Name: Th17 Inflamación Modelo de candidiasis orofaríngea en ratones inmunodeficientes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo de inflamación oral mediada por células Th17 en ratones inmunodeficientes infectados con Candida albicans. Este método permite estudiar la inmunopatología mediada por células T y explorar aplicaciones en inmunoterapia oral.

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Agradecemos a la Dra. Helene Bernstein por proporcionarnos acceso a su citómetro de flujo. También agradecemos al centro de citometría de flujo CFAR por los servicios de citometría de flujo. Este proyecto fue financiado en parte por los fondos de utilización básica de CTSC y la subvención de la División de Enfermedades Infecciosas de la Corporación STERIS/Hospitales Universitarios a PP.

NOTA: Los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con el comité de bienestar de los animales institucional (IACUC) directrices. 1. Reconstitución de la RAG-1 - / - ratones con células I n Vitro Cultivadas Th17 (Tres días antes de la infección) <ol><li> Para el establecimiento de las células Th17, cultura CD4 + CD25 CD44low CD62Lhigh células T naïve (3 x 104) en placas de 96 pocillos de fondo en U solo, o co-cultivo ellos junto con 3 x 104 células CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg en presencia de solubles α-CD3 (1 mg / ml), α-CD28 (2 g / ml) anticuerpos y células presentadoras de antígeno, en condiciones Th17 (polarizados usando IL-6 (25 ng / ml), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 mg / ml) y α -IL-4 (2 mg / ml)) durante tres a cuatro días. NOTA: Las células ingenuo y T regs fueron ordenados usando células activadas por fluorescencia (FACS) und procedimientos de aislamiento celular magnética y se cultivaron como se ha descrito previamente 19-22. </li><li> El día 4, después de resuspensión de las células Th17 utilizando la pipeta, recogerlos a partir de cultivos, y centrifúguelas en condiciones estériles. <ol><li> Tomar una pequeña alícuota de estas células para examinar su viabilidad y por el fenotipo. Resuspender en 500 l de medio RPMI, añadir yoduro de propidio (200 ng / ml) y evaluar su viabilidad inmediatamente por citometría de flujo. Realizar fenotipificación por citometría de flujo de evaluación de la producción de IL-17A después de la re-estimulación (ver sección 6.3). </li></ol></li><li> Centrifugar y lavar el grueso de las células en PBS estéril a 480 xg durante 6 min a 4 ° C en todos los pasos a menos que se especifique lo contrario. </li><li> Utilice estas células para la transferencia adoptiva en 6-8 semanas de edad CD45.2 Rag1 - / - ratones inmunodeficientes. <ol><li> Resuspender las células a la densidad celular 1 x 10 7 células / ml usando PBS estéril frío. </li><li> Inyectar 100 l de las células por intrapinyección eritoneal, utilizando 25 G agujas en 1 ml jeringas de tuberculina, de tal manera que un ratón recibe 1 x 10 6 células. Algunos ratones recibirán células PBS o Th17 solamente, y otros ratones recibirán las células Th17 que fueron co-cultivadas con células Treg. NOTA: Realice todos los pasos de forma aséptica. </li></ol></li></ol> 2. Crecimiento C. albicans para la infección (un día antes de la infección) <ol><li> Antes de la inoculación, dispersar cinco colonias de la CAF2-1 C. cepa albicans laboratorio en 100 l de suspensión de PBS estéril, y añadir la suspensión al caldo estéril. </li><li> Inocular 5 colonias de la C. albicans en 50 ml de la base de nitrógeno de levadura (YNB sin aminoácidos) / Peptona medio / caldo de dextrosa y se incuba en un incubador agitador a 30 ° C durante 15-18 horas a 130 rpm. </li><li> Monitorear el caldo de nubosidad, ya que es una indicación para el crecimiento del hongo. </li></ol> 3. CandidaLa cosecha y el procedimiento de conteo (En el Día de la infección) <ol><li> Recoger 10 ml de caldo de Candida en tubos de 15 ml. Para volúmenes mayores, recoger Candida en tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar las blastosporas en 1900 xg durante 