La transfección, selección y Colonia-cosecha de células madre humanas pluripotentes inducidas TALEN dirigidos con un gen GFP en el puerto seguro AAVS1

El objetivo general de este procedimiento es generar un AA aislado frente a un clon de células madre pluripotentes inducibles dirigidas o IPSC que expresen GFP. Esto se logra entregando primero un AAVs one talons y un A VS uno C-A-G-E-G-F-P plásmidos donantes de manera eficiente en IPCs por nucleo afección. En el segundo paso, las células objetivo A a vs uno se seleccionan mediante purmicina en células alimentadoras embrionarias de ratón.

A continuación, los clones individuales de GFP que expresan A A VS ONE se seleccionan en una placa de 96 pocillos recubierta de matrigel. En el paso final, los clones A A VS one G-F-P-I-P-S-C se amplían con técnicas de cultivo E eight medium y estándar IPSC. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia y la citometría de flujo se utilizan para mostrar la expresión uniforme y robusta de GFP en clones de IPSC humanos AA VS one.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de selección de colonias implican la microdisección de clones específicos utilizando herramientas especiales de selección de colonias bajo un microscopio, lo cual es difícil de aprender durante la instrucción en paralelo. Comience lavando los cultivos IPSC una vez cada uno con PBS. A continuación, añada un mililitro de reactivo de disociación celular suave a 37 grados centígrados a cada pocillo e incube las células a 37 grados centígrados durante aproximadamente cinco minutos cuando más del 50% de las células se hayan disociado del recipiente de cultivo.

Utilice una pipeta P 1000 para interrumpir mecánicamente los grupos de células restantes o las células adheridas. A continuación, añada dos mililitros de medio E 8 a cada pocillo y utilice una pipeta de 10 mililitros para desagregar aún más los cultivos en suspensiones unicelulares. Ahora agrupa las células recolectadas en un tubo cónico de 15 mililitros y gíralas hacia abajo.

Vuelva a suspender el pellet en una cantidad mínima de E ocho medio para contar. Luego, después de confirmar la viabilidad de los cultivos por exclusión de azul triano, así como su disociación suficiente, se transfirieron 3 millones de células a cada uno de los dos tubos cónicos de 15 mililitros, mientras que las células de centrifugación ajustaron el sistema de electroporación al programa específico del tipo de célula para la línea de células madre embrionarias humanas H nine. A continuación, añada 10 microgramos del donante de recombinación homóloga solo a un pellet para la muestra de control y 10 microgramos del plásmido donante de recombinación homólogo, junto con cinco microgramos de cada plásmido de garra para la muestra experimental.

A continuación, agregue 100 microlitros de solución de transfección de tres células primarias P completa a temperatura ambiente a cada uno de los gránulos de control y experimentales y vuelva a suspender las células. Transfiera las muestras a cubetas individuales y luego coma las muestras inmediatamente después de la transfección. Agregue 500 microlitros de medio E ocho a temperatura ambiente a cada Q vet y luego transfiera las muestras de IPSC transfectadas gota a gota a placas individuales de 10 centímetros que contengan fibroblastos embrionarios de ratón DR cuatro Antes de seleccionar las colonias, co-enseñe bien una placa de 96 pocillos con 50 microlitros de solución de matriz de membrana basal y luego almacene la placa durante la noche a cuatro grados Celsius a la mañana siguiente.

Cuando la placa haya alcanzado la temperatura ambiente, aspire el exceso de solución y cargue cada pocillo con 100 microlitros de medio E ocho suplementado con 10 micromolares Y 2 7 6 3 2. A continuación, coloque un microscopio invertido en una cabina de seguridad biológica y esterilícelo con un ligero spray de etanol al 70%. A continuación, coloque una pipeta de vidrio para pastos sobre un quemador bunsen para crear una herramienta de recogida de colonias con un pequeño gancho en la punta después de la esterilización con etanol al 70%.

Coloque el gancho en la campana para que se seque y luego coloque el cultivo IPSE en la platina del microscopio para recoger los clones. Localice una colonia adecuada con un aumento bajo y utilice la herramienta de selección de colonias para rastrearla y descuartizarla. A continuación, raspe suavemente la colonia descuartizada del recipiente de cultivo y utilice una pipeta P 200 ajustada a aproximadamente 30 microlitros para recoger los IPC que flotan libremente, colocando las células directamente en la matriz de la membrana basal.

A medida que se cosechan, los IPC deben colocarse dentro de las dos a cuatro horas posteriores al enchapado. Finalmente, incubar las colonias seleccionadas durante la noche a 37 grados centígrados y refrescar las celdas con un medio E ocho completo a la mañana siguiente. Es importante transfectar solo PSCs I de alta calidad durante todo el experimento.

Los cultivos de IPSC deben contener principalmente colonias distintas con una morfología similar a un adoquín como las células que se ven aquí y las células diferenciadas no deben superar el 10% del cultivo, la capacidad de transfectación de los IPC se puede evaluar y optimizar utilizando el pequeño vector PAX GFP, ya que la transfección con PAX GFP generalmente representa la máxima eficiencia alcanzable debido a su pequeño tamaño. La expresión transitoria de un A VS uno C-A-G-E-G-F-P e IPCs transfectados alcanza su punto máximo entre 48 y 72 horas después de la transfección, lo que puede confirmarse con una pequeña porción de células transfectadas mediante citometría de flujo. La eficiencia de la transfección puede variar mucho.

Incluso en experimentos con una fracción positiva de GFP es solo del 10%Los clones individuales que muestran una fluorescencia uniforme deben ser lo suficientemente grandes como para seleccionar colonias después de la selección de micina pura. Además, una vez en el formato de 96 pocillos, los clones IPSC dirigidos expandidos deben exhibir una expresión estable y uniforme de GFP. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar PSC I de manera eficiente por afección nuclear y cómo aislar AV en un puerto seguro.

Clones de IPSE específicos utilizando herramientas de selección de colonias.