de colonias, coloque la placa de 96 pocillos en una incubadora durante la noche. Actualizar con medio completo E8 el día siguiente, y la cultura hasta ~ 70% de confluencia. </li><li> Células pasaje de los 96 pozos en un 24 y, a continuación, en un 6 pocillos, como se describe en los pasos 04.05 a 04.10. NOTA: los volúmenes de solución de EDTA y medio E8 deben reducirse proporcionalmente cuando se utiliza pozos más pequeños que una placa de 6 pocillos. </li><li> Evaluar la orientación éxito por la unión de PCR y análisis de transferencia de Southern para confirmar la integración casete específica y ausencia de vectores insertados al azar 16. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los pasos más críticos para la generación exitosa de iPSC humanas dirigidas a puerto seguro AAVS1 son: (1) administrar de manera eficiente TALEN y plásmidos donantes en iPSC mediante transfección; (2) optimizar la disociación de las iPSC en células individuales antes de la transfección y la densidad de siembra después de la transfección; (3) optimizar la dosis y el tiempo de selección de fármacos en función del crecimiento de la línea iPSC; (4) diseccionar y recoger cuidadosamente las colonias objetivo y transferirlas a ...

La capacidad de reprogramar células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas similares a células madre embrionarias (células iPS) fue descubierto por primera vez por Takahashi et al. En 2007 1. Fibroblastos dérmicos humanos transducidas con retrovirus que expresa cuatro factores de transcripción (El Yamanaka así apodado-Factores Oct3 / 4, Sox2, se muestra c-Myc, y Klf4) para ser muy similares a las células madre embrionarias humanas (hESCs) basándose en la morfología, proliferación, expresión génica, y el estado epigenética; crucialmente, iPSCs también son capaces de diferenciarse en células de las tres capas germinales 1. La capacidad potencial y la diferenciación de proliferación de células iPS los hace herramientas muy atractivos; mediante la reprogramación de células de pacientes que sufren de enfermedades específicas, iPSCs se pueden utilizar tanto como sistemas modelo in vitro de la enfermedad y como agentes terapéuticos potenciales. Para este último propósito, varios asuntos deben ser abordados antes de que el pleno potencial de iPSCsen un entorno clínico puede realizarse; el potencial tumorigénico de hESCs cultivadas in vitro y CMPI, el uso de derivados xenogénicos durante la reprogramación celular y el mantenimiento, y la necesidad de realizar un seguimiento de las células trasplantadas in vivo son todos los obstáculos cruciales para la aplicación clínica de células madre pluripotentes (Revisado por Hentze et al. 2). Una solución ideal a la necesidad para el seguimiento de las células diferenciadas post-trasplante implicaría un marcador visualmente detectable que se resiste a silenciar y variegación independientemente de la aplicación. Expresión robusta y sostenida de transgenes integrados es más fácilmente alcanzable cuando se introduce ADN exógeno en loci puerto seguro; es decir, sitios genómicos que permiten la transcripción suficiente de un vector integrado, mientras que al mismo tiempo mitigar perturbaciones de expresión en genes vecinos 3. Uno de esos sitios que ha sido muy bien caracterizado desde su descubrimiento es la integr virus adeno-asociadoEl sitio ación 1 (AAVS1), en el primer intrón de la 1 12C subunidad reguladora de genes (PPP1R12C) la proteína fosfatasa. Este locus ha sido demostrado no sólo para permitir la expresión robusta de transgenes integrados a través del tiempo extendido en la cultura y en la diferenciación in vitro sostenido y 3, sino también para proteger rodea genes de perturbación transcripcional 4; ambas características se cree que es debido a la presencia de elementos aislantes de la cromatina endógenos que flanquean el sitio AAVS1 5. Los avances en las herramientas de ingeniería del genoma más sólo la última década han facilitado en gran medida la facilidad y eficiencia con que las manipulaciones genéticas en cualquier tipo de célula se puede lograr. Mientras que los experimentos exitosos primeros basaron en extremadamente bajos niveles de recombinación homóloga endógena (HR) con un donante introducido para lograr la orientación de genes en los CES 6,7, el uso de nucleasas específicas de sitio, tales como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs), que signinificativamente inducir la recombinación homóloga a través de la generación de una rotura del DNA de doble cadena ha aumentado en gran medida la eficiencia de tales experimentos 8,9. La reutilización de ambos tipo activador de transcripción efectores (cuentos) de planta patógeno Xanthomonas géneros y los agrupados