Name: Un modelo murino de restenosis arterial: Aspectos Técnicos del femoral Lesiones alambre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Aprende a inducir hiperplasia intimal en la arteria femoral de ratones mediante lesión con alambre. Este protocolo detallado permite estudiar mecanismos de reestenosis vascular con reproducibilidad.

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Este trabajo fue apoyado por un Premio al Nuevo Investigador del Programa de Asociación de Wisconsin (ID 2832), una Subvención R01 del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (HL-068673) y una Subvención de capacitación T32 (HL-110853). Agradecemos al grupo de la Dra. Melina Kibbe en la Universidad Northwestern por proporcionar información útil.

Declaración de Ética: NOTA: Todos los procedimientos se ajustan a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academies Press, 8ª edición, 2011), y los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Wisconsin. Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia con isoflurano (a través de la inhalación, caudal de 2 ml / min), y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los animales fueron sacrificados en una cámara llena gradualmente con CO 2. 1. La inducción de la anestesia general y la incisión de la piel <ol><li> Utilice macho C57BL / 6 ratones con una edad de 12-16 semanas y el peso de 23-28 g. Anestesiar al animal mediante isoflurano a través de un aparato de anestesia de circuito cerrado. Confirmar anestesia adecuada apretando su dedo del pie. Aplique un poco de ungüento de lágrimas artificiales en los ojos para evitar la sequedad. </li><li> Coloque el ratón en una posición supina con la extremidad posterior izquierda ligeramente secuestrado y la articulación de la rodilla slightly flexionada. Afeitarse el pelo alrededor de la región superior del muslo izquierdo y desinfectar la piel con clorhexidina, aplicado tres veces con algodón estéril aplicadores con punta. Utilice un esterilizador de cuentas caliente para mantener los instrumentos esterilizados durante la cirugía. </li><li> Coloque un paño de gasa esterilizada sobre la pierna izquierda. Hacer una incisión longitudinal en la piel 1,5 cm recta en el muslo medial izquierdo de la articulación de la rodilla hasta la ingle (Figura 1A). </li></ol> 2. La exposición de la arteria femoral y Ramas NOTA: La Figura 1B muestra la anatomía vascular grave en la parte superior del muslo. La arteria femoral superficial (SFA) se puede observar a través de un microscopio de disección cuando la incisión de la piel se hace adecuadamente a lo largo de la línea media del muslo medial. <ol><li> Abre la fascia delgada que recubre el SFA con finas pinzas y luego bucle del SFA con 9-0 sutura de nylon. NOTA: En este proceso, el nervio femoral es fácil de poner comoide, pero la vena femoral adyacente requiere mucha atención, porque su pared es tan delgada que perfora y sangra fácilmente. La técnica clave es centrarse en la propia arteria; siempre que la disección se lleva a cabo cerca de la arteria, cualquier daño accidental vena es evitable. </li><li> Una vez que la SFA se enlaza, mantenga la sutura con una pinza de mosquito y tire de él ligeramente hacia abajo. Esta maniobra hace más disección más fácil, pero para evitar daños en la arteria no tire con demasiada fuerza. </li><li> Continuar la disección de la arteria proximal para exponer y bucle de la arteria femoral común (CFA) con 9-0 sutura de nylon. NOTA: Por lo general, rizando el Comité de Libertad Sindical en un punto distal a la arteria epigástrica (Figura 1B) es suficiente para la inserción de cables. Mantenga el lazo de sutura CFA con pinzas de mosquitos de la misma manera. </li><li> Tire del lazo de sutura CFA hacia arriba y el lazo de sutura SFA hacia abajo para destapar la bifurcación de SFA y la arteria femoral profunda (DFA). La DFA, la rama principal del Comité de Libertad Sindical,va hacia el músculo del muslo (Figura 1B). NOTA: El cable se inserta desde la DFA después. </li><li> Pase el DFA con mucha precaución debido a que la vena adyacente está enredado por debajo de la arteria. En caso de sangrado de la vena, un 30 a 60 seg compresión simple con una gasa es