Name: Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un In Vitro Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende a establecer un modelo de co-cultivo in vitro con neuronas de ganglio de raíz dorsal y células madre adiposas diferenciadas para estudiar la regeneración de nervios periféricos. Este método permite analizar interacciones celulares y crecimiento neuronal.

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Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Investigación en Salud, la Academia de Ciencias Médicas y la Sociedad Británica de Cirugía de la Mano. También reconocemos con gratitud el suministro continuo de GGF-2 de Acorda Therapeutics, EE. UU. Por último, los autores desean agradecer al Prof. Giorgio Terenghi por su valioso apoyo y orientación en nuestro grupo durante los últimos años que condujo al desarrollo y optimización de este protocolo.

NOTA: Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los Animales del Reino Unido (Procedimientos Científicos), de 1986. 1. experimental <ol><li> Antes de comenzar los tejidos y células de la cosecha, comprobar que todas las herramientas son estériles. Si es necesario, el autoclave un par de tijeras quirúrgicas agudas, una muy finas pinzas y unas pinzas finas estándar. También esterilizar cada sustrato antes de la siembra de células usando la esterilización UV, la exposición etanol o la esterilización por vapor según sea apropiado. </li><li> Preparación de los medios de comunicación para la cosecha de células madre y la diferenciación <ol><li> Preparar el medio de crecimiento de células madre, que contiene medio esencial mínimo (α-MEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 200 mM L-glutamina, y 1% de penicilina-estreptomicina (PS). </li><li> Preparar una solución madre 10 mM de forskolina disolviendo 10 mg de forskolina en 2.436 ml de sulfóxido de dimetilo estéril. Usar a una concentración final de 14 mM. &lt;/ Li&gt; <li> Preparar una solución madre de 35 mg / ml de ácido retinoico mediante la disolución de 50 mg en 1,43 ml de sulfóxido de dimetilo estéril. Utilice a una concentración final de 350 ng / ml. </li><li> Preparar el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) existencias (100 mg / ml) disolviendo 10 g de polvo liofilizado en 100 l de agua estéril destilada. Utilice a una concentración final de 5 ng / ml. </li><li> Preparar el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) existencias (100 mg / ml) disolviendo 50 g de polvo liofilizado en 500 l de agua estéril destilada. Utilice a una concentración final de 10 ng / ml. </li><li> Preparar el medio de diferenciación de células madre, que contiene medio de crecimiento de células madre suplementado con 14 mM de forskolina, 126 ng / factor de crecimiento glial-2 (GGF-2), 5 ng / ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas ml (PDGF), y 10 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). </li></ol></li><li> Preparación de medios de comunicación y soluciones de reserva para la cosecha de la neurona y disociación <ol><li> Preparar Bottenstein y de Sato (BS) medio de 28 años, mediante la adición de 1% PS y 1% de suplemento N2 a medio F12 de Ham. Calcular el volumen final necesario como 500 l por pocillo (si se utiliza una placa de 24 pocillos). </li><li> Preparar las poblaciones de colagenasa IV en medio F12 de Ham a la concentración de 1,25% p / v. Filtro-esterilizar la solución y se almacena a -20 ° C hasta 200 alícuotas mL. </li><li> Preparar las existencias de tripsina pancreática bovina en medio F12 de Ham en la concentración de 2,5% p / v, filtro de esterilizar y almacenar a -20 ° C hasta 200 ml de alícuotas. </li><li> Preparar el factor de crecimiento nervioso (NGF) solución madre a la concentración de 5 mg / ml en un filtro esterilizado 1 mg / solución de albúmina de suero bovino libre de ácido graso ml (BSA) en medio F12 y almacenar a -20 C como 200 l alícuotas. No filtrado del NGF después de la reconstitución. </li></ol></li><li> En caso de modificación de la superficie no se ha realizado, cubreobjetos capa / placas con poli-D-lisina (0,1 mg / ml durante 15 min a RT) Y / o laminina (2-10 g / cm 2 durante 2 horas a 37 ° C) para soportar la unión de la neurona y el crecimiento de neuritas, según proceda. </li><li> Siempre caliente los medios de comunicación en un baño de agua a 37 ° C antes de usar. </li></ol> 2. derivadas de tejido adiposo de células madre (ASC) Cosecha y diferenciación en un fenotipo SC <ol><li> Cosecha de ASC de la grasa visceral y inguinal de ratas macho adultas Sprague-Dawley <ol><li> Antes de comenzar, prepare un tubo con 10-15 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) suplementado con 1% v / v de la solución de PS y almacenar en hielo hasta la cosecha de grasa. </li><li> Terminar la rata por dislocación cervical y decapitación. Afeitarse la rata y hacer una incisión a través de la piel abdominal, exponiendo los órganos internos y evitar el sangrado. Retire la grasa visceral que encierra el estómago y los intestinos (por lo general se caracteriza por una consistencia de color amarillo graso) y la grasa inguinal rodea los testículos de un adulto de sexo masculino Sprague-Dawley. º Transferenciae grasa en el tubo