Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un In Vitro Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

El objetivo general de este procedimiento es establecer cocultivos de células madre derivadas del tejido adiposo y ganglios de la raíz dorsal o neuronas DRG para estudiar la regeneración nerviosa in vitro. Esto se logra obteniendo primero células madre derivadas del tejido adiposo indiferenciado de tejido graso de rata. En el segundo paso, las células se diferencian en células similares a schwan utilizando un cóctel de factores de crecimiento.

A continuación, las neuronas DRG se extraen de la médula espinal de una rata y, en el paso final, las neuronas se asientan sobre las células madre diferenciadas para generar el sistema de cocultivo in vitro. En última instancia, las células se tiñen en busca de marcadores neuronales y gliales para facilitar el crecimiento de las neuritas, la cuantificación y se obtienen imágenes mediante microscopía electrónica de barrido para su evaluación morfológica. Este método puede ayudar a responder a diferentes preguntas en el campo de la medicina regenerativa, como por ejemplo, ¿cómo interactúa la célula madre adiposa correcta con las neuronas orgánicas ug en diferentes biomateriales?

La razón por la que la demostración de este método es crítica porque implica pasos que son difíciles de aprender debido a la baja accesibilidad y el pequeño tamaño de los tejidos en un gabinete biológico. Comience usando un par de tijeras y una hoja de afeitar estéril para picar finamente la grasa visceral e inguinal recolectada de ratas spro dolly macho adultas hasta obtener una consistencia fina. A continuación, transfiera la suspensión de grasa resultante a un tubo que contenga 15 mililitros de filtro recién preparado, solución de colagenasa tipo uno esterilizada y coloque un tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados bajo agitación continua durante 30 a 60 minutos.

Vigile de cerca la digestión, deteniéndose antes de que el tejido se disocie por completo para mejorar la viabilidad y el rendimiento de la célula. Cuando el tejido esté listo, fíltralo a través de un colador de células de 100 micras. Una buena digestión dará como resultado una consistencia grasa homogénea que parece beige con un suave remolino.

Neutraliza las enzimas digestivas con 15 mililitros de medio de crecimiento de células madre a 37 grados centígrados suplementado con FBS. A continuación, gire las células hacia abajo para recoger la fracción vascular estromal. Aspirar el supinato empezando por la capa superior de grasa.

Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón ISIS de glóbulos rojos con pipeteo. Después de un minuto, detenga la lisis agregando 10 mililitros de fresco, medio y centrífuga a las células nuevamente. Ahora aspire cuidadosamente el sobrenadante S.

Vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio y siembre las células en 75 centímetros cuadrados. Matraces a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Mantener las células en niveles subconfluentes hasta el primer o segundo paso, en el que las células están listas para la diferenciación en células similares a schwan mediante tratamiento con beta, más etanol y ácido retinoico para obtener las neuronas DRG después de recolectar la médula espinal.

Comience por extirpar cualquier parte dorsal y luego use tijeras quirúrgicas estériles y afiladas para dividir la columna vertebral por la mitad a lo largo del eje longitudinal, exponiendo el tejido de la médula. Corte la columna vertebral en dos segmentos más pequeños por debajo del nivel de la caja torácica y luego use pinzas finas para quitar suavemente todo el tejido del cordón. Tenga cuidado de no tirar y quitar las raíces DRG, que aparecen como filamentos blancos que salen directamente de los canales.

Una vez que se haya extraído todo el tejido central, use pinzas muy finas para tirar de toda la raíz DRG, llegando profundamente a los canales vertibles y teniendo cuidado de no dañar las raíces de los ganglios. Coloque el DRG en un plato de árbol para mascotas de 60 milímetros cuadrados que contenga de tres a cuatro mililitros de jamones F 12 medianos suplementados con antibióticos. Luego, bajo un microscopio de disección, use pinzas estériles y un bisturí para eliminar cualquier exceso de raíces nerviosas que rodeen los ganglios para reducir la contaminación de las células satélite.

A continuación, transfiera el DRG a una placa de Petri de 35 milímetros cuadrados que contenga 1,8 mililitros de medio F 12 fresco y agregue 200 microlitros de colagenasa. Solución madre tipo cuatro. Incubar el DRG durante una hora y luego aspirar cuidadosamente el medio con una pipeta de vidrio.

Teniendo cuidado de no aspirar o dañar el DRG. Repita el paso de colagenasa y lave el DRG con F 12 medio. Después del segundo lavado, agregue 1,8 mililitros de medio F 12 y 200 microlitros de tripsina a las células.

Eliminar la tripsina y añadir un mililitro de medio suplementado con 500 microlitros de FBS para detener la reacción enzimática. A continuación, aspire el medio y lave suavemente el DRG con medio F 12 tres veces para eliminar todos los restos del suero. Ahora alimente las células con dos mililitros de medio F 12 fresco y use una pipeta de vidrio para transferir cuidadosamente la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros.

Pipetea hacia arriba y hacia abajo de ocho a 10 veces para disociar suavemente las neuronas y luego permitir que el paladar se acumule en el fondo del tubo cuando el paladar se haya asentado. Transfiera el supinato a un nuevo tubo y agregue dos mililitros de F 12 medio fresco al paladar. La repetición de la disociación mecánica y la transferencia del medio a la suspensión se vuelven homogéneas.

A continuación, vuelva a clasificar la suspensión celular tres o cuatro veces, seguido de la filtración de la suspensión homogeneizada resultante a través de un filtro de células de 100 micras en un nuevo tubo de 50 mililitros. Centrifugar las células en un tubo de 15 mililitros mientras van girando lentamente con pipeta recién preparada. 15% de albúmina sérica bovina en el interior de un tubo de 15 mililitros, sostenido en un ángulo de 45 grados para crear un rastro gradual de proteínas.

Usando los números en el tubo como referencia para la pista de formación, luego aspire el snat de las células, guardando los últimos 500 microlitros para el resus, suspendiendo la bolita y dispense lentamente las células a lo largo del rastro de proteínas en el nuevo tubo. Después de girar las células, nuevamente, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio BS modificado y siembre las células en un pequeño volumen de medio. En una placa de 24 pocillos durante dos horas, cuando las células se hayan adherido, agregue medio BS fresco suplementado con 15 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento nervioso después de la disociación.

Las células DRG también se pueden utilizar para el cocultivo con las células madre adiposas similares a las células de cisne sembrando sobre las células previas a la siembra. Estas imágenes demuestran la importancia de las células madre adiposas similares a las células de Schwan para la germinación de la neurita DRG en un modelo de cocultivo utilizando películas de policaprolactona como sustratos. No se observaron neuritas en las superficies no tratadas en ausencia de células madre adiposas similares a las células de cisne, mientras que la formación de las neuritas mejoró claramente en el sistema de cocultivo.

En promedio, el número de neuritas por cuerpo celular aumenta significativamente en presencia de células madre. De hecho, como ilustran estas imágenes, la capacidad de las neuronas DRG para hacer brotar neuronas se produce preferentemente en conjunción con las células madre diferenciadas, como lo indican las flechas amarillas rosas. Entonces, después de ver este video, ahora debería poder obtener células madre derivadas de la liberación y disociar las neuronas DGen.

Pero también debería ser capaz de establecer un modelo para estudiar la degeneración media periférica.