In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervioso entérico

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de la actividad de las neuronas entéricas y la glía en preparaciones vivas de montaje completo del intestino utilizando tintes indicadores de calcio fluorescentes. Esto se logra extirpando primero una porción de intestino del animal y colocándola en un medio precalentado. El segundo paso es abrir el intestino a lo largo del borde mesentérico y sujetarlo con alfileres bajo una tensión ligera con la superficie mucosa hacia arriba.

Las preparaciones de montaje completo del plexo mientérico se preparan por microdisección y se colocan en placas de imagen. A continuación, todas las preparaciones de la montura se cargan con un tinte indicador fluorescente flu oh cuatro en una incubadora. En los pasos finales, las preparaciones cargadas se visualizan utilizando un microscopio de imágenes fluorescente equipado con una cámara de alta resolución controlada por un software de adquisición y análisis de imágenes para registrar la actividad de referencia.

A continuación, se añaden los fármacos que se están investigando y se registran los transitorios de calcio en las neuronas y la glía. En última instancia, in situ. Las imágenes de calcio del sistema nervioso entérico se utilizan para estudiar cómo la actividad celular en las neuronas y la glía contribuye a la regulación de las funciones intestinales fisiológicas y la disfunción del sistema nervioso entérico en la fisiopatología intestinal.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el establecimiento de una comprensión de la fisiología y la fisiopatología de los trastornos funcionales del intestino y la enfermedad inflamatoria intestinal mediante el uso de un método simple y robusto para examinar la compleja interacción entre las neuronas y la glía entérica utilizando imágenes de calcio NC dos que demuestran que este procedimiento será gratuito para los científicos de mi laboratorio. Los siguientes procedimientos que involucran tejido de animales de laboratorio son consistentes con las pautas A VMA para la eutanasia de animales 2013, y fueron aprobados por adelantado por la Universidad Estatal de Michigan I-A-C-U-C Después de sacrificar al animal de acuerdo con los procedimientos aprobados, coloque al animal en posición supina y limpie la piel sobre el abdomen con etanol al 70%. Use fórceps para pellizcar la piel abdominal en la línea media y luego use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión medial de seis centímetros a lo largo del codo lineal para exponer los órganos digestivos internos.

A continuación, utilice pinzas romas para localizar y exponer el colon dentro del peritoneo. Corta el mesenterio del colon ileal con unas tijeras y comienza a desenredar el intestino. Una vez que la longitud del intestino se haya desenredado adecuadamente, corte el colon distal al ciego y proximal al recto para una preparación del intestino grueso, que se mostrará en este video.

A continuación, extraiga rápidamente el segmento intestinal y colóquelo en un vaso de precipitados que contenga DM EMF 12 Media suplementado con tres micromolares de clorhidrato de nicardipina y un micromolar de clorhidrato de escopolamina S en hielo. La adición de estos inhibidores facilita la microdisección y la posterior obtención de imágenes mediante la parálisis del músculo liso intestinal. Retire un pequeño segmento de cuatro a seis centímetros del segmento intestinal deseado y colóquelo en una placa de Petri recubierta con protector de silo llena de medios suplementados refrigerados.

A continuación, asegure los extremos proximal y distal del segmento intestinal con alfileres de insectos y abra el tubo intestinal haciendo un corte recto a lo largo del borde mesentérico. A continuación, sujete el tejido con alfileres bajo una tensión ligera con el lado de la mucosa hacia arriba y diseccione cuidadosamente la capa mucosa levantando la mucosa con pinzas finas número cinco y cortando por debajo con unas tijeras de resorte muy finas. Corte el tejido en preparaciones más pequeñas de aproximadamente 0,5 centímetros cuadrados y coloque cada pieza en un plato de imágenes lleno de medios suplementados y colóquelo en hielo.

Sujete cada preparación con alfileres en las cuatro esquinas con una capa muscular circular hacia arriba. Disecciona cuidadosamente el músculo circular separándolo con pinzas finas. Para exponer el plexo mientérico, evite el estiramiento excesivo, vuelva a colocar las placas de imágenes en hielo y reemplace la solución en cada placa con medios nuevos suplementados.

A continuación, retire los platos del hielo y agregue dos mililitros de mezcla de enzimas a cada plato e incube a temperatura ambiente con 5% de dióxido de carbono y 95% de aire durante 15 minutos. Por último, lave las preparaciones de papel tisú con medios tres veces y controle las esquinas mientras trabaja en condiciones de luz limitada para evitar el fotoblanqueo a 1,5 mililitros de medios suplementados y 1,2 microlitros de un caldo probit de 250 milimolares a un Eloqua de 1,5 microlitros de cuatro milimolares Fluro cuatro caldos a aproximadamente 1,5 mililitros de flu oh cuatro cargando la solución a las placas de imágenes e incubar en una incubadora oscura a 37 grados centígrados durante 45 acta. Después de retirar los platos de la incubadora, lave las preparaciones tres veces con medios de comunicación.