que contiene HBSS en hielo. </li><li> En una cabina de seguridad biológica (clase II) picar finamente la grasa usando un par de tijeras y una cuchilla de afeitar estéril hasta obtener la consistencia fina que se alcanza y la transfiere en un tubo que contiene 15 ml de 0,2% p / v solución de colagenasa tipo I recién preparada y esterilizada por filtración en el día. </li><li> Transferir el tubo en un baño de agua a 37 ° C y dejar el tejido graso de digerir en presencia de la enzima durante 30 min-1 h bajo agitación continua. Monitorear la digestión de cerca y detenga antes de que el tejido está completamente disociado, esto mejorará la viabilidad celular y rendimiento celular. Filtro Theun-disociado del tejido a través de un filtro de células de 100 micras. NOTA: La buena digestión tejido dará lugar a la consistencia homogénea de la grasa, visible a simple vista cuando agitando suavemente el tubo, adquiriendo un aspecto amarillento. </li><li> Neutralizar la enzima mediante la adición de 15 ml de medio de crecimiento de células madre que contienen suero fetal bovino a 37 ° C y centrifugar elsolución a 160 g durante 10 min con el fin de recoger la fracción vascular del estroma, incluyendo las células madre, en la parte inferior del tubo. </li><li> En esta etapa, el sedimento puede ser resuspendido en 1 ml de células rojas de la sangre tampón de lisis para eliminar la contaminación de células sanguíneas. Después de la resuspensión y pipeteo durante 1 min, añadir 10 ml de medio de crecimiento de células madre fresca y centrifugar a 160 g durante 10 min. </li><li> Aspirar cuidadosamente el sobrenadante del tubo, teniendo cuidado de la pella celular depositada en la parte inferior. Resuspender las células en 10 ml de medio de crecimiento de células madre, transferirlos en un 75 cm 2 frascos y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. Mantener las células a niveles sub-confluentes hasta el paso 1-2, el cambio de medio cada 3 días. </li></ol></li><li> La diferenciación ASC a un fenotipo SC <ol><li> En el paso 1-2, retire el medio de cultivo de células madre del matraz de 75 cm2 y reemplazarlo con 10 ml de medio fresco que contiene 1 mM β-mercaptoetanol recién preparojo y esterilizada por filtración en el día. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas. En esta etapa, es importante que las células se sembraron a baja densidad (30%) antes de iniciar la diferenciación. </li><li> Lavar las células cuidadosamente con HBSS, aspirado y reemplazarlo con 10 ml de medio que contenía 350 ng de ácido retinoico / ml. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 72 horas. Trate de minimizar la exposición del medio celular a la luz. </li><li> Después de 3 días, se lavan las células con cuidado con HBSS, aspirado y reemplazarlo con 10 ml de medio de diferenciación de células madre (véase el paso 1.2.6). Mantener las células a nivel sub-confluentes, cambiando el medio cada 3 días. NOTA: Después de 2 semanas de incubación, ASC se diferencian en-SC como ASC, expresando su fenotipo característico (como lo demuestra Kingham et al 5.). Ellos pueden ser utilizados hasta el décimo paso sin cambios notables en el comportamiento 29. </li></ol></li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Cosecha y disociación de ganglios de la raíz dorsal (GRD) neuronas <ol><li> Terminar la rata por dislocación cervical y decapitación. Afeitarse la rata y levantar la piel para exponer la columna vertebral. Con unas tijeras afiladas, excide la columna vertebral teniendo especial cuidado de los órganos confinados y los vasos sanguíneos. Transferir la columna vertebral en una cabina de seguridad biológica (clase II), utilizando una placa de Petri y eliminar cualquier parte dorsal. </li><li> Divida la columna vertebral en medio a lo largo del eje longitudinal con unas tijeras quirúrgicas estériles y afilados para exponer el tejido del cordón. En este punto, es útil para cortar la columna vertebral en dos segmentos más pequeños por debajo del nivel de la caja torácica, para que sea más fácil de manejar durante la cosecha de la neurona DRG. Con unas pinzas finas, retire con cuidado todo el tejido de la médula, prestando atención a no tirar y eliminar las raíces DRG. De esta manera el DRG y las raíces serán expuestos dentro de los canales vertebrales, todavía encerrado en la columna. Observe DRG como filamentos blancos coming directamente de los canales. </li><li> Saque toda la raíz DRG (no sólo la DRG) de los canales vertebrales utilizando pinzas muy finas, de profundizar en los canales vertebrales y teniendo cuidado de no dañar las raíces de los ganglios. Transferir el DRG en una pequeña placa de Petri (60 mm 2) que contiene 3-4 ml de medio F12 de Ham suplementado con 1% de PS. Si el uso de diferentes animales, utilizar platos separados. </li><li> Bajo un microscopio de disección, limpie el GRD de cualquier exceso de las raíces nerviosas que rodean los ganglios usando pinzas estériles y un bisturí para reducir la contaminación de las células gliales. Transferir el DRG en una pequeña placa de Petri (35 mm 2) con 1,8 ml de medio F12 fresco. </li><li> Añadir 200 l de solución de p / v colagenasa tipo IV de stock 1,25% (concentración final de 0,125%) y