interspaced regularmente repeticiones palindrómicas cortas procariotas (CRISPR) / sistema Cas9 en nucleasas de diseño específicos del sitio eficientes ha hecho la orientación de genes en células madre pluripotentes un accesible y metodología practicable 10-13. Un reciente documento describe un método eficaz para la integración estable de un reportero de cassette verde fluorescente en el AAVS1 locus puerto seguro en iPS humanas utilizando nucleasas TALE (Talens) 14. Estos iPSCs dirigidos mantuvieron su fluorescencia incluso después de la diferenciación dirigida a cardiomiocitos y trasplante en un modelo de ratón de infarto de miocardio (MI), proporcionando una fuerte evidencia de la utilidad de talesestablemente células madre pluripotentes fluorescente 14. Para obtener colonias específicas, se utilizó un método para atrapar genes en el que un corte y empalme-aceptor (SA), secuencia de péptido autoescindible 2A coloca el puromicina N-acetil-transferasa gen (PAC) bajo el control del promotor endógeno PPP1R12C; Por lo tanto, sólo iPSCs que han incorporado el donante de ADN en el locus AAVS1 expresan PAC, haciéndolos seleccionable basado en puromicina-resistencia; (Figura 1, 15). Este protocolo detalla los procedimientos de generación de AAVS1-GFP iPSCs informó en el documento reciente 14, incluido el proceso de transfección de células iPS con Talens y un donante de 9,8 kb para integrar un fragmento de ADN de 4,2 kb en el locus AAVS1 puerto seguro, la selección de iPSCs basados ​​en puromicina-resistencia, y las colonias de la cosecha por la expansión clonal. Las técnicas descritas en el presente documento pueden aplicarse a muchos experimentos de ingeniería del genoma.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Factor de Crecimiento Reducido (GFR) Matriz de Membrana Basal, *Libre de LDEV, 10 ml</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Tienda en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Costar 6 Pocillos Transparentes Placas de Pocillos Múltiples Tratadas con TC</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td>Almacene el medio basal a 4 &deg;C. Almacene el suplemento a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Almacenar a temperatura ambiente. Una vez disuelto en H2O, almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Plato de cultivo tratado con TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>DR4 MEF 2M IRR - Academic</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6204G</td><td>Almacenar en nitrógeno líquido.</td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td>Tienda a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino definido, origen en EE. UU.</td><td>HyClone</td><td>SH30070.03</td><td>Tienda a -20 &deg;C. Descongelar a 4 &deg; C a un día y alícuota. Almacene las alícuotas a -20 &deg; C hasta que sea necesario.</td></tr><tr><td>MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Unidad central de nucleofactor 4D&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001B</td><td>parte del sistema de electroporación</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X unit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001X</td><td>parte del sistema de electroporación</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>A su llegada, retire la solución de célula primaria y complemente y almacene a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Reactivo de disociación celular StemPro Accutase</td><td>Life Technologies A1110501</td><td></td><td>Almacene a -20 &deg;C. Descongele durante la noche a 4 &deg; C y calentar una alícuota en un 37 &deg; C Baño de agua antes de usar.</td></tr><tr><td>NutriStem XF/FF Culture Medium</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td>Almacenar a -20 &deg;C. Descongelar durante la noche a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 y pZT-AAVS1-R1)</td><td>Addgene</td><td>52637 y 52638</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-EGFP Donante de recombinación homóloga</td><td>Addgene</td><td>22212</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrocloruro de puromicina</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Almacene en -20 &deg;C. Prepare alícuotas de trabajo de 1 mg/ml en ddH2O.</td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato desechable Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR (refrigerado), 120 V 60 Hz</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-004-521</td><td></td></tr><tr><td>TX-750 4 &times; 750 ml Rotor de cubo oscilante</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

la transfección, selección y colonia-cosecha de células madre humanas pluripotentes inducidas talen dirigidos con un gen gfp en el puerto seguro aavs1

