Name: Adelante Genética pantallas usando macrófagos identificar Toxoplasma gondii Genes Importante Inmunidad Autónoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Descubre cómo la genética directa identifica genes de Toxoplasma gondii que evaden la inmunidad autónoma en macrófagos. Este método revela mecanismos de evasión inmune y abre vías para nuevas estrategias terapéuticas contra patógenos intracelulares.

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Un agradecimiento especial al Dr. Peter Bradley por el anticuerpo para detectar las mitocondrias de T. gondii. El trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Grants AI072028 y AI107431 a D.G.M y una generosa donación al Colegio Médico de Nueva York para el estudio de la medicina tropical.

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

El protocolo descrito proporciona un enfoque no sesgado que utiliza la activación de los macrófagos murinos derivadas de médula ósea y genética directa para aislar T. mutantes gondii con un defecto en su capacidad para sobrevivir activación de los macrófagos infectados. El fenotipo de la siguiente activación de los macrófagos mutantes normalmente cae en una de dos categorías: 1) Los parásitos aparecen intactos, pero no logran replicar más allá de 1 parásito por PV; 2) Los parásitos aparecer degradadas ...

Toxoplasma gondii (T. gondii) es un intracelular obligado, protozoos patógenos. Es el agente causante de la toxoplasmosis, un peligro para la salud en individuos inmunocomprometidos. También es el sistema modelo para otros patógenos que infectan a los seres humanos apicomplexan incluyendo Cryptosporidium y Cyclospora. La toxoplasmosis se adquiere con mayor frecuencia a través de la ingestión de alimentos o agua contaminados con la etapa bradizoíto o ooquistes del parásito. Después de la ingestión, estas etapas se convierten en el escenario taquizoíto del parásito que se replica dentro de las células huésped y disemina sistémicamente. Células T, IFN-γ y, en menor medida, el óxido nítrico 1-4, son importantes para el control de la infección, pero no son capaces de eliminar la enfermedad, como una proporción de taquizoítos se convierten en la etapa de bradyzoite que están protegidos dentro de quistes tisulares resultando en una infección crónica de larga duración. De hecho, no hay terapias eficaces contra el quiste s crónicataje de la enfermedad. Toxoplasmosis severa es más a menudo debido a la reactivación de la infección persistente, con la etapa bradizoíto del parásito convertir de nuevo a la fase de replicación rápida característica taquizoíto de la infección primaria y aguda. La supervivencia temprana en la cara de la respuesta inmune innata es importante para permitir que el parásito para alcanzar el número de parásitos suficientes, así como para llegar a sitios distales, para permitir el establecimiento de la infección crónica. T. gondii ha desarrollado estrategias para contrarrestar los mecanismos de defensa del huésped que probablemente contribuyen a su capacidad de replicar y difundir principios de la infección. En primer lugar, T. gondii forma un PV única durante la invasión parásito que es en gran parte segregados de los procesos de endocitosis y exocytic de la célula huésped en comparación con otros patógenos intracelulares 5-9. Además, como todos exitosa T. patógenos intracelulares gondii modifica su célula huésped para crear un ambiente permisivo fo el crecimiento. Esto incluye anfitrión reprogramación de la expresión génica de células mediante la alteración de los factores de transcripción de la célula huésped, incluyendo aquellos que son importantes para la regulación de la activación de células 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 y GRA16 GRA24 22, han demostrado ser importantes en la regulación de la respuesta transcripcional y señalización celular cascadas de células huésped infectadas con T. gondii. Estudios recientes utilizando cruces genéticos entre las cepas del parásito con fenotipos distintos han sido muy productivo en la identificación de genes del parásito que subyacen rasgos genotipo dependiente de parásitos incluyendo evasión de la inmunidad relacionada GTPasas (IRGs) 16,19,23-26. En ratones, GTPasas de inmunidad relacionada (IRGs) son críticos para el control de tipo II y III genotipos del parásito mientras que el tipo muy virulenta I genotipos han desarrollado mecanismos para evadir las IRGs murinos. Sin embargo, también es claro que el parásito ha desarrollado mecanismos para evadir medios antimicrobianoTdR en Además de los IRGs y que algunos de estos mecanismos pueden ser conservadas a través de los genotipos de parásitos 27,28. Además, se sabe muy poco acerca de los mediadores críticos de la inmunidad celular autónoma contra T. gondii toxoplasmosis durante humano. Genes de parásitos importantes para la resistencia a los mediadores de la inmunidad celular autónoma también pueden ser importantes para la supervivencia durante taquizoíto a bradizoíto conversión que también puede ser provocada por respuestas inmunitarias del huésped. Por ejemplo, el óxido nítrico a niveles altos puede suprimir la replicación del parásito en los macrófagos infectados pero también puede estimular a bradyzoite de taquizoitos de conversión resultante en la producción de quiste 30-32. ToxoDB es una base de datos genómica funcional para T. gondii que funciona como un recurso crítico para el campo en términos de proporcionar información de la secuencia para el genoma del parásito y el acceso a los datos publicados y no publicados escala genómica incluyendo anotaciones de la comunidad, exp gen<html> resión y proteómica de datos 33. Similar a muchos patógenos protozoarios, la mayoría del genoma consiste en genes hipotéticos con información no disponible sobre la base de