generalmente suficiente para producir hemostasis. </li><li> Una vez que el DFA se enlaza con 9-0 sutura de nylon, asegúrese de que los tres bucles de sutura están en sus posiciones correctas (Figura 2A). </li><li> Proceder con la disección de la DFA distalmente para ligar la arteria en un punto lo más lejos posible de la bifurcación. Cortar sutura extra, pero dejar una cierta longitud de manera que los dos extremos se pueden celebrar con pinzas de mosquito, que estabilizan la DFA hacer la inserción de cables más fácil. </li></ol> 3. Creación de Lesión alambre <ol><li> Inserte el cable a través de DFA <ol><li> Colar las suturas CFA, SFA, y DFA para establecer una pinza hemostática temporal. </li><li> Haz un pequeño agujero en el DFA con microtijeras. Insertar las puntas de los micropinzas curvadas para dilatar el agujero suficientemente grande para un alambre con un diámetro de 0,015 pulgadas (Figura 2B demuestra la diferencia de tamaño entre la arteria y el cable). <ol><li> Antes de hacer un agujero en la DFA, aflojar el lazo de sutura CFA y suavemente sujetar / apriete el DFA varias veces con micropinzas-opacos punta. Esta maniobra se amplía el diámetro arterial notablemente para facilitar la inserción de cables. Humedecer el alambre a fondo con PBS también es importante para una inserción suave. </li><li> Al hacer un agujero en la DFA, no recortar la pared arterial, pero hacer un pequeño pellizco en forma de V y pellizcar la solapa con micropinzas de punta afilada para la manipulación. </li></ol></li><li> Inserte el cable por el agujero adecuadamente dilatado en la DFA. Avanzar suavemente el alambre hacia la arteria ilíaca mientras afloja el lazo de sutura alrededor del CFA. 5-8 mm es suficiente para cubrir toda la longitud CFA en la mayoría de los casos (Figura 2C </strong&gt;). No inserte el cable de fuerza como una perforación arterial por lo general resulta en la pérdida del ratón. Acortar el cable a aproximadamente 15 mm de longitud ayuda a la manipulación. </li></ol></li><li> Deja alambre dentro de 1 Min <ol><li> Después de insertar el cable a la longitud óptima, se deja durante 1 min a estirar demasiado la pared arterial. Humedezca el alambre y las arterias con PBS para evitar que se seque. Otra sutura de nylon 9-0 se puede colocar alrededor de la DFA proximal al punto de inserción de alambre durante este tiempo de espera. Esta sutura se utilizará más adelante para cerrar el orificio de la DFA después de la extracción del alambre. </li></ol></li><li> Recuperar alambre y reanudar el flujo sanguíneo <ol><li> Sujete el cable con pinzas de canulación del vaso, y tirar de ella con suavidad; el cable debe ser recuperada sin problemas. Para superar cualquier resistencia, causada generalmente por la adhesión del alambre a la pared arterial, retroceso del cable con rotación suave es útil. Una vez más, una maniobra contundente podría resultar en la pérdida de los animales. </li><li> Laespués de recuperar el cable, ligar la DFA en el punto de bifurcación con sutura de nylon 9-0. No ligar demasiado cerca de la bifurcación, que pondría en peligro el flujo de salida de sangre a la SFA. </li><li> Aflojar los lazos de sutura SFA y CFA para reanudar el flujo de sangre normal. Tenga en cuenta que el Comité de Libertad Sindical es bien expandimos la inserción del cable (Figura 2D). </li></ol></li></ol> 4. Cierre de la piel y Cuidado Postoperatorio <ol><li> Sangra de control. Exudación Minor puede ser detenida por compresión simple; algunos importantes hemorragias arteriales requieren puntos de sutura con una sutura de nylon 11-0. Estas arterias suturadas eventualmente resultarán en la oclusión arterial. </li><li> Cierre de la piel de la herida con grapadoras de piel (generalmente 3-4 grapas). Mantenga el área de la herida esterilizado mediante la aplicación de solución quirúrgica clorhexidina. </li><li> Aplicar tratamientos post-quirúrgicos. Controlar el dolor del ratón con inyecciones subcutáneas de buprenorfina. Mantenga el ratón en la plataforma de calentamiento hasta que se haya recuperado sufciente conciencia de mantener decúbito esternal. Casa en una jaula limpia y sin compañía de otros animales hasta que se recuperó totalmente. </li></ol>