5 min a RT en todos los pasos a menos que se especifique lo contrario. Sedimentar las blastosporas por centrifugación, seguido por la eliminación del sobrenadante. </li><li> Si hay más de un tubo, agrupar los blastosporas de Candida a partir de múltiples tubos, la adición de PBS estéril para los pellets y resuspender en 10 ml de PBS para el conteo. </li><li> Tomar 20 l de blastosporas en 1,5 ml tubos de microcentrífuga, añadir 20 l de la paraformaldehído 2X e incubar a temperatura ambiente durante 15 a 20 min. Contar las blastosporas fijos utilizando el hemocitómetro bajo el microscopio. NOTA: El paraformaldehido es cancerígeno. Abra la solución sin diluir sólo en la campana de humos. </li><li> Mientras tanto, repetir el lavado de las blastosporas al menos dos veces, por centrifugación tdobladillo en PBS, y la granulación las blastosporas. Mantenga las pastillas en tubos de 15 ml a temperatura ambiente, en la campana ABSL1, listas para la infección. </li><li> Deje algo de PBS estéril a temperatura ambiente durante la resuspensión de las blastosporas de infección. </li><li> Después de contar, añadir PBS estéril al sedimento blastospore para ajustar el número de células de levadura blastosporo a 2 x10 8 de levadura células / ml. Esta es la suspensión blastospore que se utilizó para infectar los ratones. NOTA: Realice todos los pasos de forma aséptica. </li></ol> 4. Los ratones Infección (3-5 días después de la transferencia de la célula) NOTA: El procedimiento básico infección se realizó como se describió anteriormente 19,23-25. <ol><li> Pese la RAG-1 - / - ratones que recibieron PBS o las células tres días antes. </li><li> Calcular la dosis de los agentes anestésicos que utilizan su peso corporal. Anestesiar a los ratones mediante la administración de ketamina / mezcla de xilazina (16,1 mg / ml y 1,6 mg / ml), utilizando 25 g de agujas en 1 ml jeringas de tuberculina, por intrinyección aperitoneal. <ol><li> Administrar 50 l por 10 gramos de peso corporal. (Es decir, 0,8 mg de ketamina y 0,08 mg de xilazina / 10 g de peso corporal o 80 mg de ketamina y 8 mg de xilazina por kg de peso corporal, respectivamente). Observe la respuesta pizca dedo cada 15 minutos después de la anestesia. NOTA: Esta dosis inducirá 60-90 min de la anestesia, lo cual es suficiente para el procedimiento de infección. </li><li> Aplique el ungüento lubricante oftálmica a los ojos de los ratones para evitar las córneas se sequen. A medida que el lubricante ocular podría secarse y repetir lubricación oftálmica cada 45 min. </li></ol></li><li> Inyectar 1 ml de solución salina (0,9% NaCl) por vía subcutánea en la parte posterior adyacente a la extremidad anterior, para ayudar a la rehidratación de los ratones durante la anestesia. </li><li> Obtener una nueva, jaula limpia. Siga la infección procedimiento de un ratón a la vez, la colocación de cada ratón en la nueva jaula una vez infectados. Realice la infección PBS / farsa primero, y luego proceder a las gro de infección por Candidaups. </li><li> Coge el ratón anestesiado y abrir la boca para revelar la base de la lengua. <ol><li> Coloque una bola de algodón diámetro 3 mm saturado con 50 l de PBS o blastospore suspensión, por vía sublingual en la cavidad oral durante 90 min. Da la vuelta al ratón todos los frentes 15 min y la espalda para evitar la congestión pulmonar, lo que garantiza que las bolas de algodón no se mueven. </li></ol></li><li> Establecer un temporizador para cada ratón para asegurar 90 min de Sham o Candida inoculación en la cavidad oral. </li><li> Manténgalos en una jaula bajo la lámpara de calor (4 metros de distancia), y cada ratón sobre almohadillas de gel de calor. </li><li> Asegúrese de que la lengua se retira dentro y fuera de los dientes, para evitar los dientes lacerantes la lengua. </li><li> Al final de 90 minutos, retire la bola de algodón de la boca del ratón. Esté atento a cualquier ratón que pueden recuperarse de la anestesia antes de 75 minutos. En tal caso, anestesiar a ellos de nuevo con ketamina (40 