se incuba la DRG a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 1 hr. Aspirar con cuidado el medio con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no aspirar ni dañe la DRG. Añadir medio F12 fresco flexiblementado con 0,125% p / v colagenasa tipo IV de la enzima y se incuba durante 1 hora como se describe anteriormente. </li><li> Aspirar el medio y lavar suavemente el DRG con medio F12. Añadir a continuación 1,8 ml de medio F12 y 200 l de tripsina (concentración final de 0,25% p / v) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min. </li><li> Retire la tripsina y añadir 1 ml de medio F12 suplementado con 500 l de FBS para detener la reacción enzimática. Aspirar el medio y lavar suavemente el DRG con medio F12 de tres veces para eliminar las trazas de suero. </li><li> Añadir 2 ml de medio F12 fresco y transferir cuidadosamente la DRG con el medio en un tubo de 15 ml usando una pipeta de vidrio. Disociar suavemente las neuronas DRG pipeteando arriba y abajo (cerca de 8-10 veces) con la pipeta de vidrio (puntas de plástico se pueden utilizar como alternativa). </li><li> Dejar que el precipitado se asiente en la parte inferior del tubo y recoger el medio en un tubo nuevo. Añadir 2 ml de medio F12 fresco al tubo que contiene el sedimento y repetir el mdisociación echanical con la pipeta de vidrio. Repita este paso hasta que la suspensión se convierte homogéneos (3-4 veces) y recoger todo el DRG disociado en el nuevo tubo. Este método reduce la presión derivada de la disociación mecánica y mejora la viabilidad de las neuronas. </li><li> Se filtra la suspensión homogeneizada resultante en un nuevo tubo de 15 ml usando un colador micras celular 100 para eliminar las neuronas disociadas-un y otros desechos. En esta etapa, puede ser conveniente filtrar primero la suspensión de células en un tubo de 50 ml y luego transferir la solución en el tubo más pequeño usando una pipeta de vidrio. Centrifugar la suspensión a 110 g durante 5 min. </li><li> Preparar una albúmina de suero bovino al 15% (BSA) mediante la adición de 500 l de una solución de BSA al 30% a 500 l de medio F12. Poco a poco la pipeta la solución por la pared de un tubo de 15 ml para crear un rastro proteína gradual. En esta etapa, es útil para mantener el tubo en un ángulo de 45 ° y lentamente liberar el BSA usando los números deel tubo Falcon como referencia para la &quot;pista&quot; de formación. </li><li> Aspirar el sobrenadante de la etapa 3.10 dejando 500 l en la parte inferior del tubo y resuspender el sedimento celular en el mismo medio. Lentamente pipetear la suspensión por el sendero de proteínas previamente preparada en el paso 3.11 (usar los números en el tubo como referencia) y se centrifuga a 500 g durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de medio de BS modificado (o un medio mixto para la ASC / DRG co-cultivo-SC similares, tal como se describe a continuación en el paso 4.5. NOTA: El volumen de volver a suspender las neuronas DRG se puede hacer hasta el volumen real requerido, dependiendo de la concentración celular final deseada y el número de muestras a ser sembradas. Un animal proporcionará suficientes células para un experimento de 24 pocillos de placas. </li><li> Incubar las muestras sembradas a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 horas para permitir la unión celular y, finalmente, se añade medio fresco suplementado con BS 50 ng / ml de FA de crecimiento nerviosoctor (NGF). </li></ol> 4. Dirigir Co-cultura de-SC como ASC y DRG neuronas <ol><li> Mantener ASC-SC como en la cultura a nivel sub-confluente como se describe en el paso 2.2.3. Veinticuatro horas antes de la cosecha DRG, aspirar el medio de diferenciación de células madre y lavar las células con HBSS. Aspirar y se incuba en 3 ml de tripsina a 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 min. </li><li> Revisar bajo un microscopio de luz que todas las células se han desprendido del matraz. Golpear suavemente el frasco para ayudar a la separación. Añadir 7 ml de medio para detener la reacción tripsina, recoger la suspensión de células en un tubo de 15 ml y centrifugar a 110 g durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 5 ml de medio de diferenciación de células madre. Contar las células usando un hemocitómetro y se diluye la suspensión celular de acuerdo con la concentración final requerida. Idealmente, la siembra de 20.000 SC como ASC / cm 2 garantizaría una capa confluente de células. </li><li> Sembrar el SC-comoASC sobre el sustrato y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas para permitir la unión celular. </li><li> Después de 24 horas de incubación, aspirar el medio y agregue las neuronas DRG en la parte superior de las células como se describe en el paso 3.14 y 3.15. Cambiar el medio a un medio mixto que contiene 50% de medio de diferenciación de células madre y 50% de medio de BS. Además, la reducción de la concentración de FBS al 1-2,5% en el medio mezclada final ayuda a evitar la proliferación de contaminación de las células satélite derivados de la disociación DRG. </li><li> Incubar las muestras co-cultivadas a 37 ° C, 5% de CO2 y mantener en cultivo durante el tiempo requerido para las pruebas futuras. </li></ol>

