Name: In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervioso entérico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprende a realizar imagen de calcio in situ en el sistema nervioso entérico utilizando preparaciones de intestino de montaje completo. Este método permite estudiar la actividad neuronal y glial en tiempo real para comprender la fisiología intestinal.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de la Asociación de Investigación y Fabricantes Farmacéuticos de América (PhRMA) (a B. Gulbransen), la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (Building Interdisciplinary Research Careers in Women's Health) K12 HD065879 (B. Gulbransen) y fondos iniciales de la Universidad Estatal de Michigan (B. Gulbransen).

NOTA: Los siguientes procedimientos que afectan el tejido de los animales de laboratorio son consistentes con las Directrices AVMA para la Eutanasia de los Animales de 2013 y fueron aprobados previamente por la Universidad Estatal de Michigan IACUC. 1. Preparación del tejido <ol><li> Anestesiar a la investigación con animales en una cámara que contiene 2,5% de isoflurano en oxígeno o mediante la colocación de 3-5 ml de isoflurano líquido sobre un material absorbente en el suelo de la cámara, asegurando que una barrera física impide que los animales del contacto directo con el isoflurano. Prueba para la profundidad de la anestesia por pellizcar la almohadilla de la pata. NOTA: La profundidad de la anestesia se considera apropiado cuando no hay reflejo de retirada de la extremidad posterior. Una vez anestesiado apropiadamente, la eutanasia el ratón por dislocación cervical </li><li> Colocar el animal en posición supina y limpiar la piel abdominal con etanol al 70%. El uso de fórceps para pellizcar la piel abdominal en la línea media y el uso de tijeras quirúrgicas para realizar una media de 6 cml incisión a lo largo de la línea alba para exponer los órganos digestivos internos. </li><li> El uso de fórceps romos para localizar y exponer el íleon dentro del peritoneo. Cortar el mesenterio del íleon / colon con tijeras y comenzar desentrañar el intestino. </li><li> Una vez que la longitud del intestino se deshizo adecuadamente, cortar el intestino distal al estómago y proximal al ciego para una preparación de íleon. Para una preparación de intestino grueso, cortar el distal del colon hasta el ciego y proximal al recto. </li><li> Quite rápidamente el segmento intestinal y colocarlo en un vaso con medio DMEM / F12 suplementado con hidrocloruro de nicardipina 3 M y 1 mM de clorhidrato escopolamina (en adelante, &quot;los medios de comunicación&quot;) en hielo. La adición de estos inhibidores facilita microdisección y la imagen posterior al paralizar el músculo liso intestinal. </li><li> Segmento de corte de interés (por ejemplo, yeyuno, íleon, colon distal o proximal) basado en marcadores anatómicos establecidos. Normalmente utilize tejido del íleon distal o en el colon distal. Sin embargo, utilizar el mismo procedimiento básico para aislar, de carga y de imagen neuronas y glía mientéricas en todas las regiones intestinales. </li><li> Retirar un pequeño segmento (6.4 cm) del segmento de intestino deseada y colocar en una placa de Petri con recubrimiento de Sylgard lleno de medios refrigerados. </li><li> Asegure los extremos proximal y distal del segmento intestinal con alfileres de insectos y abrir el tubo intestinal haciendo una recta, a lo largo corte a lo largo del borde mesentérico. </li><li> Tejido Pin plana bajo una ligera tensión con la cara mucosa y cuidadosamente diseccionar capa mucosa utilizando unas pinzas finas (# 5 y # 5/45 trabajo mejor) y tijeras muy finas de primavera. NOTA: La eliminación de la mucosa puede ser muy traumático para la ENS si no se hace correctamente. Para las preparaciones de calidad, tener cuidado de limitar retirada brusca de la mucosa por descamación o raspado. La mejor práctica es levantar la mucosa y cortar debajo con tijeras finas. </li><li> Cortar el tejido en preparación menors (aproximadamente 0,5 cm 2) y el pin en platos de imagen (4 esquinas con capa muscular circular hacia arriba) se coloca en el hielo con medio fresco. </li><li> Diseccionar cuidadosamente lejos músculo circular por las burlas aparte con pinzas finas para exponer el plexo mientérico. Evite estirar excesivo. </li><li> Coloque el plato de imágenes de nuevo en solución de hielo y el cambio por medio fresco. </li><li> Preparar 2 ml de mezcla de enzimas por plato [dispasa 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), colagenasa Tipo II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) en los medios de comunicación]. </li><li> Sacar los recipientes de hielo y agregue la mezcla de enzimas del paso 1.13. </li><li> Incubar platos a TA durante 15 min con 5% de CO 2/95% de aire. </li><li> Preparaciones de tejidos de lavado con medios 3 veces y esquinas re-pin. </li></ol> 2. Carga Fluo-4 Tinte NOTA: Evite fotoblanqueo trabajando con luz limitada durante la manipulación de los tintes fluorescentes y tejido cargadas de tintes indicadores. <ol><li> Preparar 4 mM solución de carga de Fluo-4. <ol><li> Añadir 1,5 ml de medio y 1,2 l de una acción probenecid 250 mM a una alícuota de 1,5 l de 4 mM Fluo-4 stock. 