A continuación, añada un medio fresco que contenga 200 micromolares de ácido prop para mejorar el marcaje neuronal neural e incube como antes durante 15 minutos. Durante la incubación, prepare un tampón Krebs modificado de acuerdo con las instrucciones de la parte escrita del protocolo, y agregue tres micromolares de nicardipina y un micromolar de escopolamina para inhibir las contracciones musculares. Durante las disecciones de calcio más imágenes y de montaje completo, coloque la cámara de registro bajo el microscopio fluorescente y utilizando un sistema de perfusión de flujo por gravedad con múltiples depósitos de jeringa calentados.

Establecer una tasa de perfusión continua de dos a tres mililitros por minuto de tampón Krebs de 37 grados centígrados. Asegúrese de evitar la formación de burbujas de aire tanto en la entrada como en la línea de succión conectada a una trampa de vacío. Enfoca el plexo deseado bajo una iluminación de campo claro.

Evite sobreexponer el tejido, lo que puede provocar un fotoblanqueo. Examine la gripe que se carga dentro de los ganglios y seleccione ganglios sanos para la toma de imágenes. Los ganglios dañados en mal estado exhibirán autofluorescencia o morfología punteada y no deben usarse para la toma de imágenes.

Una vez seleccionado un ganglio, desvíe la trayectoria de la luz a la cámara y obtenga una imagen en vivo. Con el software de adquisición de imágenes, asegúrese de que el ganglio esté enfocado y establezca la tasa de adquisición de imágenes y los tiempos de exposición Las tasas y los tiempos de adquisición de imágenes variarán según los eventos que los investigadores deseen registrar. Para la mayoría de los experimentos, las imágenes se adquieren tradicionalmente a 0,5 a un hercio para las células gliales y hasta dos a 10 hercios.

Para las neuronas, debido a que las neuronas transitorias de calcio glial no son tan rápidas como las neuronas transitorias de calcio, inicie el registro y establezca la actividad fisiológica de referencia del ganglio elegido en ausencia de estímulos experimentales durante 30 segundos. A continuación, aplique fármacos precalentados de interés, como agonistas y antagonistas de los receptores, utilizando el sistema de perfusión de flujo por gravedad a una velocidad de dos a tres mililitros por minuto, de acuerdo con un protocolo optimizado para su fármaco. Detenga la grabación y vea la película de lapso de tiempo del experimento.

Seleccione cuidadosamente las regiones de interés o el retorno de la inversión utilizando el software de análisis de imágenes adecuado. Por último, utilice un software de imagen adecuado para normalizar y comparar la intensidad fluorescente de las regiones de interés con su referencia inicial. Los cambios en el valor de la fluorescencia normalizada son directamente proporcionales a los cambios en el calcio. Las siguientes tres imágenes demuestran que la glía entérica en el conejillo de indias responde a un TP in situ.

En condiciones basales, es visible una fluorescencia de fluoro cuatro de bajo nivel delineada por la línea discontinua. Las flechas apuntan a gruesos tractos de fibras interganglionares tras la estimulación con células gliales A TP de 100 micro meses por litro, pero no las neuronas aumentan rápidamente la fluorescencia de fluoro cuatro, lo que indica un aumento de calcio. Tenga en cuenta que las células que responden son pequeñas y rodean a las neuronas mucho más grandes, indicadas por los espacios oscuros marcados con asteriscos.

Este histograma muestra que la glía entérica responde a un TP de manera dependiente de la dosis, con un milimol por litro que provoca respuestas máximas. Este video muestra un ganglio mientérico del colon distal del ratón cargado con un colorante indicador de calcio dos más gripe oh cuatro. El agonista de células gliales un DP se añade al baño cuando está indicado.

Una DP provoca un aumento en el calcio intracelular más dos en la glía entérica, como se observa por la elevación transitoria en la fluorescencia de la gripe oh cuatro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar con precisión la compleja interacción entre las neuronas y usar empíricamente imágenes de calcio. La caracterización de los mecanismos y las posibles consecuencias funcionales de las respuestas de calcio en las preparaciones de montaje completo requiere disecciones precisas para obtener una calidad de imagen ideal.

El uso de marcaje fluorescente y estímulos farmacológicos dentro de esta técnica basada en microscopía permite una mejor evaluación de estas células en su entorno multicelular nativo.