<ol><li>Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+proliferation+and+atherosclerosis%3A+new+perspectives+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies.</a> Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).</li>
<li>Hui, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intimal+hyperplasia+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Intimal hyperplasia in murine models.</a> Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El procedimiento lesión alambre es aplicable a todas las cepas de ratones, siempre y cuando sus estructuras anatómicas son similares. 4 En este trabajo, hemos utilizado macho C57BL / 6 ratones con una edad de 12 a 16 semanas. Como hemos aprendido de nuestros estudios preliminares, las arterias femorales de ratones más jóvenes de 10 semanas son a menudo tan pequeña que la inserción del alambre es todo un reto. Por otro lado, la inserción del alambre en ratones de más de 16 semanas es técnicamente más fácil, pe...

En la era de la aplicación ampliada de tratamientos endovasculares para diversas enfermedades cardiovasculares, la reestenosis después de la angioplastia es uno de los principales problemas para los pacientes que se someten a dichos tratamientos. El daño al endotelio vascular en el momento de la angioplastia, en consonancia con el fondo aterosclerótico, induce una proliferación excesiva de células de músculo liso en la capa medial, lo que resulta en hiperplasia neointimal. 1,2 Un modelo animal viable que recapitule la hiperplasia neointimal post-angioplastia es, por lo tanto, importante no solo para la investigación de los mecanismos de la enfermedad, sino también para el desarrollo de terapias efectivas para tratar esta patología.
Los ratones representan un excelente modelo animal para recapitular la hiperplasia neointimal por las siguientes razones: los antecedentes genéticos de los ratones experimentales están bien establecidos; una amplia variedad de cepas modificadas genéticamente están disponibles; 2 Conseguir compañeros de camada del mismo origen es fácil; y el costo de los animales es relativamente bajo. El modelo de ligadura arterial y el modelo de lesión con alambre son los dos modelos de ratón más comunes de hiperplasia neointimal inducida mecánicamente. El modelo de ligadura arterial es fácil de crear, pero fisiológicamente diferente al procedimiento de angioplastia real. El modelo de lesión por alambre imita de cerca los procedimientos reales de angioplastia, pero es técnicamente difícil debido al pequeño tamaño de las arterias de los ratones. 2,3 Sata et al. describieron por primera vez un método de lesión con alambre para las arterias femorales de ratón basado en la estructura anatómica de la vasculatura y el uso de alambre flexible de tamaño adecuado. Utilizando esta técnica, lograron inducir de manera reproducible la hiperplasia neointimal en varias cepas de ratones. 4
Aunque la lesión del hilo femoral es un modelo bien establecido, algunos de los aspectos técnicos de la técnica son muy desafiantes en comparación con otros modelos como la ligadura. 5 El propósito de este artículo es describir en detalle los procedimientos de nuestro modelo de lesiones por alambre de ratón, que es una versión modificada del método original de Sata. Hemos hecho dos modificaciones principales: 1) Bucle solo las arterias, y 2) No uso de lidocaína.

<table><tbody><tr><td>Guía de alambre de núcleo fijo</td><td>Cook</td><td>G02426</td><td>Diámetro 0.015 pulgadas,</td></tr><tr><td>pinzas de dilatación</td> rectas <td>Roboz</td><td>RS-4927</td><td>Puntas curvas y romas</td></tr><tr><td>Dumont Tweesers #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td>Puntas rectas y afiladas</td></tr><tr><td>Pinzas de canulación de recipientes Dumont</td> World <td>Precision Instruments</td><td>503373</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras McPherson-Vannas</td><td>World Precision Instruments</td><td>501234</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas para mosquitos</td><td>World Precision Instruments</td><td>501291</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon Sutura de Nylon 9-0</td><td>Ethicon</td><td>7717G</td><td>9-0, Monofilamento de Nylon</td></tr><tr><td>Negro Micro AROSuture, Estéril 11-0, 70 micrómetros, MET Point</td><td>AROSurgical</td><td>VT4A00N07</td><td>11-0, Monofilamento de Nylon</td></tr><tr><td>Negro 3M Precise Multi-Shot DS Piel Desechable Grapadora</td><td>3M</td><td>DS-25</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo murino de restenosis arterial: aspectos técnicos del femoral lesiones alambre

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

La enfermedad cardiovascular causada por la aterosclerosis es la causa principal de muerte en el mundo desarrollado. El estrechamiento de la luz del vaso, debido al desarrollo de la placa aterosclerótica o la ruptura de placas establecidos, interrumpe el flujo normal de la sangre que conduce a diversas morbilidades, tales como infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. En los procedimientos endovasculares clínicas como la angioplastia se realizan comúnmente para reabrir el lumen. Sin embargo, estos tratamientos dañan inevitablemente la pared del vaso, así como el endotelio vascular, la activación de una respuesta de cicatrización excesiva y el desarrollo de una placa neointimal que se extiende en el lumen del vaso que causan la reestenosis (re-estrechamiento). La restenosis sigue siendo una causa importante de fracaso de los tratamientos endovasculares para la aterosclerosis. Por lo tanto, los modelos animales preclínicos de reestenosis son de vital importancia para la investigación de los mecanismos fisiopatológicos, así como de la traducción se acerca a las intervenciones vasculares. Entre varios EXPERIME murinomodelos NTAL, lesiones alambre arteria femoral es ampliamente aceptado como el más adecuado para estudios de reestenosis post-angioplastia porque se parece mucho al procedimiento de angioplastia que daña tanto el endotelio y la pared del vaso. Sin embargo, muchos investigadores tienen dificultades para la utilización de este modelo debido a su alto grado de dificultad técnica. Esto es principalmente porque un alambre de metal tiene que ser insertado en la arteria femoral, que es aproximadamente tres veces más delgado que el alambre, para generar suficiente para inducir la lesión neoíntima prominente. A continuación, describimos los detalles quirúrgicos esenciales para superar de manera efectiva las principales dificultades técnicas de este modelo. Siguiendo los procedimientos presentados, la realización de la lesión de alambre de la arteria femoral del ratón se vuelve más fácil. Una vez familiarizado, todo el procedimiento puede ser completado dentro de 20 min.