4 mM Fluo-4 stock se prepara mediante la adición de 11,4 l de Pluronic F-127 (20% en DMSO; suplementado con 0,25% Cremaphor-EL) a 50 g de Fluo-4, AM. </li></ol></li><li> Incubar preparaciones en Fluo-4 solución de carga durante 45 minutos en una incubadora oscura a 37 ° C. </li><li> Eliminar de la incubadora y lavar las preparaciones con los medios de comunicación 3 veces. </li><li> Medios de cambio de medio que contenía 200 mM probenecid e incubar 15 min a 37 ° C antes de formación de imágenes. NOTA: El probenecid es un fármaco que inhibe transportistas resistencia a múltiples fármacos en las neuronas. La adición de este fármaco inhibe la capacidad de las neuronas para extruir tintes y mejora etiquetado neuronal. Carga masiva de Ca 2+ colorantes indicadores en ausencia de probenecid produce carga celular principalmente glial. La adición de probenecid permite la visualización de las respuestas neuronales y gliales. </li><li> Preparar Modificado Krebuffer de bs. <ol><li> Hacer un tampón de Krebs modificada de tal manera que las concentraciones finales (en mm) de los componentes son como sigue: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, 1 pirúvico ácido y 8 de glucosa (pH ajustado a 7,4 con NaOH). Añadir 3 nicardipina mu M y 1 mM escopolamina para inhibir las contracciones musculares durante Ca 2 + de imágenes y todo el montaje disecciones. </li></ol></li></ol> 3. Imagen y Análisis NOTA: Utilice por lo menos un equipo básico de imágenes con una fuente de luz fluorescente, microscopio, una cámara CCD calidad y software de adquisición correspondiente. Varíe la adición de otros componentes en función de la fuente de luz y aplicación específica. Una rueda de filtro y de obturación deben usarse con una fuente de luz de arco de xenón tradicional. Sin embargo, fuentes de luz LED y sistemas de iluminación no requieren esos componentes. <ol><li> Coloque el recording cámara bajo el microscopio y el uso de un sistema de perfusión de flujo por gravedad con múltiples depósitos de jeringa con calefacción establecer una velocidad de perfusión continua de 2-3 ml / min de 37 ° C tampón Krebs. Asegúrese de que para evitar la formación de burbujas de aire, tanto en la línea de entrada y de succión conectado a una trampa de vacío. </li><li> Traiga el plexo deseados en foco bajo iluminación de campo brillante. Evitar la sobreexposición de los tejidos, que puede conducir a la foto de blanqueo. </li><li> Examine el Fluo-4 carga dentro de los ganglios y seleccione ganglios saludable para la imagen. Ganglios poco saludables / dañados exhibirán autofluorescencia o puntiforme morfología y no deben ser utilizados para la imagen. </li><li> Una vez que se selecciona ganglio, desviar la trayectoria de la luz a la cámara y obtener imágenes en vivo con el software de adquisición de imágenes. Asegúrese de que ganglio está en enfocar y ajustar la tasa de adquisición de imágenes y los tiempos de exposición. NOTA: las tasas de adquisición de la imagen y los tiempos pueden variar dependiendo de los eventos investigadores desean grabar. Para la mayoría de experimentos, las imágenestradicionalmente adquiridos en 0,5 a 1 Hz para las células gliales y hasta 2-10 Hz para las neuronas porque las respuestas glial Ca 2 + no son tan rápidos como Ca 2 + transitorios en las neuronas. </li><li> Comience experimento y establecer actividad de referencia durante 30 segundos. </li><li> Aplicar drogas pre-calentado de interés, tales como agonistas y antagonistas del receptor utilizando el sistema de perfusión de flujo por gravedad a una velocidad de 2-3 ml / min. Siga aplicación de agonistas / antagonistas volviendo a una perfusión de tampón normal y permitir un período de lavado / recuperación de al menos 10 min. NOTA: Los tiempos de aplicación del fármaco variará dependiendo del compuesto individual y el diseño experimental. En general, una aplicación de 20-30 segundos de agonista es suficiente para activar G-receptores acoplados a proteínas en las neuronas y células gliales. Sin embargo, los canales iónicos activados por ligando (tales como los receptores nicotínicos de la acetilcolina) requieren tiempos de aplicación de no más de 5-10 segundos. Otras exposiciones duración causarán ligando canales iónicos a Dese rápidamentensitize. Antagonistas deben aplicarse durante aproximadamente 3-15 minutos para asegurar el bloqueo completo de las vías de receptores. Sin embargo, esta es una generalización bruto y los investigadores siempre debe optimizar cualquier fármaco experimental en su paradigma particular. </li><li> Detener la grabación y vista la película de lapso de tiempo del experimento. Seleccionar cuidadosamente las regiones de interés (ROI) utilizando el software de análisis de imagen correspondiente. </li><li> Utilice el software para normalizar y compara ROI intensidad fluorescente en contra de su valor inicial fluorescente línea de base. Los cambios en la fluorescencia normalizada son directamente proporcionales a los cambios en [Ca2 +]. <ol><li> Utilice una modificación de un método descrito anteriormente utilizando 26? F / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) de fondo, donde F1 es la fluorescencia en cualquier dado punto y F0 es la fluorescencia de línea de base, para mejorar la precisión de evaluación. Esto ayuda modificaciónen la reducción de ruido de los cambios de fluorescencia en preparaciones de tejidos que exhiben movimiento de la capa muscular subyacente en el plexo mientérico. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Las metodologías descritas en este manuscrito proporcionan un enfoque consistente para estudiar eficazmente las neuronas y la glía entérica en el SNE. Aunque la obtención de imágenes de neuronas y glía entérica en cultivo ha proporcionado una gran cantidad de información sobre la función de las células individuales, estudiar estas células en su entorno multicelular nativo es crucial para comprender su fisiología y fisiopatología. La microscopía de fluorescencia es una técnica crucial para evaluar las interacciones multidireccionales de las células en el SNE. La carga de células del SNE con marcadores fluorescentes selectivos y la adquisición de imágenes con microscopía de alta resolución permiten observaciones cuantitativas de la actividad celular en el SNE. La obtención de imágenes de muestras de tejido vivo del ENS se realiza con relativa rapidez y genera grandes cantidades de datos funcionales y espaciales en profundidad. Las preparaciones mientéricas y del plexo submucoso de ratón utilizadas en estos experimentos permiten enfoques de manipulación molecular y genética. Las imágenes de Ca2+ en preparaciones de montaje completo proporcionan una herramienta útil para la evaluación de las interacciones neurona-glía.
En paradigmas experimentales avanzados, se pueden combinar varias sondas para obtener información sobre diferentes eventos dentro de las células. La microscopía de fluorescencia puede registrar imágenes con un contraste mejorado de moléculas específicas, si se utiliza una etiqueta fluorescente adecuada. Se eligió Fluo-4 porque posee un amplio rango dinámico. Un tiempo de incubación suficiente es vital cuando se utilizan los colorantes AM en ENS. Es posible que sea necesario ajustar la concentración de tinte y el método de carga para lograr los mejores resultados. Las preparaciones ideales deben cargarse con suficiente tinte para visualizar los cambios en la fluorescencia, pero no tanto como para que el tinte quele los iones objetivo e interfiera con la señalización intracelular. La exposición a la luz fluorescente debe limitarse para evitar la fototoxicidad en las células y el fotoblanqueo de los tintes. 
Los investigadores deben tener cuidado con varios pasos de este experimento, especialmente con la preparación de la solución y el tejido. Se debe tener especial cuidado durante el procesamiento y la disección del tejido ENS para mantener las funciones celulares. El tracto gastrointestinal contiene varias capas y variedades de tejidos, lo que plantea desafíos para la disección y la calidad de las imágenes en estas preparaciones de montaje completo 27. Además, los tractos de fibra interconectados del MP son más anchos y los ganglios son más grandes que los del SMP 2. La densidad neuronal del plexo mientérico es mayor en comparación con la del plexo submucoso 28. Las disecciones lentas e imprecisas tendrán efectos perjudiciales en la calidad de las preparaciones del plexo y, por lo tanto, en el éxito general de los experimentos. Por lo tanto, las herramientas limpias / no dañadas, la práctica y la destreza manual son fundamentales para este procedimiento. 
En las preparaciones de tejido de montaje completo, se debe tener una consideración cuidadosa al dibujar las regiones de interés (ROI) para evaluar correctamente la cinética y el grado de cambio observado en la intensidad de fluorescencia del tipo de célula deseado. Como los ganglios se encuentran en una capa muscular contráctil, los artefactos de movimiento causados por la motilidad intestinal son una preocupación principal durante las imágenes in situ . Por lo tanto, la supresión de estas alteraciones del movimiento mediante la recolocación de preparaciones tisulares después de la incubación con enzimas y la adición de inhibición farmacológica (nicardipina/escopolamina) a los tampones permite una adquisición de imágenes clara y fiable. Además de los enfoques farmacológicos y mecánicos para prevenir el movimiento de los tejidos, estudios recientes ilustran la aplicación de metodologías de software avanzadas y características de respuesta del tipo de célula para corregir el movimiento de tejido residual en los registros y mejorar la precisión del análisis 29. Salvo estos obstáculos técnicos, este método proporciona condiciones fisiológicamente relevantes para evaluar las características morfológicas y cuantitativas de las neuronas y la glía entérica en el SNE.