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Los autores confirman que no hay conflictos de intereses asociados con esta publicación.

DRG neuronas se utilizan con frecuencia entre las células neuronales para el cultivo primario para el estudio de la regeneración de las neuronas después de axotomía en vivo. Aquí se presenta un protocolo precisa para la cosecha DRG de ratas adultas, destinado a reducir la población de células satélite en el ambiente circundante sin comprometer la supervivencia neuronal. Como ASC diferenciado en un fenotipo de SC como son una alternativa válida a SC para las terapias celulares, un ASC / DRG sistema de co-cultivo-SC como también se describe en detalle. Es ampliamente conocido que la laminina (o laminina derivados de secuencias de péptidos) tienen un efecto beneficioso sobre la supervivencia de neuronas y la formación de neuritas 31-33. Al realizar cultivos de neuronas DRG se recomienda por lo tanto a la capa previamente cada sustrato con laminina con el fin de evitar cualquier pérdida de funcionalidad de las células neuronales. El concepto de recubrimientos de laminina también se aplica a sustratos de biomateriales para el diseño deconstrucciones de ingeniería de tejidos, tales como poli - caprolactona (PCL) utilizan con frecuencia para la fabricación de conductos de los nervios 30. Además, el trabajo previo demostró que las matrices de fibrina son materiales adecuados para cultivos neuronales en tres dimensiones 11. Además de capa de proteína, los modelos de co-cultivo proporcionan condiciones valiosos para la supervivencia de neuronas DRG y un ambiente adecuado para estudiar las interacciones que se producen entre las neuronas y SC en el sistema nervioso periférico después de la lesión. Las células también se pueden trasplantar in vivo mediante el uso de dispositivos neurales con el fin de acortar el tiempo de reclutamiento de células autólogas en el sitio de la lesión. Esto es particularmente importante en lesiones graves, que pueden conducir a la senescencia celular / muerte y la atrofia muscular. Aunque SC son las células gliales más importantes que intervienen en el proceso de regeneración del nervio periférico y la mielinización, su limitada disponibilidad y su tasa de proliferación lenta que los hace inadecuadospara aplicaciones de ingeniería de tejidos 34. ASC son una alternativa válida debido a su abundancia y capacidad de diferenciarse en el fenotipo SC, expresan marcadores gliales específicos y mostrando similitudes funcionales a SC nativa 19. ASC también son capaces de producir proteínas y factores de crecimiento 5 que puede ser beneficioso para la formación y la extensión de neuritas por las neuronas DRG en un sistema de co-cultivo. Sin embargo, dos sistemas diferentes de co-cultivo se puede configurar en función de las necesidades experimentales. El método propuesto en este documento es una versión revisada de un protocolo bien establecido en nuestro laboratorio 11 e implica un contacto directo entre los dos tipos de células (co-cultivo directo), en el que el segundo tipo de células (neuronas DRG) se siembran en la parte superior de los otros (SC-como ASC). Este enfoque se basa en los hallazgos previos que demostraron la importancia de la presencia de una capa de células gliales en el sustrato cuando la siembra de cultivos neuronales 35 <sup&gt; - 37. Este efecto es probablemente debido a las interacciones célula-célula a través de integrinas DRG y moléculas ECM depositados de ASC y otras señales en la superficie de células madre. También se observó que una reducción de suero de proteína en el medio reduce la proliferación de contaminación de las células satélite que puedan derivarse de la disociación de las neuronas DRG, sin afectar a funciones ASC. Sin embargo, las células satélite, incluyendo una pequeña población de SC, son difíciles de eliminar por completo a partir de cultivos de neuronas DRG y pocas células restantes también estará presente en el sistema de co-cultivo. Por tanto, es importante tener en cuenta que estas pequeñas sub-poblaciones también pueden participar en los procesos de mielinización durante los estudios in vitro, recordando las células autólogas que están presentes in vivo después de la lesión. El segundo enfoque (no presentado aquí) implica el uso de insertos de cultivo celular, evitando un contacto directo entre los dos tipos de células diferentes (co-cultivo indirecto). Sin embarer, no es representativo de las condiciones in vivo durante la regeneración del nervio (disminución de la capacidad de las células neuronales para desarrollar neuritas largas), pero se utiliza para investigar el efecto de los factores difusibles liberados en el medio por una población celular determinada en el otro 38 .

Lesiones de los nervios periféricos son comunes con aproximadamente 9.000 casos en el Reino Unido se producen cada año en una población predominantemente joven y 1 de trabajo. A pesar de las técnicas de reparación del nervio de microcirugía, la restauración normal de la función es inalcanzable con la consiguiente sensación de alteración de la mano, la función motora reducida y dolor frecuente e intolerancia al frío 2. Estas lesiones tienen un impacto profundo y permanente en el paciente y su capacidad para realizar actividades de la vida diaria, con menos del 60% de regresar al trabajo 3. Después de una lesión, el fenotipo y la morfología de las neuronas y las células de Schwann (SC) el cambio con el fin de crear un entorno adecuado para permitir el surgimiento axón. En caso de transección, el nervio se divide en muñones proximal y distal; el muñón proximal ser el punto desde el que el proceso de regeneración se lleva a cabo, mientras que el muñón distal sufre degeneración walleriana con lo cual el detach SCde los axones lesionados, de-diferenciarse y proliferar. Esto es fundamental para la eliminación de restos de mielina y la preparación del muñón distal de 4,5 nervio re-generación. Axon brotación con el apoyo de la producción de factores neurotróficos y quimiocinas liberadas por SC en el muñón distal, y guiado por la lámina basal dejado atrás tras la degeneración walleriana 6,7. SC alinear junto al axón regenerar la formación de las bandas de Bungner, que ayudan al crecimiento de los axones hacia el órgano diana, reduciendo ramificación fuera del tubo endoneurial. Después de reinervación, SC formar el nuevo vaina de mielina envuelve los axones regenerados, pero la función sensorial y motor sólo se restaura parcialmente 8. Ganglios de la raíz dorsal (DRG) son estructuras situadas en los agujeros intervertebrales de la columna vertebral, que contienen las células neuronales sensoriales que inervan los órganos periféricos. Cuando disociado, que pueden ser utilizados como un adecuado in vitro modEL para el estudio de la regeneración del nervio 9 a 11, incluidas las investigaciones de la formación de mielina. En particular, las neuronas DRG adultos imitan las características in vivo de estas células y proporcionan una herramienta formidable para estudiar nuevas estrategias para la reparación de nervios periféricos en la ingeniería de tejidos. Co-cultivos representan un sistema dinámico que simula in vitro la interacción de dos (o más) tipos de células en un medio ambiente en particular in vivo. Una de las ventajas de estos modelos de células de co-cultivo es la flexibilidad y alto control que se puede ejercer sobre el medio ambiente extracelular. Las neuronas DRG se han utilizado con frecuencia en los sistemas de co-cultivo con SC para imitar las interacciones reales que se producen entre los dos tipos de células en el sistema nervioso periférico 10,12 - 14. Se demostró que SC secretan la matriz extracelular (ECM) proteínas y factores de crecimiento que pueden mejorar notablemente lacapacidad de las neuronas DRG para sobrevivir y brotar neuritas 15,16. Sin embargo, SC requieren largos períodos de tiempo a proliferar y, a pesar de los avances de la técnica de cultivo celular, es todavía difícil de generar un número adecuado de células para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Además, el sacrificio de un nervio sano se requería para cosechar autólogo SC. Por lo tanto, la diferencia en la obtención SC es importante tanto para la ingeniería de tejidos y en las pruebas in vitro de la regeneración del nervio. En esta vista, ASC se puede considerar una alternativa valiosa para el desarrollo de una construcción de ingeniería de tejidos para ser utilizado para la reparación del nervio periférico 17,18. El trabajo previo demostró la capacidad de estas células para diferenciarse en-SC como ASC, expresando gliales-marcadores característicos, tales como S-100, p75 y la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) 19, así como la proteína de la mielina cero (P0) 20 . La secreción de factores de crecimiento gliales, tales como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento nervioso (NGF) y glial factor neurotrófico derivado de células (GDNF) también se observó 21,22. Por lo tanto, SC-como ASC puede ser utilizado como promotor de la regeneración de nervios periféricos, como se demuestra por tanto in vitro como en estudios in vivo 23-26. Además, ASC puede ser cosechado a través de procedimientos mínimamente invasivos en mayor número en comparación con otros tipos de células madre; la frecuencia de las células madre en el tejido adiposo es de 100 a 1.000 veces mayor que en la médula ósea 27, y tienen una tasa de proliferación mayor en comparación con las células madre mesenquimales SC y de médula ósea. Este trabajo tiene como objetivo proporcionar un protocolo detallado para realizar cosechas de alta eficiencia de DRG neuronas disociadas y ASC, respectivamente, siendo este último diferenciarse en células-SC similares. El co-cultivo de estos dos tipos de células será por lo tanto, proporcionar un sistema muy práctica que se puede utilizar para futuros estudios sobre la capacidad de ne DRGurons broten las neuritas y los mecanismos de formación de la mielina en diferente andamio para la ingeniería de tejido nervioso.