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

La adición de transgenes dirigidos puede proporcionar una expresión génica persistente mientras elude el silenciamiento génico y la mutagénesis insercional causada por la integración aleatoria mediada por vectores virales. Este protocolo describe una plataforma universal y eficiente de adición dirigida a transgenes en iPSC humanas basada en la utilización de TALEN de código abierto validados y un donante similar a una trampa de genes para entregar transgenes en un locus de puerto seguro. Es importante destacar que la edición genética efectiva está limitada por la eficiencia de entrega de los vectores de edición genética. Por lo tanto, este protocolo se centra en primer lugar en la preparación de iPSC para la transfección con el fin de lograr una alta eficiencia de entrega nuclear. Cuando las iPSC se disocian en células individuales utilizando un reactivo de disociación de células suaves y se transfectan mediante un programa optimizado, se puede inducir a las células del >50% para que absorban los grandes vectores de edición de genes. Debido a que el locus AAVS1 se encuentra en el intrón de un gen activo (PPP1R12C), se utilizó un gen resistente a la puromicina (PAC) vinculado al aceptor de empalme (SA) para seleccionar las iPSC específicas mientras se excluían las células de solo integración aleatoria y no transfectadas. Esta estrategia aumenta en gran medida las posibilidades de obtener clones específicos, y también se puede utilizar en otros experimentos de selección de genes activos. Dos semanas después de la selección de puromicina a la dosis ajustada para la línea específica de iPSC, los clones están listos para ser seleccionados mediante la disección manual de colonias grandes y aisladas en trozos más pequeños que se transfieren a un medio fresco en un pocillo más pequeño para una mayor expansión y cribado genético y funcional. Se puede seguir este protocolo para obtener fácilmente múltiples líneas de iPSC reporteras de GFP que son útiles para la obtención de imágenes in vivo e in vitro y el aislamiento celular.

Una visualización del protocolo se proporciona en la Figura 2, con períodos durante los cuales iPSCs se cultivan en medio diferente puesto de manifiesto por cualquiera de verde para E8 o azul para NutriStem. Es importante para transfectar sólo iPSCs de alta calidad; examinar placas de cultivo de todo el mantenimiento de rutina y verificar que las culturas IPSC contienen colonias principalmente distintas que llevan una morfología de adoquines como (Figura 3A); células diferenciadas no de...

La edición génica mediada por TALEN en el locus AAVS1 de puerto seguro permite la adición de transgenes de alta eficiencia en iPSCs humanas. Este protocolo describe los procedimientos para la preparación de iPSCs para TALEN y la administración de vectores donantes, la transfección de iPSCs y la selección y aislamiento de clones de iPSC para lograr la integración dirigida de un gen GFP para generar líneas reporteras.

La transfección, selección y Colonia-cosecha de células madre humanas pluripotentes inducidas TALEN dirigidos con un gen GFP en el puerto seguro AAVS1