mg / kg) solamente. </li></ol> 5. Publicar Procedure Monitoreo (durante los 90 minutos de anestesia) <ol><li> Use almohadillas de gel de calor durante la anestesia 90 min. <ol><li> Para mantener la temperatura del cuerpo y para evitar la asfixia, no permita que los ratones que se recuperan en la ropa de cama regular de ratón mazorca de maíz. </li></ol></li><li> Después de la recuperación de la anestesia, administrar un adicional de 1 ml de solución estéril de NaCl al 0,9% por vía subcutánea en dos lugares en la parte posterior. </li><li> Infórmate de los cinco PBS (simulado) los ratones inoculados por jaula. Casa sólo 1-2 ratones infectados por jaula. </li><li> Llene la tarjeta de procedimiento con las iniciales todos los días después del procedimiento para anotar los cambios en el peso corporal, hábitos de aseo y la salud en general. </li></ol> 6. Evaluación de la inflamación 6.1) La pérdida de peso <ol><li> Pesar los ratones cada día durante la infección, comenzando en el día antes del procedimiento infección. NOTA: Por lo general, los ratones inmunodeficientes inyectados con células Th17 y sin T regs sucumben a 20Pérdida de peso -30% debido al aumento de la carga de hongos 19 y exacerba la inflamación. </li></ol> 6.2) Histología de puntuación de la lengua <ol><li> Sacrificar los ratones por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical. </li><li> Abra las mordazas y diseccionar la lengua con tijeras y pinzas. El uso de fórceps romos para sostener la lengua, y el uso de las tijeras llegan a la parte posterior de la boca para incidir el extremo posterior de la lengua. </li><li> Para hematoxilina inmuno y eosina (H &amp; E) tinción de los tejidos de la lengua, enjuague los tejidos de la lengua con helado de PBS. Añadir 5 ml de formalina al 10% durante 2-3 lenguas y fijarlos O / N en tubos de 15 ml. <ol><li> Al día siguiente, eliminar el formol y sumergir los tejidos en 5 ml de etanol al 70% para evitar la hiper-fijación. Enviarlos a un servicio comercial para continuar con la inclusión en parafina, corte y tinción de secciones de parafina. NOTA: El servicio de histología comercial se utiliza para realizar estos pasos. </li&gt; </ol></li><li> Una vez que los portaobjetos están de vuelta desde el servicio de histología comercial, el grado de la inflamación mediante la observación de las secciones de tejido bajo un microscopio de luz. <ol><li> Puntuación de 0 a 5, siendo 0 ausencia de inflamación, y 5 la inflamación más severa. Partitura la inflamación usando la Tabla 1. </li></ol></li></ol> 6.3) La producción de citocinas por las células Th17 NOTA: la producción de TNF-α excesiva es una de las lecturas para inmunopatología excesivas. Cuando los ratones se transfieren adoptivamente con células Th17 sólo, hace que la inmunopatología que está asociada con la producción excesiva de TNF-α en células Th17. <ol><li> Recoger una suspensión de células de bazo, los ganglios linfáticos cervicales, ganglios linfáticos axilares, y la lengua, usando métodos descritos previamente 19,26. </li><li> Reestimular las células con miristato acetato de forbol (PMA) (50 ng / ml) e ionomicina (500 ng / ml) durante 4 h con Brefeldina A (10 mg / ml) añadido en el last 2 hr. Lavar las células con PBS y fijarlos utilizando un kit de fijación / permeabilización comercial según las instrucciones del fabricante. </li><li> Realizar tinción de citoquinas intra celular utilizando el anti-TNF-α conjugados con fluorocromo, anti-IL-17A y anticuerpos ROR-γt como se describió anteriormente 19. </li><li> Brevemente, resuspender las células en el tampón de permeabilización 1X con el cóctel de anticuerpos anti-TNF-α, los anticuerpos ROR-γt anti-IL-17A y, cada anticuerpo a 2-3 mg / ml de concentración final. </li><li> Se incuban las células durante 1 hora a RT. </li><li> Después de la incubación, se lavan las células con tampón de permeabilización 1X. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS con 0,5% de albúmina de suero bovino para citometría de flujo análisis. </li></ol>