<table><tbody><tr><td>100 y micro; m filtro</td><td>de células BD Biosciences</td><td>352360</td><td>70 &mu; Los coladores M (ref. 352350) se pueden utilizar como alternativa</td></tr><tr><td>Tubos de plástico de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de plástico de 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de 75 cm2</td><td>Corning</td><td>BC301</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico >98% HPLC</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento ARA-C</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>FGF humano recombinante básico (154 aa)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9205</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo I</td><td>Gibco</td><td>17100-017</td><td>Nota: esta colagenasa solo se utiliza para la digestión de los tejidos grasos</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IV</td><td>Worthington Biochemical</td><td></td><td>LS004188 Nota: esta colagenasa solo se utiliza para disociar explantes de DRG</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Biosera</td><td>FB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50253</td><td>Material afilado que se eliminará en consecuencia</td></tr><tr><td>Glial Growth Factor-2 (GGF-2)</td><td>Acorda Therapeutics</td><td></td><td>GGF-2 fue amablemente donado por Acorda Therapeutics. Para una alternativa disponible comercialmente, recomendamos NRG1-&beta; 1 (R & D Systems, Abingdon) para la diferenciación de células madre que se utilizará en la concentración final de 200 ng/ml</td></tr><tr><td>Nutrient Mix F12 HAM</td><td>Sigma</td><td>N6658</td><td>Warm at 37 &deg; C en un baño de agua a menos que se especifique</td></tr><tr><td>Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>Caliente a 37 &deg; C en un baño de agua a menos que se especifique</td></tr><tr><td>suplemento de N-2 (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>17502</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento nervioso 2.5s Proteína, glándulas submaxilares de ratón&nbsp; (NGF)</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (PS)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Placas</td><td>de Petri Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Humano PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>Cálido a 37 &° C en un baño de agua. Se utiliza para el desprendimiento de células de matraces de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Tripsina (2x páncreas bovino)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003703</td><td>Se utiliza para la disociación de DRG</td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo Eagle (MEM)</td><td>Sigma</td><td>M8042</td><td>Warm at 37 &deg; C en un baño de agua a menos que se especifique</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Prepare la solución en el gabinete biológico</td></tr></tbody></table>

ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: un<em&gt; in vitro</em&gt; co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), ubicadas en los agujeros intervertebrales de la columna vertebral, se pueden utilizar para crear un sistema in vitro que facilita el estudio de la regeneración nerviosa y la mielinización. Las células gliales del sistema nervioso periférico, las células de Schwann (SC), son facilitadores clave de estos procesos; Por lo tanto, es crucial que las interacciones de estos componentes celulares se estudien conjuntamente. El contacto directo entre las neuronas DRG y las células gliales proporciona estímulos adicionales detectados por receptores de membrana específicos, mejorando aún más la respuesta neuronal. Las SC liberan factores de crecimiento y proteínas en el medio de cultivo, que mejoran la supervivencia de las neuronas y estimulan la germinación y extensión de las neuritas. Sin embargo, las SC requieren un largo tiempo de proliferación para ser utilizadas en aplicaciones de ingeniería de tejidos y el sacrificio de un nervio sano para su abastecimiento. Las células madre derivadas del tejido adiposo (ASC) diferenciadas en fenotipo SC son una alternativa válida a la SC para la creación de un modelo de cocultivo con neuronas DRG para estudiar la regeneración nerviosa. El presente trabajo presenta un protocolo detallado y reproducible paso a paso para recolectar neuronas DRG y ASC de ratas adultas; diferenciar el ASC hacia un fenotipo SC; y combina los dos tipos de células en un sistema de cocultivo directo para investigar la interacción entre las neuronas y las SC en el sistema nervioso periférico. Esta herramienta tiene un gran potencial en la optimización de construcciones de ingeniería tisular para la reparación de nervios periféricos.