El sistema nervioso entérico (SNE) se organiza en dos plexos ganglionares incrustados dentro de la pared del tubo digestivo 1. Estos circuitos neuronales intramusculares, el plexo mientérico (MP) y el plexo submucoso (SMP), se componen de neuronas y glía entérica (Figura 1) 2. El MP y SMP regulan gastrointestinales (GI) funciones tales como la motilidad intestinal y la absorción del epitelio y secreción, respectivamente 3. Glía entérica se encuentran en las proximidades de las neuronas en los ganglios, pero las poblaciones de la glía entérica también existen dentro de la interconexión de los tractos de fibras y porciones extra-ganglionares de la pared intestinal 3,4. Glia entéricas se creía originalmente para proporcionar sólo un apoyo nutritivo para las neuronas. Sin embargo, estudios recientes sugieren fuertemente que las interacciones neurona-glía son esenciales para ENS funciona 5,6. Por ejemplo, los datos muestran que la glía entérica &quot;escuchar&quot; a la actividad neuronal 7y modular los circuitos neuronales 6,8, proteger a las neuronas entéricas del estrés oxidativo 9 y son capaces de generar nuevas neuronas entéricas en respuesta a la lesión 10,11. El protocolo presentado en esta revisión técnica proporciona un método simple y robusto para examinar la compleja interacción entre las neuronas y la glía entérica utilizando in situ intracelular de Ca 2 + de imágenes. Ca 2+ es una molécula de señalización ubicua en las células excitables y juega un papel esencial en los eventos de señalización sináptica en el sistema nervioso 12. La excitación de las neuronas o glía entérica provoca una elevación de la concentración citoplasmática de Ca2 +, ya sea por afluencia a través de canales de Ca2 + permeables o Ca 2 + liberación de las reservas de calcio intracelular. Imagen Ca 2 + transitorios en las neuronas y glía con tintes fluorescentes es un establecidos y técnica ampliamente utilizada para estudiar la organización funcional y dinámica deel 13-17 ENS. Formación de imágenes de Ca 2+ ha demostrado ser una herramienta importante en el estudio de los segmentos de tejido GI intactas para dilucidar la propagación de la excitabilidad a través de redes de marcapasos ICC 18 y músculo liso intestinal 19,20. Se permite a los investigadores para investigar un amplio espectro de parámetros fisiológicos y proporciona información acerca tanto a su distribución espacial y dinámica temporal. Las células se pueden teñir de manera eficiente en una forma mínimamente invasiva mediante el uso de indicadores fluorescentes de membrana permeable y protocolos de tinción optimizados 21. Esto ofrece la oportunidad de controlar un gran número de neuronas y glía entérica en preparaciones funcionalmente conservados 14-16,22, así como in vivo 23. -Todo el montaje preparaciones de tejidos son a granel cargado con una alta afinidad de Ca2 + colorante indicador como Fluo-4 que aumenta su fluorescencia cuando se une a Ca 2+. Los cambios en la fluorescencia se registran por una cámara CCD y analyzed digitalmente 6. El advenimiento de Ca 2+ proporcionó la oportunidad de supervisar las neuronas y células gliales interacciones, la capacidad de respuesta a diversos estímulos, y la participación de estos tipos de células en los procesos gastrointestinales en tiempo real. In situ imagen Ca 2+ ha dado una gran comprensión de los mecanismos de señalización de las neuronas entéricas y glía y posee varias ventajas sobre los modelos de cultivo celular de 6,24. En primer lugar, in situ preparaciones mantener el entorno de la matriz nativa de las neuronas y glia y salen de la mayor parte de sus conexiones con el tejido diana intacta. En segundo lugar, la genética y la morfología de la glía entérica culta significativamente se alteran en comparación con 6,24 en vivo. En tercer lugar, muchas interacciones heterotípicas se pierden en cultivo de células primarias y esto limita la evaluación de las interacciones célula-célula. Aunque las células cultivadas son muy adecuadas para la investigación de las propiedades fundamentales, su usefulness para el estudio de las interacciones complejas entre células gliales y las neuronas entéricas es limitado. La investigación de la interacción neurona-glía utilizando un enfoque in situ es fisiológicamente más relevantes como las vías sinápticas permanecen intactos 25. En comparación con los enfoques de cultivo celular, un enfoque in situ ofrece mejores condiciones para comprender sistemáticamente las intrincadas interacciones entre neuronas y glía entérica. Por otra parte, la organización planar del plexo ganglionares en los preparativos de todo el montaje es ideal para imágenes fluorescentes de intracelular de Ca 2 + transitorios y esta técnica ofrece un enfoque sencillo para evaluar la actividad neuronal glía en la ENS.