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<li>Quintin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+NK+cells+against+Candida+albicans+infection+in+immunocompetent+or+immunocompromised+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice.</a> Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).</li>
<li>Ramirez-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+cancer%3A+Can+this+yeast+induce+cancer+development+or+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression.</a> Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este modelo se basa en la inducción de C. Oral infección albicans inflamación dependiente Th17. Debido a la ausencia de T regs, la inflamación de células Th17 inducida es desenfrenada y conduce a la inmunopatología mal resuelto. In vitro derivan las células CD4 naive polarizados ya que se utilizaron células Th17 para la transferencia adoptiva. 40 - 50% de las células CD4 + cultivadas muestran detectable la expresión de IL-17A alrededor de 3 días (células Th17), y por lo tanto se uti...

Las infecciones orales y la inflamación se han relacionado con el cáncer y las enfermedades cardiovasculares, y tienen un impacto dramático en la salud humana en general2,3. Las infecciones oportunistas y la inflamación causada por C. albicans se asocian a inmunodeficiencias primarias (EIP)4,5, trastornos inflamatorios como periodontitis 6,7, síndrome de Sjögren y enfermedad de las glándulas salivales8,9, así como carcinoma oral de células escamosas 10-12. C. albicans es un hongo comensal dimórfico que coloniza asintomáticamente la boca del 60% de los humanos sanos, sin embargo, es el patógeno fúngico más común que causa infecciones cuando la defensa del huésped está debilitada13-15. Causa infecciones recurrentes y crónicas e inflamación en pacientes con SIDA y EIP, y también en otros individuos inmunocomprometidos. Como comensal, su carga de colonización se asocia con el cambio en la diversidad del microbioma oral general16. Como patógeno, causa varias formas de candidiasis orofaríngea, como la pseudomembranosa aguda, la atrófica aguda, la atrófica crónica, la hipertrófica/hiperplásica crónica y la queilitis angular. 
La protección contra C. albicans está determinada no solo por la resistencia inmunitaria del huésped, sino también por la capacidad de controlar adecuadamente la inmunopatología inducida por Candida. Aunque los comensales como C. albicans contribuyen a la modulación y exacerbación de otras afecciones inflamatorias orales, los mecanismos por los cuales se produce la disbiosis durante las infecciones oportunistas no están claros. Además del papel conocido de las células Th17 adaptativas en la respuesta de memoria a C. albicans17, su papel en el inicio y la perpetuación de la patología inflamatoria durante las infecciones crónicas sigue sin estar claro. Además, las enfermedades inflamatorias orales como el síndrome de Sjögren y la periodontitis se asocian a patología mediada por Th17. Curiosamente, estas enfermedades también están fuertemente asociadas con OPC frecuentes. Sin embargo, las interacciones entre las células Th17, la inmunopatología oral de OPC y otras enfermedades inflamatorias orales no están estudiadas. 
Aunque se dispone de modelos de ratón de infección primaria y secundaria de candidiasis oral, no se dispone de un modelo de ratón para estudiar la infección por Candida asociada a la inflamación Th17, especialmente en el contexto de la inmunodeficiencia. Este estudio presenta un método para establecer la inflamación oral por Th17 asociada con la infección oral por Candida en ratones. La infección por Candida en ratones se caracteriza por lesiones fúngicas, inflamación en la lengua, disminución de la ingesta de alimentos, pérdida de peso y, finalmente, un estado moribundo. La patología oral se asemeja a las lesiones crónicas por infección por cándida, así como a la displasia epitelial en modelos de cáncer oral en ratones12,18.