Los cultivos de neuronas DRG disociadas representan un adecuado modelo in vitro para el estudio de la regeneración del nervio. Sin embargo, los sustratos no tratados no proporcionan un entorno adecuado para la fijación DRG y extensión de neuritas. -SC como ASC son capaces de producir factores de crecimiento y quimiocinas 19 que pueden mejorar la capacidad de las neuronas DRG a brotar neuritas cuando se liberan en el medio de cultivo. La presencia de SC-ASC como en el sistema de cultivo por lo tanto, puede desempeñar un papel importante en la regulación de las funciones de DRG. Este protocolo (Figura 1) ilustra el procedimiento para realizar una co-cultivo directo de la ASC y DRG neuronas-SC similares, durante el cual las células neuronales se interponen en contacto directo con anterioridad sembrado ASC-SC similares. La principal dificultad asociada a este procedimiento es la alta variabilidad del número de neuronas DRG cosechadas a partir de diferentes animales. Por esta razón, los resultados pueden ser a veces difícil de COMPARcorreo y una atención especial debe ser pagado durante el procedimiento de siembra con el fin de obtener siempre una densidad celular comparable en cada experimento. El protocolo se ha optimizado para reducir al menos el número de las células satélite restantes de la disociación de las neuronas DRG usando el gradiente de BSA (paso 3,11). Además, citosina-arabinosa (Ara-C) suplemento se puede añadir al medio de BS con el fin de minimizar aún más la población de células satélite, como se describe por Kingham et al. 11. Sin embargo, la elección del tiempo de tratamiento debe ser cuidadosamente equilibrada con el DRG y SC como ASC vitalidad, también afectada por la presencia de suplemento de ARA-C en el medio de cultivo. Por lo tanto, es muy difícil de lograr un sistema libre de células satélite. La Figura 2 muestra la importancia de ASC-SC como para las neuritas DRG brotación en un modelo de co-cultivo utilizando poli sin tratar y modificada químicamente - caprolactona (PCL) películas como sustratos. DRG neuronas eran maintained en cultivo durante 3 días en presencia o ausencia de-SC como ASC, utilizando una solución mixta que contiene 50% de medio de BS y 50% de medio de diferenciación de células madre, como se describe en el paso 4.5. Después de este período, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con β-tubulina III (neuronas DRG) y S100 (SC-como ASC) para investigar la morfología celular y para estudiar la capacidad de las neuronas DRG para sobresalir neuritas. No hay neuritas se observaron en las superficies no tratadas en ausencia de-SC como ASC (Figura 2A), mientras que la formación de neuritas fue claramente mejorada en el sistema de co-cultivo (Figura 2C). En promedio, el número de neuritas por cuerpo celular aumentó significativamente de 0 a 3 en presencia de células madre. La confirmación de estos resultados también fue dada por microscopía electrónica de barrido (SEM) de análisis, que se muestra en la Figura 3. En particular, las imágenes de SEM muestran que la capacidad de las neuronas DRG a brotar neuritas se produce preferentemente en conjuncióncon-SC como ASC, como se indica por las flechas amarillas en la Figura 3C. Cabe señalar que el uso de sustratos modificado laminina (incluyendo péptidos de laminina derivados) en sistemas de cultivo que contienen las neuronas DRG se ha definido con frecuencia como una condición adecuada para el cultivo celular neuronal, que tiene efectos notables sobre la formación de neuritas y la extensión de 30 a 32 . Sin embargo, los resultados mostrados en la Figura 2D y 3D Figura demuestra que la combinación de señales químicas y biológicas puede mejorar aún más la respuesta de las neuronas DRG. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig1highres.jpg" /> Figura 1. Preparación del sistema de ASC de co-cultivo DRG-SC-como directa. Neuronas DRG y ASC se derivan respectivamente de la columna vertebral y la grasa visceral y inguinal de mal adultose ratas Sprague-Dawley. Después de la digestión del tejido adiposo a través de una cascada de reacciones enzimáticas, ASC se diferencian en células-SC como y mantenerse en condiciones sub-confluentes hasta que se necesite. -SC como ASC son pre-sembrado en cada sustrato 24 horas antes de la cosecha DRG. En el día, las neuronas DRG se extraen y se disocian a través de una serie de acciones enzimáticas y mecánicas. Las neuronas están sembradas en la parte superior de la ASC-SC como previamente sembradas y mantienen en cultivo hasta el ensayo (técnica mixta: contiene un 50% de medio de diferenciación de células madre y el 50% de medio BS modificado). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig2highres.jpg" /> Figura 2. Las imágenes de fluorescencia de las neuronas DRG en diversas condiciones de cultivo.(A) las películas de PCL no tratadas; (B) películas PCL modificados RGD; (C) co-cultivadas con-SC como ASC en películas PCL no tratadas; (D) co-cultivadas con-SC como ASC en películas PCL modificados RGD. Las células se mantuvieron en cultivo durante 3 días utilizando una solución mixta que contiene 50% de medio de BS modificado y 50% de medio de diferenciación de células madre. Después de este tiempo, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron en una solución de Triton-X, y sitios de unión no específicos se bloquearon con 1% de BSA. Las células neuronales fueron teñidas contra β-tubulina III (FITC; verde) y ASC-SC como contra S-100 (AlexaFluor568; rojo) anticuerpos. Finalmente núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las imágenes fueron adquiridas utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus BX60, Japón). (Re-imprimir con permiso de De Luca et al. 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para conocer el vers más grandes</a>ion de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig3highres.jpg" /> Figura 3. imágenes de SEM de las neuronas DRG en diversas condiciones de cultivo (A) películas PCL no tratados (B) películas PCL modificados RGD;. (C) co-cultivadas con ASC SC-como en las películas de PCL no tratadas; (D) co-cultivadas con-SC como ASC en películas PCL modificado RGD. Las flechas amarillas indican los puntos de contacto entre-SC como ASC y DRG, confirmando su interacción directa en el sistema de co-cultivo. Las células se mantuvieron en cultivo durante 3 días y se fijaron en glutaraldehído al 2,5%. Después de la deshidratación en series de etanol graduado (50%, 70%, 90%, 100%), las células fueron finalmente enjuagaron en hexametildisilazano y se secaron antes de su montaje en trozos y el oro de pulverización catódica para el análisis SEM. Las imágenes fueron adquiridas mediante un SEM (Zeiss EVO60, Reino Unido) con un volumen de aceleracióntaje de 10kV. (Re-imprimir con permiso de De Luca et al. 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Ganglios de la raíz dorsal (DRG) son estructuras que contienen las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. Cuando disociado, pueden ser co-cultivadas con células madre-SC como derivadas de tejido adiposo (ASC), que proporciona un valioso modelo para estudiar la regeneración in vitro en los nervios y la mielinización, imitando el entorno en vivo en el sitio de la lesión.