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

El objetivo general de este procedimiento es generar un aislado AA frente a un clon de células madre pluripotentes inducibles o IPSC dirigido a un lugar seguro que exprese GFP. Esto se logra primero mediante la entrega eficiente de plásmidos donadores AAVs uno talones y A VS uno C-A-G-E-G-F-P a las IPSC mediante nucleofección. En el segundo paso, las células dirigidas A a vs uno se seleccionan mediante puromicina en células alimentadoras embrionarias de ratón.A continuación, los clones individuales de A A VS uno que expresan GFP se seleccionan y transfieren a una placa de 96 pocillos recubierta con matrigel. En el paso final, los clones de A A VS uno G-F-P-I-P-S-C se amplifican utilizando medio E ocho y técnicas estándar de cultivo de IPSC. Finalmente, se emplea microscopía de inmunofluorescencia y citometría de flujo para demostrar la expresión uniforme y robusta de GFP en clones de IPSC humanas dirigidos a A A VS uno.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de selección de colonias implican la microdiseción de clones específicos utilizando herramientas especiales para la selección de colonias bajo un microscopio, lo cual es difícil de aprender durante una instrucción simultánea. Comience lavando las cultivos de IPSC una vez con PBS. A continuación, añada un mililitro del reactivo suave de disociación celular a 37 grados Celsius a cada pocillo e incube las células a 37 grados Celsius durante aproximadamente cinco minutos, cuando más del 50 % de las células se hayan disociado del recipiente de cultivo.Utilice una pipeta P1000 para interrumpir mecánicamente cualquier resto de agregados celulares o células adheridas. A continuación, agregue dos mililitros de medio E8 a cada pocillo y use una pipeta de 10 mililitros para desagregar aún más los cultivos en suspensiones de células individuales. Ahora reúna las células recolectadas en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifúguelas.Re-suspenda el precipitado en una cantidad mínima de medio E ocho para el recuento. Luego, tras confirmar la viabilidad de los cultivos mediante exclusión de azul de tripano, así como su disociación suficiente, transfiera 3 millones de células a cada uno de dos tubos cónicos de 15 mililitros mientras las células se centrifugan; configure el sistema de electroporación al programa específico para el tipo celular de la línea de células madre embrionarias humanas H nueve. A continuación, añada 10 microgramos del donador de recombinación homóloga solo a un precipitado para la muestra control y 10 microgramos del plásmido donador de recombinación homóloga, junto con cinco microgramos de cada plásmido talón, para la muestra experimental.A continuación, agregue 100 microlitros de solución completa de transfección primaria P3 a temperatura ambiente a cada uno de los pellet de control y experimentales y resuspenda las células. Transfiera las muestras a cubetas individuales y luego ate las muestras inmediatamente después de la transfección. Añada 500 microlitros de medio E8 a temperatura ambiente a cada cubeta y luego transfiera las muestras de iPSC transfectadas gota a gota a placas individuales de 10 centímetros que contengan fibroblastos embrionarios de ratón DR4. Antes de seleccionar las colonias, recubra un pocillo de una placa de 96 pocillos con 50 microlitros de solución de matriz de membrana basal y luego almacene la placa durante la noche a cuatro grados Celsius. A la mañana siguiente.Cuando la placa haya alcanzado la temperatura ambiente, aspire la solución en exceso y cargue cada pocillo con 100 microlitros de medio E ocho suplementado con 10 micromolar de Y 2 7 6 3 2. A continuación, coloque un microscopio invertido dentro de una cabina de seguridad biológica y esterilícelo con un ligero rocío de etanol al 70%. Luego, coloque una pipeta de vidrio de Pastoreo sobre un mechero Bunsen para crear una herramienta de selección de colonias con un pequeño gancho en la punta tras su esterilización con etanol al 70%.Coloque el asa en la campana para que se seque y luego coloque la placa de cultivo de IPSE sobre la platina del microscopio para seleccionar los clones. Localice una colonia adecuada con baja ampliación y utilice la herramienta de selección de colonias para trazarla y dividirla en cuadrantes. A continuación, raspe suavemente la colonia dividida en cuadrantes del recipiente de cultivo y use una pipeta P200 ajustada a aproximadamente 30 microlitros para recoger las IPC en suspensión libre, sembrando directamente las células sobre la matriz de membrana basal.Mientras se cosechan, los IPC deben adherirse dentro de las dos a cuatro horas posteriores al siembra. Finalmente, incubar las colonias seleccionadas durante la noche a 37 grados Celsius y renovar las células con medio E ocho completo a la mañana siguiente. Es importante transfectar únicamente I PSC de alta calidad durante todo el experimento.Los cultivos de IPSC deben contener principalmente colonias bien definidas que presenten una morfología tipo adoquín como las células observadas aquí, y las células diferenciadas no deben superar el 10 % del cultivo. La capacidad de transfección de los IPC puede evaluarse y optimizarse utilizando el vector pequeño de GFP PAX, ya que la transfección con PAX GFP representa típicamente la eficiencia máxima alcanzable debido a su pequeño tamaño. La expresión transitoria de un A VS uno C-A-G-E-G-F-P intel en IPCs transfectados alcanza su punto máximo entre 48 y 72 horas posteriores a la transfección, lo cual puede confirmarse con una pequeña fracción de células transfectadas mediante citometría de flujo. La eficiencia de transfección puede variar considerablemente.Incluso en experimentos con A, una fracción positiva para GFP es solo del 10 %. Los clones individuales que muestren una fluorescencia uniforme deben ser lo suficientemente grandes para permitir la selección de colonias tras la selección con puromicina. Además, una vez en formato de placa de 96 pocillos, los clones de iPSCs diana ampliados deben exhibir una expresión estable y uniforme de GFP. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar eficientemente iPSCs mediante transfección nuclear y cómo aislar el sitio seguro AV1.Clonos de IPSE dirigidos utilizando herramientas de selección de colonias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