<table><tbody><tr><td>CAF-2</td><td>Universidad de Pittsburgh (Sarah Gaffen)</td><td>-</td><td>Cultivo de cándida</td></tr><tr><td>en U placas de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>055588</td><td>Se utiliza para el cultivo</td></tr><tr><td>celular a-CD3&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>La polarización de las células a las condiciones Th17</td></tr><tr><td>a-CD28&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>Polarización de las células a las condiciones Th17</td></tr><tr><td>m-IL-6</td><td>Bio Basic</td><td>RC232</td><td>Polarización de las células a las condiciones Th17</td></tr><tr><td>h-TGF-b&nbsp;</td><td>R& D</td><td>240-B</td><td>Polarización de las células a las condiciones Th17</td></tr><tr><td>a-IFN-g&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7311-85</td><td>La polarización de las células a las condiciones Th17</td></tr><tr><td>a-IL-4&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7041-85</td><td>Polarización de las células a las condiciones Th17</td></tr><tr><td>&alpha;-IL17A ef660</td><td>eBiosciences</td><td>50-7177-82</td><td>Utilizado para el cultivo celular - 1:50</td></tr><tr><td>&alpha;-TNFa-PE-Cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-7423-41</td><td>Utilizado para el cultivo celular - 1:100</td></tr><tr><td>&alpha;-RORgt PE&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>12-6981-82</td><td>Utilizado para cultivo celular - 1:50</td></tr><tr><td>YNB sin aminoácidos)/Peptona/Medio de caldo de dextrosa&nbsp;</td><td>Bio Básico</td><td>S507. TAMAÑO</td><td>Mediium para el crecimiento de cándida</td></tr><tr><td>Incubadora Shaker&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4300</td><td>Incubación de crecimiento para cándida</td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>Bio Basic</td><td>BT888-SY</td><td>Se utiliza para el cultivo celular y el crecimiento de cándida</td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>Bio Basic</td><td>CT 788-YS</td><td>Se utiliza para el cultivo celular y el crecimiento de cándida</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>VWR International LLC</td><td>82017-654</td><td>Para peletización de cándida -900 g</td></tr><tr><td>Centrífuga</td> <td>AllegraBeckman Coulter</td><td>392302</td><td>Cultivo celular - 480 g</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,5 ml</td> Bio <td>Basic</td><td>BT620-NS</td><td>Preparación de la concentración final de cándida</td></tr><tr><td>2x paraformaldehído</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Fijación de cándida para el recuento</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>VWR International LLC</td><td>15170-172</td><td>Recuento</td></tr><tr><td>de células PBS - Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td>Preparación de tampones</td></tr><tr><td>Ketamina/xilacina&nbsp;</td><td>Case Western Reserve University - Centro de Recursos para</td> <td>Animales-Obtenido</td> <td>del protocolo aprobado por ARC para anestesia</td></tr><tr><td>Pomada lubricante oftálmica&nbsp;</td><td>Allergan-Ungüento</td><td></td> <td>oftálmico para animales para prevenir la sequedad</td></tr><tr><td>Solución salina (0,9% NaCl)</td><td>G Biosciences</td><td>786-561</td><td>Administrado a animales para prevenir la deshidratación</td></tr><tr><td>Bola de algodón de 3 mm de diámetro&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BP7603</td><td>Bolas de 3 mm para la infección por cándida</td></tr><tr><td>Almohadillas de gel térmico</td><td>Case Western Reserve University - Animal Resource</td> <td>Center-para</td> <td>mantener la temperatura corporal y una recuperación rápida</td></tr><tr><td>Tinción de hematoxilina y eosina</td><td>Histoserv - MD-Histología</td><td></td> <td>tisular</td></tr><tr><td>10% formalina&nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>JC1111/MC</td><td>Histología tisular</td></tr><tr><td>70% etanol&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>97064-490 Propósito de</td><td>esterilización</td></tr><tr><td>PMA - Forbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>Reestimulación de células</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Life Technologies</td><td>124222 1mg</td><td>Reestimulación de células Kit de</td></tr><tr><td>permeabilización</td> de fijación <td>eBiosciences</td><td>E16913-106</td><td>Células de fijación para citometría de flujo</td></tr><tr><td>Jeringas de tuberculina</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>Ratones inyectable</td></tr><tr><td>25 G x 3/8 agujas</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Ratones inyectable</td></tr><tr><td>Rag1 -/- ratones</td><td>Jackson laboratories</td><td>Nº de inventario: 002216</td><td>Ratones receptores</td></tr><tr><td>CD45.1 ratones congénitos Jackson</td><td></td><td>laboratories Nº de inventario:002014&nbsp;</td><td>Células Th17 del donante</td></tr><tr><td>Ratones CB17-SCID Laboratorios</td><td>Jackson</td><td>Nº de inventario: 001303</td><td>Ratones receptores Ratones</td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>Laboratorios Jackson</td><td>Nº de inventario: 000651</td><td>Células Th17 donantes</td></tr></tbody></table>