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer cultivos celulares combinados de células madre derivadas del tejido adiposo y neuronas del ganglio raquídeo dorsal o ganglio raquídeo dorsal (DRG) para estudiar la regeneración nerviosa in vitro. Esto se logra primero obteniendo células madre derivadas del tejido adiposo no diferenciadas a partir del tejido adiposo de rata. En el segundo paso, las células se diferencian en células similares a las de Schwann utilizando un cóctel de factores de crecimiento.A continuación, se obtienen los neuronas de los ganglios dorsales de la médula espinal de una rata y se asocian en el paso final, donde las neuronas se colocan sobre las células madre diferenciadas para generar el sistema de cultivo dual in vitro. Finalmente, las células se tiñen con marcadores neuronales y gliales para facilitar el crecimiento de neuritas, su cuantificación, y se obtienen imágenes mediante microscopía electrónica de barrido para la evaluación morfológica. Este método puede ayudar a responder diversas preguntas en el campo de la medicina regenerativa, como por ejemplo cómo interactúan las células madre derivadas del tejido adiposo con neuronas sensoriales en distintos biomateriales.La razón por la que la demostración de este método es fundamental es porque incluye pasos difíciles de aprender debido a la baja accesibilidad y al pequeño tamaño de los tejidos dentro de una cabina biológica. Comience utilizando un par de tijeras y una cuchilla estéril para cortar finamente la grasa visceral e inguinal obtenida de ratas macho adultas Sprague-Dawley hasta obtener una consistencia fina. A continuación, transfiera la suspensión resultante a un tubo que contenga 15 mililitros de una solución recién preparada de colagenasa tipo I, filtrada y esterilizada, y coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius bajo agitación continua durante 30 a 60 minutos.Supervise cuidadosamente la digestión, deteniéndola antes de que el tejido se disocie completamente para mejorar la viabilidad y el rendimiento celular. Cuando el tejido esté listo, filtre a través de un colador celular de 100 micrones. Una digestión adecuada dará como resultado una consistencia homogénea de grasa de color beige que se observa con un suave remolino.Neutralice las enzimas digestivas con 15 mililitros de medio de crecimiento para células madre a 37 grados Celsius, suplementado con suero bovino fetal. Luego, centrifugue las células para recolectar la fracción vascular estromal. Aspire el sobrenadante comenzando desde la capa superior de grasa.Resuspenda el precipitado en un mililitro de tampón ISIS de glóbulos rojos mediante pipeteo. Después de un minuto, detenga la lisis agregando 10 mililitros de medio fresco y centrifugue nuevamente las células. Ahora aspire cuidadosamente el sobrenadante S.Resuspenda las células en 10 mililitros de medio y siembre las células en matraces de 75 centímetros cuadrados a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Mantenga las células a niveles subconfluentes hasta el primer o segundo pase, momento en el cual las células estarán listas para diferenciarse en células similares a las de Schwann mediante tratamiento con etanol beta más cap y ácido retinoico, para obtener las neuronas del ganglio dorsal después de la recolección de la médula espinal.Comience por eliminar las partes dorsales y luego use tijeras quirúrgicas estériles y afiladas para dividir la columna vertebral por la mitad a lo largo del eje longitudinal, exponiendo así el tejido de la médula. Corte la columna vertebral en dos segmentos más pequeños por debajo del nivel de la caja torácica, y luego use pinzas finas para extraer suavemente todo el tejido medular. Tenga cuidado de no tirar ni remover las raíces de los ganglios de la raíz dorsal, que aparecen como filamentos blancos que salen directamente de los conductos.Una vez que se haya eliminado todo el tejido central, utilice pinzas muy finas para extraer toda la raíz del ganglio dorsal, llegando profundamente hasta los conductos vertebrales y teniendo cuidado de no dañar las raíces de los ganglios. Coloque el ganglio dorsal en una placa de Petri de 60 milímetros cuadrados que contenga entre tres y cuatro mililitros de medio Hams F12 suplementado con antibióticos. Luego, bajo un microscopio estereoscópico, utilice pinzas estériles y un escalpelo para eliminar cualquier raíz nerviosa excesiva que rodee los ganglios, con el fin de reducir la contaminación por células satélite.A continuación, transfiera el ganglio de la raíz dorsal a una placa de Petri de 35 milímetros cuadrados que contenga 1,8 mililitros de medio F12 fresco y agregue 200 microlitros de colagenasa. Solución stock tipo cuatro. Incube el ganglio de la raíz dorsal durante una hora y luego aspire cuidadosamente el medio con una pipeta de vidrio.Teniendo cuidado de no aspirar ni dañar el ganglio de la raíz dorsal. Repita el paso con colagenasa y lave el ganglio de la raíz dorsal con medio F 12. Después del segundo lavado, agregue 1,8 mililitros de medio F 12 y 200 microlitros de tripsina a las células.Retire la tripsina y agregue un mililitro de medio suplementado con 500 microlitros de suero bovino fetal (FBS) para detener la reacción enzimática. Luego aspire el medio y lave suavemente el ganglio de la raíz dorsal (DRG) con medio F-12 tres veces para eliminar todos los rastros de suero. A continuación, agregue dos mililitros de medio F-12 fresco y utilice una pipeta de vidrio para transferir cuidadosamente la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros.Pipetee hacia arriba y hacia abajo de ocho a 10 veces para disociar suavemente las neuronas y luego permita que el paladar se acumule en el fondo del tubo cuando se haya sedimentado. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y agregue dos mililitros de medio F12 fresco al paladar. Repita la disociación mecánica y la transferencia del medio hasta que la suspensión se vuelva homogénea.Luego, resuspenda la suspensión celular tres a cuatro veces y filtre la suspensión homogeneizada resultante a través de un colador celular de 100 micrones hacia un nuevo tubo de 50 mililitros. Centrifugue las células en un tubo de 15 mililitros y, mientras giran lentamente, agregue mediante pipeta suero de albúmina bovina al 15% recién preparado por la pared interna de un tubo de 15 mililitros, mantenido en un ángulo de 45 grados para crear un gradiente gradual de proteína.Utilizando los números del tubo como referencia para la pista de formación, aspire luego el snat de las células, conservando los últimos 500 microlitros para la resus, suspenda el precipitado y vierta lentamente las células a lo largo del rastro de proteína hacia el nuevo tubo. Después de centrifugar las células nuevamente, resuspenda el precipitado en un mililitro de medio BS modificado y siembre las células en un pequeño volumen de medio. En una placa de 24 pocillos, transcurridas dos horas, cuando las células se hayan adherido, agregue medio BS fresco suplementado con 15 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento nervioso tras la disociación.Las células del ganglio raíz dorsal también pueden utilizarse para cultivo conjunto con las células madre adiposas similares a células de Schwann, sembrándolas sobre las células previamente sembradas. Estas imágenes demuestran la importancia de las células madre adiposas similares a células de Schwann para la brotación de neuritas del ganglio raíz dorsal en un modelo de cultivo conjunto que utiliza películas de policaprolactona como sustratos. No se observaron neuritas sobre superficies no tratadas en ausencia de células madre adiposas similares a células de Schwann, mientras que la formación de neuritas mejoró claramente en el sistema de cultivo conjunto.En promedio, el número de neuritas por cuerpo celular aumenta significativamente en presencia de células madre. De hecho, como ilustran estas imágenes, la capacidad de las neuronas del ganglio dorsal a raíz de generar brotes neuronales ocurre preferentemente en conjunto con células madre diferenciadas, tal como indican las flechas amarillas. Así, tras ver este video, ahora debería ser capaz de obtener células madre derivadas de lib y de disociar neuronas DGen.Pero también debería poder establecer un modelo para estudiar la degeneración periférica promedio.