homología genética para dar una idea de sus funciones potenciales. Por lo tanto, la genética hacia adelante es una poderosa herramienta para identificar nuevos genes de parásitos importantes para la evasión inmune, la conversión quiste y otras funciones críticas para la patogénesis del parásito, así como para la conversión entre las etapas de desarrollo distintas. Una fuerza adicional de la genética hacia adelante es que puede ser utilizado como un enfoque relativamente no sesgada para interrogar el parásito en cuanto a los genes que son importantes para tareas específicas en la patogénesis, incluyendo la evasión inmune y la formación de quistes. Los últimos avances en la secuenciación de próxima generación para el perfil mutacional han convertido en un método de elección para la identificación de los genes del parásito responsable de los estudios de genética hacia adelante usando mutagénesis química y de inserción 34-37. ntent &quot;&gt; Es importante identificar las vulnerabilidades de T. gondii que pueden ser explotados para mejorar la eficacia de los mecanismos inmunes celulares autónomas contra el parásito en particular los que también pueden ser activos frente a la etapa de quiste resistente. Con este objetivo, un in vitro murino infección de los macrófagos y modelo de activación fue desarrollado para identificar las mutaciones en el parásito que perjudica específicamente T. gondii gimnasio después de la activación de los macrófagos infectados, pero no en los macrófagos ingenuos. Se utilizó Esta pantalla macrófagos para interrogar a una biblioteca de T. gondii mutantes de inserción con el fin de, en última instancia identificar los genes de T. gondii importantes para la resistencia al óxido nítrico 27,28. El aislamiento de un panel de mutantes de T. gondii con una alteración de la resistencia a la activación de macrófagos infectados, en particular una marcada sensibilidad a la óxido nítrico, ha demostrado la utilidad de la pantalla para identificar genes de parásitos importantes para la resistenciaa los mediadores de la inmunidad celular autónoma distinta de los mecanismos de resistencia descritas para los IRGs murinos 28. Mutagénesis de inserción tiene ventajas sobre mutagénesis química en términos de generar un número limitado de mutaciones aleatorias en cada clon parásito y, en teoría, más fácil identificación del sitio de la mutación. Sin embargo, identificar el sitio genómico de la inserción del plásmido en T. mutantes de inserción gondii, en la práctica, ha sido sorprendentemente difícil en muchos casos 37. La inserción de un plásmido en un gen también es probable que interrumpir la función de un gen en contraste a mutagénesis química que típicamente resulta en cambios de nucleótidos individuales. Sin embargo, mutagénesis química, ya sea con-N-nitrosourea N-etil (ENU) o sulfonato de etilmetano (EMS) puede ofrecer una mayor capacidad para analizar una porción más grande del genoma del parásito, en comparación con la mutagénesis de inserción, ya que crea múltiples polimorfismos de nucleótido único ( estimado en 10 -100) por 34 mutante, De 38 años. Por otra parte, los recientes avances en toda genoma de perfiles ha hecho posible el uso de la secuenciación de próxima generación para identificar los genes candidato más probable responsable del fenotipo identificado de un parásito mutado 34,38. Independientemente del enfoque de mutagénesis, la confirmación de la función del gen parásito en la resistencia a la activación de los macrófagos en última instancia requiere eliminación y complementación génica para cumplir los postulados de Koch molecular. La capacidad para diseccionar la función de un gen mediante la manipulación genética de tanto el parásito y el macrófago es importante ya que muchos de los genes identificados a través de la genética hacia adelante en T. gondii, así como otros patógenos, todavía se caracterizan como genes hipotéticos con poca o ninguna homología de secuencia con otras proteínas con funciones conocidas. El presente documento describe un enfoque general que se puede utilizar para identificar si el gen alterado en un mutante es importante para la resistencia a un conocido odesconocido mediador de la inmunidad celular autónoma. El análisis inicial de los factores antimicrobianos de acogida se realiza mediante la evaluación de la supervivencia de tipo salvaje y parásitos mutantes en los macrófagos de ratones de tipo salvaje frente a aquellos con deleciones de genes específicos en óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), gp-91 phox (NADPH oxidasa), y inmunidad relacionada GTPasas específicos (IRGs). Esto determinará si los genes del parásito identificados son importantes para la resistencia al óxido nítrico, intermediarios reactivos del oxígeno o relativas a la seguridad GTPasas 28, respectivamente, o si un mecanismo inmunológico desconocido se tratara. La activación de los macrófagos infectados tanto con IFN-γ y LPS, descritos en el protocolo actual, resulta principalmente en el aislamiento de genes de parásitos importantes para la resistencia al óxido nítrico 28. El uso de agentes farmacológicos que inducen la óxido nítrico en la ausencia de la activación de macrófagos (donantes de óxido nítrico) confirmó que la mayoría de los genes identificados eran importantes para reresistencia al óxido nítrico en lugar de óxido nítrico en concierto con mediadores adicionales asociados con la activación de los macrófagos 28. Paso uno y dos describen una pantalla genética adelante diseñada para aislar mutantes parásito con un defecto físico después de la activación de los macrófagos derivados de médula ósea infectadas in vitro. Paso uno describe un análisis de ajuste de la dosis para determinar empíricamente una dosis de γ y LPS IFN utilizar para la activación de los