A pesar de los recientes avances en la modificación genética, la transfección de células madre embrionarias humanas (células madre embrionarias humanas) sigue siendo un proceso caprichoso. Para nuestro conocimiento, los métodos sistemático y eficiente para transfectar las células madre pluripotentes inducidas (CMPi) no se han reportado. Aquí se describen los protocolos robustos para transfectar eficiente y nucleofect CMPi humanos.

Transfección y Nucleofecting Humanos células madre pluripotentes inducidas

Se presenta un protocolo para la reprogramación eficiente de las células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) utilizando vectores retrovirales que codifican Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-myc (OSKM) y la identificación de hiPSC correctamente reprogramado por tinción en vivo con Tra- 1-81 anticuerpo.

Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Este video describe una técnica precisa de edición del genoma en células madre pluripotentes inducidas humanas, o hiPSCs, que utilizan TALEN para crear roturas de doble cadena en un locus específico, induciendo la reparación dirigida por homología para la integración de genes de proteínas de fluorescencia.

Integración de genes dirigidos mediada por TALEN: uso de nucleasas específicas de secuencia modificadas para la inserción precisa de genes de proteínas fluorescentes en hiPSC

Describimos un protocolo para derivar células madre pluripotentes inducidas humanas basadas en lentivirales, reprogramadas y caracterizadas, y convertirlas en condiciones putativas de grado clínico.

Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica

La edición del genoma de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se puede realizar de forma rápida y eficiente. Aquí se presenta un procedimiento experimental robusto para la ingeniería genética de hPSCs, como se ejemplifica mediante la edición del locus de puerto seguro AAVS1 para expresar EGFP e introducir resistencia a los antibióticos.

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

Aquí se presenta un método de edición gen rápida y eficiente basado en RMCE en el locus de AAVS1 humanas pluripotentes células madre (hPSCs) que mejora los sistemas anteriormente descritos. Usando esta técnica, líneas isogénicas se pueden generar rápida y fiable para los estudios comparativos adecuados, facilitar la investigación transgénesis mediada con hPSCs.

Generación rápida y eficiente de las células madre pluripotentes recombinante humana mediada por la recombinasa Cambio en el cassette<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Se describe aquí es un protocolo para etiquetar endógeno expresado proteínas con las etiquetas fluorescentes en las células de vástago humanas pluripotentes inducidas mediante CRISPR/Cas9. Células supuestamente editadas se enriquecen con clasificación de celda de fluorescencia activada y se generan líneas de células clonales.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

Se necesitan nuevas estrategias para modelar fielmente las mutaciones somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para estudiar mejor la biología de las células madre hematopoyéticas y las neoplasias hematológicas. Aquí, se describe un protocolo para modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en HSPC combinando el uso de CRISPR / Cas9 y la transducción dual de donantes rAAV.

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Aprende a editar el genoma de células madre pluripotentes humanas mediante TALEN en el locus AAVS1 para integrar GFP. Este protocolo permite generar clones estables con expresión uniforme del marcador fluorescente.

La transfección, selección y Colonia-cosecha de células madre humanas pluripotentes inducidas TALEN dirigidos con un gen GFP en el puerto seguro AAVS1 (Video) | JoVE Journal

La transfección, selección y Colonia-cosecha de células madre humanas pluripotentes inducidas TALEN dirigidos con un gen GFP en el puerto seguro AAVS1

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