<table><tbody><tr><td>Calentador de jeringa BubbleStop&nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Colgenasa, Tipo II, polvo</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Herramientas de disección</td><td>Roboz&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de platina fija</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM colorante</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres de insectos</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>Pines de minuciosa</td> iQ Software de imágenes de células vivas <td></td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo Cámara sCMOS</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td> <td>de perfusiónBomba</td> peristáltica personalizada <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>Modelo 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sondas moleculares</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Escopolamina</td><td>Sigma</td><td>S1013&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca 2+ imaging del sistema nervioso entérico

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Los comportamientos reflejos del intestino están controlados por el sistema nervioso entérico (SNE). El SNE es una red integradora de neuronas y glía en dos plexos ganglionares alojados en la pared intestinal. Las neuronas entéricas y la glía entérica son los únicos tipos de células dentro de los ganglios entéricos. La actividad de las neuronas entéricas y la glía es responsable de coordinar las funciones intestinales. Este protocolo describe métodos para observar la actividad de las neuronas y la glía dentro del SNE intacto mediante la obtención de imágenes de transitorios de calcio intracelular (Ca2+) con tintes indicadores fluorescentes. Nuestra discusión técnica se centra en los métodos para la obtención de imágenes de Ca2+ en preparaciones de montaje completo del plexo mientérico del intestino de roedores. La carga masiva de montajes enteros de ENS con un indicador de Ca2+ de alta afinidad, como Fluo-4, permite medir las respuestas de Ca2+ en neuronas individuales o células gliales. Estas respuestas pueden ser evocadas de forma repetida y fiable, lo que permite realizar estudios cuantitativos utilizando herramientas farmacológicas. Las respuestas de Ca2+ en las células del ENS se registran utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de dispositivo de carga acoplada refrigerada (CCD). Las mediciones de fluorescencia obtenidas mediante imágenes de Ca2+ en preparaciones de montaje completo ofrecen un medio sencillo de caracterizar los mecanismos y las posibles consecuencias funcionales de las respuestas de Ca2+ en neuronas entéricas y células gliales.

El uso adecuado de esta técnica permite a los investigadores para medir con precisión Ca2 + intracelular [Ca 2 +] i transitorios en las neuronas entéricas y glía en todo el montaje en preparaciones de tejido. Un ejemplo representativo de un agonista-evocó Ca 2 + respuestas en glía dentro de un ganglio mientérico del colon de ratón se muestra en Video 1. Los resultados siguientes están destinados a ilustrar algunos resultados representativos que hemos obtenido usando este método. En primer lugar, la figura 2 ilustra los resultados de un experimento que mide la glía entérica [Ca 2 +] i los cambios en la respuesta a la estimulación por el ATP dentro de los preparativos de cobaya colon plexo mientérico muscular longitudinal (LMMP). Específicamente, esta figura muestra el método para el análisis adecuado del protocolo experimental enumerados anteriormente, incluyendo el contorno de la ganglionares y asteriscos denotan la localización de las neuronas entéricas mientérico analizado. Estos resultados tambiénllustrate la dosis óptima de un centenar de ATP micromolar en la movilización de [Ca 2 +] i en el conejillo de indias glía mientérico. Esta respuesta puede ser utilizado para calibrar la estimulación glial entérico y normalizar las respuestas para poner a prueba los estímulos. A continuación, la Figura 3 aclara cómo seleccionar adecuadamente las regiones de interés (ROI) que rodea las células gliales, que se muestra y la zona círculos amarillos. Estos resultados también muestran los cambios de fluorescencia deseados bajo condiciones basales y en respuesta a estímulos farmacológicos. Finalmente, la figura 4 muestra las consideraciones espaciales para la elección de la glía entérica y neuronas de [Ca 2 +] i en las respuestas de los preparativos de todo el montaje. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Figura 1. Organización de la ENS. La ENS contiene dos grandes plexos ganglionares. El plexo mientérico se encuentra entre el lcapas musculares ongitudinal y circulares. El plexo submucoso está situado entre la mucosa y la capa muscular circular. La ENS está exclusivamente compuesto por neuronas y glía entérica. Tractos de fibras nerviosas se conectan los ganglios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Figura 2. entérica glía en el conejillo de indias de colon responden plexo mientérico de ATP in situ. (A) Fluo-4 de fluorescencia en un ganglio mientérico (delineado por la línea de puntos) en condiciones basales. Las flechas apuntan a tractos de fibras interganglionic gruesos. (B) Después de la estimulación con 100 mmol / L de ATP, las células gliales, pero no neuronas, aumentan rápidamente Fluo-4 de fluorescencia que indica un aumento de la [Ca 2 +] <sub&gt; i. Tenga en cuenta que las células que responden son pequeñas y rodean las neuronas mucho más grandes (espacios oscuros marcados con un asterisco). (C) glía entérica responder a ATP en una forma dependiente de la dosis con 1 mmol / L provocar respuestas máximas 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> + Células Figura 3. murino S-100-GFP en el colon responden plexo mientérico a ATP in situ. (A) células gliales (verde) en un ratón de colon ganglio mientérico S-100-GFP + (esbozados por línea de trazos). Seis regiones de interés (ROI) que rodea las células gliales en los ganglios se muestran como círculos amarillos. Las flechas indican los tractos de fibras gruesas que llevan en el ganglio. Los asteriscos dubicación enote de 2 neuronas entéricas. (B) La misma muestra de ganglio Rhod-2 fluorescencia bajo condiciones basales. (C) Después de la estimulación con 100 mol / L ATP, las células gliales responden con un aumento de [Ca2 +] i como se muestra por el aumento de Rhod- 2 de fluorescencia. (D) Huellas correspondiente a cada retorno de la inversión se muestra en A-C. (E) con un promedio de respuesta (media ± SEM) de las 6 regiones de interés se muestran en D 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> La Figura 4. En las imágenes in situ de comunicación entérica-neurona-glía a. (A) Imágenes representativas (pseudocoloreada) de un experimento de imágenes de Ca 2+ en su conjunto de montajepreparación del plexo mientérico fue impugnada con el agonista del receptor neuronal P2X7 BzATP (100 m, 30 s). Tenga en cuenta que el agonista neuronal provoca un aumento en la fluorescencia Fluo4 en la neurona (A &#39;) antes de las células circundantes entéricos gliales (A &quot;). (B) Análisis del cambio en la fluorescencia con el tiempo en la glía (azul) y las neuronas (rojo ) tras la aplicación del agonista neuronal, BzATP. (C) Neuronal y respuestas gliales a BzATP en tampón normal (líneas continuas) y en tampón que contenía bajo Ca 2+ y Mg 2+ (líneas de trazos) para potenciar los receptores P2X7 neuronales 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Vídeo 1. agonista-evocó Ca 2 + respuesta en glía entérica ensitu. Este video muestra un ganglio mientérico del colon distal ratón cargado con el Ca 2 + colorante indicador, Fluo-4. El agonista de células gliales, ADP, se añade al baño cuando esté indicado. ADP provoca un aumento de Ca2 + intracelular en glía entérica como se observa por la elevación transitoria de Fluo-4 fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.</a>