macrófagos, que reduce la replicación del parásito pero no inhibe completamente la replicación de tipo salvaje T. cepa parental gondii que se utiliza para la creación de la biblioteca de mutantes de parásitos. Paso dos describe la pantalla hacia delante genética de los clones mutantes en los macrófagos en placas de 96 pocillos. Paso tres describe un enfoque para confirmar el fenotipo de cada mutante identificado en la pantalla de las placas de 96 pocillos y para evaluar si el defecto en cada mutante afecta a la supervivencia del parásito, la replicación,o la producción quiste en respuesta a la activación de macrófagos. Paso cuatro describe el uso de macrófagos derivados de médula ósea de ratones con deleciones en las vías de antimicrobianos específicos para identificar los mediadores inmunes a la que el mutante parásito es específicamente susceptible. Paso cinco describe un enfoque para determinar si un mutante parásito también se ve comprometida para la patogénesis in vivo según se evaluó por la producción de quistes en los cerebros de los ratones infectados.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH3008101</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29101& productId=3255471& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Thermo</td><td>SH3091003</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=11737973& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone DPBS</td><td>Thermo</td><td>SH3002802&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2434305& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine</td><td>Thermo SH3003401</td><td>&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3311957& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Pen strep</td><td>Thermo SV30010</td><td>&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668 6& catalogId=29104& emparejadoCat No=SV30010& fromSearch=1& searchKey=SV30010& highlightPro ductsItemsFlag=Y& endecaSearch Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Desde& ahorro= 0.0& xrefEvent=1407777949003_0 & searchType=PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Hanks BSS</td><td>Thermo</td><td>SH3003002</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3064595& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>LPS</td><td>LIST biológicos</td><td>201</td><td>http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords =LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4</td></tr><tr><td>IFN-&#947;</td><td>Pepro Tech Inc</td><td>50-813-664</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652& productId=2988494& catalogId=29 104& GatoNo=50813664& fromSearch=1& searchKey=murine+ifn+pepro+tech& highlightProductsItemsFlag =Y& endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Desde& Ahorro =0.0& xrefEvent=1407778210608_ 12& searchType=PROD& hasPromo =0</td></tr><tr><td>Correderas de cámara</td><td>Thermo</td><td>177402</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2164545& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Placas ópticas de 96 pocillos</td><td>Thermo</td><td>165306</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3010670& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Fisher</td><td>353072</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3158736& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Plasto de cultivo de tejidos T25</td><td>Fisher</td><td>156367</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039 67& catalogId=29104& emparejadoCat No=12565351& fromSearch=1& searchKey=156367& highlightProdu ctsItemsFlag=Y& endecaSearchQu ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Desde& Ahorro =0.0& xrefEvent=1407778974800_ 0& searchType=PROD& hasPromo =</td></tr>0 <tr><td>Ted Pella formaldehído de grado EM</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td>http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3425922& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>Alexa 488 - kit de conjugación de proteínas</td><td>Life Technologies</td><td>A20181</td><td>suero de</td></tr><tr><td>cabra</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235 MP Biomedicals</td><td>ICN19135680</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2133236& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& crossRefData =ICN19135680=2& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Medios de montaje Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H1200</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428</td></tr><tr><td>dolichos conjugados con FITC</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1031</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra LAMP1</td><td>Estudios de desarrollo Banco de hibridomas</td><td>http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Life Tecnologías</td><td>L-7526</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product</td></tr><tr><td>ratones C57BL6</td><td>Laboratorios Jackson</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html gp91 ratones knock out gp91</td><td>Jackson Labaoratories</td><td>2365</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html</td></tr><tr><td>ratones knock out iNOS</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2609</td><td></td></tr><tr><td>nitroprusiato de sodio</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html ACROS Organics</td><td>AC21164-0250&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2627727& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>ACROS Organics</td><td>AC32865-0250</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2252389& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>Ratón monoclonal anti-Toxoplasma gondii Ab</td><td>Fitzgerald Industries International</td><td>10T19A</td><td>http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947</td></tr></tbody></table>