th17 inflamación modelo de candidiasis orofaríngea en ratones inmunodeficientes

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

La enfermedad de candidiasis orofaríngea (OPC) se debe no solo a la falta de resistencia inmunitaria del huésped, sino también a la ausencia de una regulación adecuada de la inmunopatología inducida por la infección. Aunque las células Th17 están implicadas en la defensa antifúngica, su papel en la inmunopatología no está claro. Este estudio presenta un método para establecer la inmunopatología oral Th17 asociada a la infección oral por cándida en ratones inmunodeficientes. El método se basa en la reconstitución de ratones linfopenicos con células Th17 cultivadas in vitro, seguidas de una infección oral por Candida albicans (C. albicans). Los resultados muestran que las células Th17 sin restricciones provocan inflamación y patología, y se asocian con varias lecturas medibles, como la pérdida de peso, la producción de citocinas proinflamatorias, la histopatología de la lengua y la mortalidad, lo que demuestra que este modelo puede ser valioso en el estudio de la inmunopatología de OPC. La transferencia adoptiva de células reguladoras (Tregs) controla y reduce la respuesta inflamatoria, lo que demuestra que este modelo puede utilizarse para probar nuevas estrategias para contrarrestar la inflamación oral. Este modelo también puede ser aplicable en el estudio de la inmunopatología oral Th17 en general en el contexto de otras enfermedades orales.

En este modelo, tanto los ratones infectados con Candida y ratones no infectados en RAG-1 - / - de fondo inmunodeficiente se transfirieron de forma adoptiva con células Th17 3-5 días antes de la infección. Un total de 10-12 ratones fueron utilizados para los experimentos, con 2 ratones en cada Sham infectados grupos y 4-5 en cada uno de los grupos infectados Candida. Naive células se obtuvieron a partir Thy1.1 o CD45.1 congenic ratones, de modo que las células Th17 inyectados fueron rastread...

Aunque los modelos de infección por Candida están disponibles para estudiar la resistencia inmune del huésped, no existe un modelo para estudiar la inmunopatología mediada por células T en el contexto de la infección por Candida. En este trabajo describimos un método para establecer la inmunopatología Th17 asociada a la infección oral por Candida en ratones inmunodeficientes.