El sistema nervioso entérico (SNE) es una red de neuronas y glía localizada en la pared intestinal que controla los reflejos intestinales. Este protocolo describe los métodos para registrar la actividad de las neuronas entéricas y la glía en preparaciones vivas de ENS utilizando imágenes de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervioso entérico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de la actividad de neuronas y células gliales entéricas en preparaciones de intestino completo y vivas utilizando colorantes fluorescentes indicadores de calcio. Esto se logra primero mediante la extirpación de una porción de intestino del animal y su colocación en un medio precalentado. El segundo paso consiste en abrir el intestino a lo largo del borde mesentérico y fijarlo plano bajo ligera tensión, con la superficie mucosa hacia arriba.Los preparados en montaje completo del plexo mientérico se preparan mediante microdisección y se colocan en placas para imágenes. A continuación, los preparados en montaje completo se cargan con un colorante fluorescente indicador, flu oh four, en un incubador. En los pasos finales, los preparados cargados se visualizan utilizando un microscopio de imágenes fluorescentes equipado con una cámara de alta resolución controlada por un software de adquisición y análisis de imágenes para registrar la actividad basal.Luego se añaden los fármacos bajo investigación y se registran los transitorios de calcio en neuronas y glía. Finalmente, in situ. La imagen de calcio del sistema nervioso entérico se utiliza para estudiar cómo la actividad celular en neuronas y glía contribuye a la regulación de las funciones fisiológicas del intestino y al disfuncionamiento del sistema nervioso entérico en la fisiopatología intestinal.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el establecimiento de una comprensión de la fisiología y la patofisiología de los trastornos funcionales intestinales y la enfermedad inflamatoria intestinal mediante el uso de un método sencillo y robusto para examinar la compleja interacción entre neuronas y glía entérica utilizando la imagen de calcio en dos células, demostrando que este procedimiento será libre de derechos para científicos de mi laboratorio. Los siguientes procedimientos que involucran tejido de animales de laboratorio son coherentes con las directrices de la A VMA para la eutanasia de animales de 2013, y fueron aprobados con antelación por el comité I-A-C-U-C de la Universidad Estatal de Michigan. Tras la eutanasia del animal según los procedimientos aprobados, coloque al animal en posición supina y limpie la piel del abdomen con etanol al 70 %. Use pinzas para pellizcar la piel abdominal en la línea media y luego use tijeras quirúrgicas para realizar una incisión medial de seis centímetros a lo largo de la línea media para exponer los órganos digestivos internos.A continuación, utilice pinzas romas para localizar y exponer el colon dentro del peritoneo. Corte el mesenterio del colon ileal con tijeras y comience a desenrollar el intestino. Una vez que el intestino esté suficientemente desenrollado, corte el colon distal al ciego y proximal al recto para obtener una preparación del intestino grueso, lo cual se mostrará en este video.Luego retire rápidamente el segmento intestinal y colóquelo en un vaso de precipitados que contenga medio DM EMF 12 suplementado con tres micromoles de clorhidrato de nicardipina y un micromol de clorhidrato de escopolamina S sobre hielo. La adición de estos inhibidores facilita la microdisección y la visualización posterior al paralizar el músculo liso intestinal. Retire un pequeño segmento de cuatro a seis centímetros del segmento intestinal deseado y colóquelo en una placa de Petri recubierta con Sylgard y llena con medio frío suplementado.Luego, sujete los extremos proximal y distal del segmento intestinal con alfileres para insectos y abra el tubo intestinal realizando un corte longitudinal recto a lo largo del borde mesentérico. A continuación, extienda el tejido plano bajo ligera tensión con la mucosa hacia arriba y disecque cuidadosamente la capa mucosa levantando la mucosa con pinzas finas número cinco y cortando por debajo con tijeras de resorte muy finas. Corte el tejido en preparaciones más pequeñas de aproximadamente 0,5 centímetros cuadrados y coloque cada fragmento en un recipiente para imágenes lleno de medio suplementado, colocándolo luego sobre hielo.Fije cada preparación en las cuatro esquinas con la capa de músculo circular hacia arriba. Diseque cuidadosamente el músculo circular separándolo con pinzas finas. Para exponer el plexo mientérico, evite estiramientos excesivos, coloque nuevamente las placas de imagen sobre hielo y reemplace la solución en cada placa con medio suplementado fresco.A continuación, retire los cultivos de hielo y agregue dos mililitros de la mezcla enzimática a cada cultivo; incube a temperatura ambiente con 5% de dióxido de carbono y 95% de aire durante 15 minutos. Finalmente, lave las preparaciones de tejido con medio tres veces y retire las esquinas mientras trabaja en condiciones