Cuatro semanas después de la cirugía, la cosecha de la arteria femoral alambre heridos y hacen muestra de bloque una parafina para analizar la formación de la neoíntima. Inducir la anestesia general como se describió anteriormente. Abra el pecho inmediatamente e inserte una mariposa aguja de calibre 20 al ventrículo izquierdo. Conecte la línea de una botella de infusión. Realizar fijación por perfusión a través de infusión por goteo de PBS seguido de paraformaldehído al 4% (por lo general 10 a 20 ml, cada uno)....

El modelo de lesión de alambre arteria femoral de ratón de la reestenosis es técnicamente difícil. En este protocolo se muestran los detalles técnicos clave esencial para llevar a cabo con éxito la lesión de alambre para inducir neointima consistente para estudios de reestenosis.

Un modelo murino de restenosis arterial: Aspectos Técnicos del femoral Lesiones alambre

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

El objetivo de este procedimiento es crear una hiperplasia íntima prominente inducida por lesión con alambre en la arteria femoral de ratones. Esto se logra primero realizando una incisión cutánea longitudinal en el muslo izquierdo. A continuación, se localiza la arteria femoral y se rodea en tres regiones anatómicas importantes: la arteria femoral superficial o SFA, la arteria femoral común o CFA, y la arteria femoral profunda o DFA.Luego se realiza un pequeño orificio en la pared de la ADA y se inserta un alambre metálico que se avanza hacia la AFA, donde se deja durante un minuto. Finalmente, se retira el alambre y la ADA se liga en dos puntos. En última instancia, la tinción con hematoxilina y eosina de secciones transversales muestra una hiperplasia íntima marcada en la arteria femoral.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a dos razones. Primero, deben encontrar la arteria de acceso adecuada desde el interior profundo del músculo. Segundo, deben insertar un alambre, que es aproximadamente tres veces más grueso que la arteria de acceso, tras anestesiar a un ratón macho C57 plaque seis.Seg&uacute;n el protocolo descrito, tras confirmar la aneste

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El procedimiento quirúrgico para la inducción de isquemia miembro posterior unilateral se demuestra, con la confirmación de la isquemia por imágenes de perfusión Doppler láser.

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La reestenosis después de los procedimientos cardiovasculares (cirugía de bypass, angioplastia o stent) es un problema significativo que reduce la durabilidad de estos procedimientos. Una terapia ideal inhibiría la proliferación de células de músculo liso (VSMC) mientras promovía la regeneración del endotelio. Describimos un modelo para la evaluación simultánea de la proliferación VSMC y la función endotelial in vivo.

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La lesión del globo arterial carótido de rata imita el procedimiento clínico de angioplastia realizado para restaurar el flujo sanguíneo en vasos ateroscleróticos. Este modelo induce la respuesta a lesiones arteriales al desprestir la pared arterial, y desnudar la capa intimal de las células endoteliales, causando en última instancia remodelación y una respuesta hiperplástica intimal.

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Aquí presentamos un modelo murino para la anastomosis de la arteria femoral, ofreciendo a los investigadores un valioso modelo animal para estudiar y simular la estenosis anastomótica vascular. Este desarrollo es crucial para avanzar en nuestra comprensión de la fisiopatología subyacente a esta afección y facilitar una investigación más precisa y eficaz de las enfermedades vasculares.

Desarrollo de un modelo murino para la estenosis anastomótica de la arteria femoral

Aprende a inducir hiperplasia intimal en la arteria femoral de ratones mediante lesión con alambre. Este protocolo detallado permite estudiar mecanismos de reestenosis vascular con reproducibilidad.

Un modelo murino de restenosis arterial: Aspectos Técnicos del femoral Lesiones alambre

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