Th17 Inflamación Modelo de candidiasis orofaríngea en ratones inmunodeficientes

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un modelo de inflamación oral dependiente de infección que esté mediado por células TH17 patológicas. Esto se logra primero inyectando células TH17 en ratones inmunodeficientes. El siguiente paso consiste en cultivar el hongo Candida albicans, recolectar los blastoconidios y prepararlos en PBS.El paso final consiste en inyectar oralmente a los ratones con esporas de blasto para inducir la proliferación de las células TH 17 inyectadas y provocar inflamación oral. Los resultados muestran que los ratones inyectados con TH 17 sufren pérdida de peso e inflamación de la lengua, según el análisis mediante citometría de flujo e inmunohistoquímica de la lengua. Por lo tanto, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia oral, tal como lo demuestra este modelo murino.El modelo de inflamación TH17 también puede utilizarse para estudiar la inflamación TH17 en el contexto de otras enfermedades orales, demostrando que el procedimiento será realizado por mí y por un becario posdoctoral en vascularización con nitrógeno en mi laboratorio. Este procedimiento requiere células T naïve previamente clasificadas por citometría, y opcionalmente células Treg, para establecer cultivos de células TH17: células T naïve CD4 positivas, CD44 bajas, CD62L altas y CD25 negativas en placas UBO de 96 pocillos a 30.000 células por pocillo, en condiciones TH17 durante tres a cuatro días. Como control, las células T naïve pueden cultivarse junto con 30.000 células Treg CD4 positivas, CD25 positivas y FOX P3 positivas en las mismas condiciones de cultivo para generar células TH17. Después de cuatro días de cultivo, recolecte las células TH17 utilizando una pipeta.Reserve una pequeña alícuota para examinar su viabilidad. Suspenda estas células en medio mililitro de RPMI y añádales 100 nanogramos de yoduro de propidio. Para el análisis por fax, se recolecta la mayor parte de las células y se preparan para la inyección celular.La mayor parte de las células debe lavarse con PBS y centrifugarse, luego prepararse para la inyección en los ratones. A una concentración de 10 millones de células por mililitro en PBS frío, inyecte 100 microlitros de la suspensión celular por vía intraperitoneal en los ratones utilizando una aguja de calibre 25. Otros ratones deben inyectarse con PBS o con células control de TH17 y Treg co-cultivadas. Planeé infectar los ratones con C albicans entre tres y cinco días antes del día previo.Infectar los ratones con C albicans, dispersar cinco colonias de la cepa de laboratorio CAF dos guion uno en 100 microlitros de PBS estéril y añadir la suspensión a 20 mililitros de caldo estéril. Dejar crecer el medio inoculado durante la noche a 30 grados Celsius con agitación de 130 RPM. Al día siguiente, recoger 10 mililitros de la cultura en un tubo de 15 mililitros, luego centrifugar el Eloqua a 1900 G durante cinco minutos.A temperatura ambiente, el pellet contiene las esporas de blasto y el sedimento debe descartarse. Reúna todas las esporas de blasto recolectadas en 10 mililitros de PBS estéril y transfiera 20 microlitros de Eloqua a un tubo de microcentrífuga. Añada 20 microlitros de dos XPFA al Eloqua y, tras 15 a 20 minutos de fijación, cuente las esporas de blasto utilizando un hemocitómetro durante el tiempo de fijación.Lave el resto de los esporas de blasto con PBS al menos dos veces más. Almacene los pellet de esporas de blasto en una cabina AB SL a temperatura ambiente hasta que se conozca la concentración. Luego, re suspenda las esporas de blasto en PBS a temperatura ambiente a 200 millones de células por mililitro.Mantenga las células listas para infectar a los ratones. Este método ha sido revisado anteriormente, pero se volverá a tratar brevemente en esta sección. Primero, anestesie a los ratones, confirme su estado de anestesia y aplique una pomada oftálmica.La aplicación debe repetirse después de 45 minutos. A continuación, por vía subcutánea. Inyecte un mililitro de solución salina para hidratación, trabajando un ratón a la vez.Primero infecte el grupo sham y luego el grupo candida. Prepare una bola de algodón de tres milímetros de diámetro saturándola con 50 microlitros de PBS o suspensión de esporas de blasto. A continuación, acceda a la base de su lengua y coloque allí la bola de algodón.Asegúrese de que la lengua esté retraída hacia el interior y alejada de los dientes para evitar laceraciones. Luego, transfiera el ratón a su jaula de recuperación individual sobre una almohadilla térmica. No se debe usar aserrín de maíz en la jaula, ya que la almohadilla térmica no transferirá suficiente calor; coloque una lámpara de calor a cuatro pies por encima de la posición de las jaulas de recuperación.La bola de algodón debe permanecer en su lugar durante 90 minutos. Cada ratón debe tener su propio temporizador regresivo de 90 minutos. Durante este tiempo, cada ratón debe girarse de lado a lado cada 15 minutos para prevenir la congestión pulmonar.Por lo tanto, el paso más crítico de todo el procedimiento consiste en asegurarse de que la bola de algodón permanezca en su lugar durante todo el tiempo de inoculación. Si un ratón comienza a recuperarse de la anestesia prematuramente, vuelva a anestesiarlo utilizando únicamente ketamina. Después de 90 minutos, retire la bola y observe la recuperación del animal.Una vez recuperado, administre un mililitro adicional de solución salina en dos ubicaciones de la espalda para una hidratación adicional. Después del procedimiento, hasta cinco ratones inoculados simuladamente pueden compartir una jaula utilizando linfocitos T ingenuos derivados de ratones muslo 1.1 o CD 45.1. Se siguió el procedimiento descrito y los linfocitos T inyectados se rastrearon mediante sus marcadores respectivos.Los linfocitos T reguladores transferidos conjuntamente se derivaron de ratones CD45.2 y también se rastrearon únicamente mediante ese marcador. Los ratones infectados con Candida mostraron reclutamiento y expansión de las células TH17 inyectadas. Tras la infección, se rastreó la pérdida de peso.Los ratones inyectados únicamente con células TH17 perdieron peso progresivamente y algunos tuvieron que ser sacrificados, mientras que la pérdida de peso en los otros grupos finalmente se detuvo. Los ratones que fueron inyectados con la co-cultura de Treg mostraron muchas menos células productoras de TNF alfa cuatro días después de la infección.La presencia prolongada de células productoras de TNF alfa muestra que los ratones inyectados solo con TH17 presentaron infecciones e inflamación sin resolver. Las lenguas de los ratones inyectados con treg también mostraron infiltrados inflamatorios mucho menos numerosos y menor crecimiento fúngico. En el mismo punto de tiempo, la presencia prolongada de infiltrados inflamatorios indica que los ratones inyectados solo con TH17 tenían infecciones e inflamación sin resolver. Una vez dominada, esta técnica de infección puede realizarse en tres horas para cuatro ratones, más 15 minutos adicionales por cada ratón a infectar.