de luz limitada para evitar el fotoblanqueo, utilizando 1,5 mililitros de medio suplementado y 1,2 microlitros de un stock de probit de 250 milimolar hasta un volumen final de 1,5 microlitros de Eloqua de un stock de Fluro cuatro de cuatro milimolar, obteniendo aproximadamente 1,5 mililitros de solución de carga de flu oh cuatro para los cultivos de imagen, e incube en un incubador oscuro a 37 grados Celsius durante 45 minutos. Tras retirar los cultivos del incubador, lave las preparaciones tres veces con medio.Luego, agregue medio fresco que contenga 200 micromolares de ácido propiónico para mejorar la marcación neuronal y incube como antes durante 15 minutos. Durante la incubación, prepare un tampón de Krebs modificado según las instrucciones de la parte escrita del protocolo, y añada tres micromolares de nicardipina y un micromolar de escopolamina para inhibir las contracciones musculares. Durante la obtención de imágenes de calcio dos más y los disecciones en montaje completo, coloque la cámara de registro bajo el microscopio fluorescente y utilice un sistema de perfusión por gravedad con múltiples reservorios de jeringas calentados.Establezca un flujo de perfusión continuo de dos a tres mililitros por minuto de tampón de Krebs a 37 grados Celsius. Asegúrese de prevenir la formación de burbujas de aire tanto en la línea de entrada como en la de succión conectada a una trampa de vacío. Enfoque el plexo deseado bajo iluminación de campo claro.Evite la sobreexposición del tejido, ya que podría provocar fotoblanqueo. Examine la carga de flu oh cuatro dentro de los ganglios y seleccione ganglios sanos para la obtención de imágenes. Los ganglios dañados o no sanos mostrarán autofluorescencia o morfología punteada y no deben utilizarse para la obtención de imágenes.Una vez seleccionado un ganglio, desvíe el trayecto de la luz hacia la cámara y obtenga una imagen en vivo. Con el software de adquisición de imágenes, asegúrese de que el ganglio esté enfocado y configure la frecuencia de adquisición de imágenes y los tiempos de exposición. Las frecuencias y tiempos de adquisición de imágenes variarán según los eventos que los investigadores deseen registrar. Para la mayoría de los experimentos, tradicionalmente se adquieren imágenes a entre 0,5 y un hercio para células gliales y hasta entre dos y 10 hercios.Para las neuronas, dado que los transitorios de calcio en las células gliales no son tan rápidos como los transitorios de calcio en las neuronas, inicie la grabación y establezca la actividad fisiológica basal del ganglio seleccionado en ausencia de estímulos experimentales durante 30 segundos. Luego, aplique los fármacos de interés previamente calentados, como agonistas y antagonistas de receptores, utilizando el sistema de perfusión por gravedad a una velocidad de dos a tres mililitros por minuto, según un protocolo optimizado para su fármaco. Detenga la grabación y visualice la película lapse de tiempo del experimento.Seleccione cuidadosamente las regiones de interés o ROI utilizando el software adecuado de análisis de imágenes. Finalmente, utilice un software de imagen adecuado para normalizar y comparar la intensidad fluorescente de las regiones de interés respecto a su valor inicial de referencia. Los cambios en la fluorescencia normalizada son directamente proporcionales a los cambios en calcio. Las siguientes tres imágenes demuestran que la glía entérica en el conejillo de indias responde a un TP in situ.Bajo condiciones basales, se observa un nivel bajo de fluorescencia de fluoro cuatro indicado por la línea punteada. Las flechas señalan los gruesos tractos de fibras interganglionares tras la estimulación con 100 µmol/L de ATP; las células gliales, pero no las neuronas, aumentan rápidamente la fluorescencia de fluoro cuatro, lo que indica un incremento en calcio. Obsérvese que las células que responden son pequeñas y rodean a las neuronas mucho más grandes, indicadas por los espacios oscuros marcados con asterisco.Este histograma muestra que la glía entérica responde a un TP de manera dependiente de la dosis, siendo un milimol por litro la concentración que provoca respuestas máximas. Este video muestra un ganglio mientérico del colon distal de ratón cargado con un colorante indicador de calcio dos más, flu oh cuatro. El agonista de las células gliales a DP se añade al baño cuando se indica.Un DP provoca un aumento en el calcio intracelular dos más en las células gliales entéricas, tal como se observa por la elevación transitoria en la fluorescencia de flu oh cuatro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar con precisión la compleja interacción entre neuronas y células gliales utilizando imágenes de calcio. La caracterización de los mecanismos y las posibles consecuencias funcionales de las respuestas de calcio en preparaciones de montaje completo requiere disecciones precisas para lograr una calidad óptima de imagen. El uso de marcado fluorescente y estímulos farmacológicos dentro de esta técnica basada en microscopía permite una evaluación mejorada de estas células en su entorno multicelular nativo.

