Name: El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica Ex Vivo Cultivo Celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprende a aislar linfocitos residentes de piel humana mediante biopsia y disociación enzimática para análisis por citometría de flujo y cultivo ex vivo. Este protocolo mejora la eficiencia en dermatología e inmunología tumoral.

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biopsias de piel de pacientes con psoriasis fueron amablemente proporcionados por el Dr. Andreas Koerber (departamento de Dermatología de la Universidad de Essen, Alemania) tras el consentimiento informado por escrito o por vía oral para uso científico. XH también es apoyado por SNCF 61263039 y 11101321 SNCF.

NOTA: Las biopsias de piel de individuos sanos se obtuvieron a partir de restos de piel abdominal de los individuos sometidos a cirugía plástica electiva tras el consentimiento informado por escrito o por vía oral para uso científico. El uso de piel humana fue aprobado y de acuerdo con las normas establecidas por los comités de ética médica para la investigación humana del centro médico de la Universidad Radboud, Nijmegen, Países Bajos y la Universidad de Essen, Alemania. 1. Preparación de suspensiones de células individuales de la piel humana (Trabajo estéril en un gabinete de flujo si el cultivo celular subsiguiente es obligatorio) <ol><li> Preparar medio de cultivo celular: RPMI 1640 + penicilina / estreptomicina (concentraciones finales de 100 unidades / ml y 100 mg / ml, respectivamente) + piruvato (0,02 mM) y glutamax (0,02 mM), sin suero añadido. </li><li> Para preparar el medio de cultivo completo: medio de cultivo preparado en el paso 1.1 + 10% de suero humano agrupado (HPS); almacenar a 4 ° C. Llevar medio a 20 ° C ± 2 frente a nosotrosEn g. </li><li> Obtener la biopsia de la piel utilizando un instrumento de biopsia por punción redonda de 4 mm y mantenerlo en medio de cultivo completo RPMI 1640 a 20 ° C ± 2 para un máximo de 4 horas oa 4 ° C ON. Procesar la biopsia tan pronto como sea posible a su llegada al laboratorio. NOTA: más largo de almacenamiento de la piel influirá en el rendimiento de células y la viabilidad celular. </li><li> Etiquetar un tubo de disociación con tapa azul y añadir 5 ml de medio de cultivo completo en el tubo etiquetado. </li><li> Añadir 2 ml de medio de cultivo completo en cada pocillo (un total de 3 pocillos) de una placa de cultivo estéril de 6 pocillos. Utilice herramientas estériles para colocar la biopsia en un solo pozo, enjuague, moverlo hacia un segundo pozo y repetir este paso una vez más, logrando así un total de tres enjuagues. </li><li> Transferir la biopsia de la piel bien enjuagado a una placa de Petri estéril, añadir 100 l de medio de cultivo completo en la parte superior de la biopsia, y cuidadosamente raspar el tejido graso subcutáneo utilizando un acero inoxidable desechable bisturí estéril. NOTA: Jes que es un paso crítico. </li><li> Cortar cada biopsia de piel en 4 trozos más pequeños en una placa de Petri estéril. Transferir las muestras (hasta cuatro de las biopsias de 4 mm por tubo) en el tubo de disociación preparado que contiene 5 ml de medio de cultivo completo. </li><li> Cerrar herméticamente los tubos con la tapa y coloque boca abajo a la camisa del disociador automatizado de tejidos. Asegúrese de que todo el material de muestra se encuentra en la zona del rotor. </li><li> Iniciar el proceso de disociación mediante la ejecución del &quot;_01 m_spleen programa&quot; (un programa predefinido proporcionada por la memoria interna del instrumento o de la tarjeta de programa acompañada) para disociar la biopsia a la velocidad de rotación apropiada para 56 seg. </li><li> Después del procesamiento, separar el tubo de la disociación del disociador y asegurarse de que todo el material disociado se recoge en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir 150 l de colagenasa IA (80 mg / ml) en el tubo de disociación e incubar la muestra en un baño de agua con agitación a 37° C durante 60 min. Añadir 100 l de DNasa I (5 MU / ml) en tubo de thedissociation, mezclar bien. NOTA: Mayor concentración de colagenasa o el tiempo de incubación más largo va a alterar la viabilidad celular. </li><li> Una el tubo de disociación para la manga de la disociador tejido automatizado y ejecutar el &quot;m_ programa bazo _01&quot; para disociar la biopsia una vez más. </li><li> Colocar un filtro de células de nylon 70 M en la parte superior de un tubo Falcon 50 ml. Aplicar materiales de muestra disociadas a este filtro de células para eliminar grupos de células / restos de tejido. </li><li> Lavar filtro de células una vez con 5 ml de medio de cultivo completo. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 10 min y el sobrenadante aspirado. </li><li> Repita el paso de lavado una vez más. Volver a suspender los sedimentos celulares en 300 l de medio de cultivo completo. una sola célula suspensiones están listos para su posterior análisis; continuar con protocolos para el cultivo de células ex vivo o citometría de flujo análisis. </li><li> En caso de un nuevo itinción de citocinas ntracellular, estimular las células con PMA (12,5 ng / ml), ionomicina (500 ng / ml) y Brefeldine A (5 g / ml) durante 4 horas a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 4 h antes de la realización de flujo El análisis de citometría. </li></ol> 2. policlonal activación de células T cutáneas Residentes (Ex Vivo Cultura de la célula) <ol><li> Alícuota de 100 l suspensiones unicelulares (preparado en la etapa 1.15) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. NOTA: Para cada uno de 4 mm biopsia de la piel, las suspensiones de una sola célula adquiridos se pueden dividir en al menos dos pocillos de una placa de 96 pocillos. </li><li> Añadir anti-CD3 / anti-CD28 microperlas recubiertas con mAb (25.000 cuentas por pocillo), recombinante humana de citoquinas rIL-2 (concentración final 25 U / ml) y rIL-1ß (concentración final 50 ng / ml). </li><li> Cubrir la placa de cultivo con una tapa de placa de marcado, se incuban en 5% de CO 2, el 100% de humedad, 37 ° C incubadora. Cambie medio cuando el color medio se pone en amarillo. <br/&gt; NOTA: Una colonia de células claras se puede observar a partir de día 8 de cultivo celular. </li></ol> 3. Análisis de citometría de flujo de células de la piel primaria / Residentes T cultivadas <ol><li> Preparar tampón FACS: PBS + BSA al 0,2%. </li><li> Transferencia de células de interés en una placa de 96 pocillos de fondo en v. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado. </li><li> Resuspender el precipitado en 100 l de PBS. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado. </li><li> Las células se tiñen con 100 l de eFluorescence780 preparados conjugados colorante de viabilidad corregible (1: 1000 dilución utilizando PBS) a 4 ° C durante 30 min. Añadir 100 l de tampón de FACS, se centrifuga a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado. </li><li> Seleccionar mAbs requeridos marcador de superficie celular, por ejemplo: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (FC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), y CD1c-APC (AD5-8E7, 01:10), preparar los mAbs mezcla usando tampón de FACS en función de cada factor de dilución mAb probado. Definir ajustes de la compuerta utilizando control de isotipo de anticuerpo junto con la muestra no mancha. </li><li> Añadir 25 l de preparado mAbs-mezcla en cada pocillo. Incubar 20 minutos a 20 ° C ± 2, protegerlo de la luz. </li><li> Añadir 100 l de tampón de FACS, se centrifuga a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado. </li><li> Para las muestras que sólo requieren tinción de la superficie celular, continúe con el paso 3.16. </li><li> En el caso de la tinción de Foxp3 intra-celular: <ol><li> Preparar la fijación y permeabilización de amortiguación mediante la mezcla de una parte de concentrado con 3 partes de diluyentes. </li><li> Preparar tampón de permeabilización 1x: 1 parte de tampón de permeabilización 10x + 9 partes de H 2 O. esterilizada </li></ol></li><li> pellets de resuspender en 100 l de fijación y permeabilición tampón, mezclar bien e incubar a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Añadir 100 l de tampón de permeabilización a cada pocillo, se centrifuga a 450 xg a TA durante 2 min, y el sobrenadante aspirado. </li><li> Lavar las células con tampón de permeabilización una vez más. </li><li> Seleccionar mAbs intracelulares necesarias, por ejemplo, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) y IFN-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Preparar la mezcla de anticuerpos monoclonales usando tampón de permeabilización que contenía suero de rata normal 2% de acuerdo a cada factor de dilución del AcMo probado. Definir ajustes de la compuerta utilizando control de isotipo de anticuerpo junto con la muestra no mancha. </li><li> Añadir 20 l de preparado mAb-mezcla en cada pocillo. Incubar a 4 ° C durante 30 minutos, protegerlo de la luz. </li><li> Después de 30 min de incubación, añadir 100 l de tampón de permeabilización en cada pocillo. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado. </li><li> Lavar las células con buffe permeabilizaciónr una vez más. sedimento se vuelve a suspender en 110 l de tampón FACS, y las suspensiones de células en un tubo de transferencia de microFACS. NOTA: La muestra está lista para medición mediante citometría de flujo 10-color. </li><li> En el caso del número de células exacta requerida, añadir 10 l de suspensión uniforme bien mezclada de fluoroesferas en cada muestra inmediatamente antes de realizar las mediciones de citometría de flujo. </li></ol>