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La infección de la articulación periprotésica (PJI) causada por patógenos peligrosos es común en la ortopedia clínica. Los modelos animales existentes no pueden simular con precisión la situación real de la PJI. Aquí, establecimos un modelo de ratón PJI asociado a la biopelícula de Candida albicans para investigar y desarrollar nuevas terapias para la PJI.

Un modelo de infección por Candida albicans en una articulación periprotésica en ratones

Establecemos un modelo murino de infección relacionada con el catéter (IRC) asociada a C. albicans, en el que se forma una biopelícula en el catéter, y la interacción entre C. albicans y el huésped se correlaciona bien con el IRC clínico. Este modelo ayuda a cribar terapias para el IRC asociado a la biopelícula de C. albicans , sentando las bases para la transformación clínica.

Un modelo de infección por Candida albicans relacionada con catéteres en ratones

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Terapia fotodinámica antimicrobiana mediada por curcuminoides en un modelo murino de candidiasis oral

Este protocolo describe la diferenciación de linfocitos T CD4+ naïve en linfocitos Th17 patógenos in vitro. Específicamente, cuando se combina con un enfoque basado en citometría de flujo multiparamétrica, se puede obtener una pureza del 90% de las células Th17 patógenas a partir de células T CD4+ naïve utilizando este método de diferenciación.

Diferenciación in vitro de linfocitos T CD4+ naive en linfocitos Th17 patógenos en ratón

El presente protocolo describe la aplicación de modelos de tejidos organotípicos para investigar las interacciones huésped-patógeno in vitro. En concreto, el sistema modelo descrito utiliza un epitelio oral de múltiples capas expuesto a microorganismos asociados a biopelículas (placa dental) en el contexto de la salud bucal frente a la enfermedad.

Sistemas de modelos de tejidos organotípicos para investigar las interacciones huésped-patógeno in vitro

Aprende a desarrollar un modelo de inflamación oral mediada por células Th17 en ratones inmunodeficientes infectados con Candida albicans. Este método permite estudiar la inmunopatología mediada por células T y explorar aplicaciones en inmunoterapia oral.

Th17 Inflamación Modelo de candidiasis orofaríngea en ratones inmunodeficientes

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