adelante genética pantallas usando macrófagos identificar<em&gt; toxoplasma gondii</empara la resistencia a ifn-γ por células dependiente&gt; genes importante inmunidad autónoma

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, el agente causante de la toxoplasmosis, es un patógeno protozoario intracelular obligado. El parásito invade y se replica dentro de prácticamente cualquier tipo de célula de vertebrado de sangre caliente. Durante la invasión del parásito a una célula huésped, el parásito crea una vacuola parasitófora (PV) que se origina en la membrana de la célula huésped independientemente de la fagocitosis dentro de la cual se replica el parásito. Si bien la inmunidad innata y mediada por células dependientes de IFN es importante para el control final de la infección, las células inmunitarias innatas, incluidos los neutrófilos, los monocitos y las células dendríticas, también pueden servir como vehículos para la diseminación sistémica del parásito en las primeras etapas de la infección. Se describe un enfoque que utiliza la respuesta inmunitaria innata del huésped, en este caso macrófagos, en un cribado genético directo para identificar parásitos mutantes con un defecto de aptitud en los macrófagos infectados tras la activación, pero con una invasión y replicación normales en los macrófagos naïf. Por lo tanto, el cribado aísla mutantes parásitos que tienen un defecto específico en su capacidad para resistir los efectos de la activación de los macrófagos. El artículo describe dos grandes fenotipos de parásitos mutantes después de la activación de macrófagos infectados: estasis del parásito versus degradación del parásito, a menudo en vacuolas amorfas. A continuación, se analizan los mutantes del parásito para identificar los genes del parásito responsables, específicamente importantes para la resistencia a los mediadores inducidos de la inmunidad celular autónoma. El artículo presenta un enfoque general para el cribado de genética avanzada que, en teoría, puede modificarse para dirigirse a genes de parásitos importantes para la resistencia a mediadores antimicrobianos específicos. También describe un enfoque para evaluar los mediadores antimicrobianos específicos de los macrófagos a los que es susceptible el parásito mutante. La activación de macrófagos infectados también puede promover la diferenciación del parásito de la etapa de taquizoíto a bradizoíto que mantiene la infección crónica. Por lo tanto, se presenta una metodología para evaluar la importancia del gen del parásito identificado para el establecimiento de la infección crónica.

Toxoplasma gondii replica libremente en macrófagos no tratados previamente y tiene un tiempo de duplicación entre 6-12 hr dependiendo de la cepa del parásito. La figura 1 muestra parásitos representativos en ingenuo frente a macrófagos derivados de médula ósea activados. Figura 2 muestra la morfología general de parásitos en HFF las células huésped a las 2, 4, 8, 16 y 32 parásitos / PV. En el protocolo actual, se permite que el parásito para invadir los macrófagos tratados prev...

Forward genetics es un poderoso enfoque para identificar genes en patógenos intracelulares importantes para la resistencia a la inmunidad celular autónoma. El enfoque actual utiliza células inmunitarias innatas, concretamente macrófagos, para identificar nuevos genes de Toxoplasma gondii importantes para la evasión inmunitaria.

Adelante Genética pantallas usando macrófagos identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</empara la resistencia a IFN-γ por células dependiente&gt; Genes Importante Inmunidad Autónoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

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Descubre cómo la genética directa identifica genes de Toxoplasma gondii que evaden la inmunidad autónoma en macrófagos. Este método revela mecanismos de evasión inmune y abre vías para nuevas estrategias terapéuticas contra patógenos intracelulares.

Adelante Genética pantallas usando macrófagos identificar

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