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Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

Este video muestra un método para desarrollar ganglios de raíz dorsal o cultivo de explantes DRG y modelos celulares disociados de DRG utilizando tejidos DRG aislados de ratón. Estos modelos ayudan a estudiar diversos mecanismos con las interacciones neuron-gliales en un entorno controlado.

Generación de explante de ganglios de raíz dorsal y cultivo celular disociado

Este video muestra un método para recolectar neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). La DRG de la columna vertebral de una rata se aísla, se trata con enzimas y luego se disocia mecánicamente para obtener una suspensión unicelular. Las neuronas se separan de las células gliales mediante centrifugación en gradiente de densidad y se cultivan en un medio de crecimiento.

Una técnica para recolectar y disociar ganglios de la raíz dorsal para cultivos neuronales

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Co-cultivo de un explante de ganglios de raíz dorsal con células de Schwann para la mielinización de neuronas

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Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

En este informe, se destacan las ventajas de las culturas organotypic y disociadas cultivos primarios de ganglios de raíz dorsal derivadas de ratón para investigar una amplia gama de mecanismos asociados a la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la respuesta a la infección viral.

Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad

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Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.

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Este protocolo proporciona una técnica para cosechar y cultivar ganglios de raíz dorsal explantados (DRG) de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC).

Cosecha, incrustación y cultivo de ganglios de la raíz dorsal en dispositivos multicompartimentales para estudiar las características neuronales periféricas

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Aprende a establecer un modelo de co-cultivo in vitro con neuronas de ganglio de raíz dorsal y células madre adiposas diferenciadas para estudiar la regeneración de nervios periféricos. Este método permite analizar interacciones celulares y crecimiento neuronal.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un In Vitro Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos (Video) | JoVE Journal

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un

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