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Investigación

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Neurociencia

Este protocolo se ilustra cómo los tintes sensibles al voltaje activar la grabación óptica de la actividad eléctrica de las redes neuronales intactos como los plexos de la cobaya sistema nervioso entérico, con una resolución ajustable que va desde una sola de las células ganglionares de varios circuitos.

Grabación óptica de la actividad eléctrica en el conejillo de Indias Redes entérica con tintes sensibles al voltaje

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Aislamiento de células gliales entéricas de la submucosa y la lámina propia de un ratón

Este video demuestra la inmunotinción del tracto gastrointestinal murino embrionario para visualizar y analizar la distribución de la población neuronal utilizando inmunofluorescencia y microscopía confocal.

Tinción inmunofluorescente de poblaciones neuronales en el tracto gastrointestinal murino embrionario

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Fuente: Doser, R., et al. Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Este video demuestra imágenes in vivo del flujo de calcio subcelular en las neuronas del cordón nervioso ventral de cepas transgénicas de Caenorhabditis elegans. Se emplean dos indicadores de calcio distintos: un indicador citoplasmático en una cepa y un indicador mitocondrial en otra. Las neuronas se observan bajo un microscopio de fluorescencia para monitorear los cambios en tiempo real...

Imágenes de la dinámica subcelular del calcio en neuronas de Caenorhabditis elegans

Demostramos un protocolo de cultivo celular para el estudio directo de los componentes neuronales y gliales del sistema nervioso entérico. Se prepara un cultivo mixto de neurona/glía en cubreobjetos a partir del plexo mientérico de un ratón adulto, lo que proporciona la capacidad de examinar la función individual de las neuronas y la glía mediante electrofisiología, inmunohistoquímica, etc.

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

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La inmunotinción para visualizar murino entérica Desarrollo del Sistema Nervioso

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Imágenes de vídeo y mapas espacio-temporales para Analizar la motilidad gastrointestinal en ratones

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In Vitro de grabación de la actividad nerviosa aferente mesentérica en ratón yeyunal y segmentos del colon

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de biomoléculas en función de su vibración intrínseca de enlaces químicos específicos. En este protocolo, se describe la configuración instrumental de un SRS integrado y un microscopio de fluorescencia de dos fotones para visualizar las estructuras celulares en la médula espinal de ratones vivos.

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Aprende a realizar imagen de calcio in situ en el sistema nervioso entérico utilizando preparaciones de intestino de montaje completo. Este método permite estudiar la actividad neuronal y glial en tiempo real para comprender la fisiología intestinal.

In Situ Ca ²⁺ Imaging del sistema nervioso entérico

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