<ol><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vast+majority+of+CLA%2B+T+cells+are+resident+in+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li>
<li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c%2BBDCA-1%2B+dendritic+cells+and+CD163%2BFXIIIA%2B+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li>
<li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li>
<li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8%2B+T%28RM%29+cells+providing+global+skin+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li>
<li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1%2B+dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li>
<li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+%28AEB071%29+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li>
<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li>
<li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li>
<li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li>
<li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li>
<li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-infiltrating+CD8%2B+T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A continuación, se presenta un protocolo para aislar eficazmente las células T residentes de la piel a partir de biopsias de piel humana. La ventaja de este protocolo es el aislamiento de un número relativamente alto de linfocitos viables, y la expresión de marcadores de superficie correspondientes. Los subconjuntos de células identificadas fueron:, células CD4 + y linfocitos T CD8 + y CD25 + Foxp3 + CD11c + DCS. Es importante destacar que la cultura ex vivo</em...

La piel, como la interfaz principal entre el cuerpo y el medio ambiente, proporciona la primera línea de defensa contra la física externa, químicas y biológicas insultos tales como heridas, la radiación ultravioleta y los microorganismos. Piel comprende dos compartimientos principales, la epidermis y la dermis, y contiene una variedad de células inmunes incluyendo las células de Langerhans, macrófagos, células dendríticas (DC), y cerca de 20 millones de células T de memoria, casi dos veces el número presente en todo el volumen de sangre 1 , 2. Una creciente cantidad de datos apoyan la noción de que la piel tiene funciones inmunológicas esenciales, tanto durante la homeostasis del tejido y en diversas condiciones patológicas. Se cree que las células inmunes residentes en la piel normal para llevar a cabo la inmunovigilancia 3 y se ha demostrado que desempeñan un papel en el desarrollo de trastornos inflamatorios tales como psoriasis 4. En la piel lesional psoriásica, tanto CD4 + y CD8 + se infiltraron las células T eran observed y se demostró que la relación de la CD4 y CD8 varía en función del estado de la enfermedad 5. Sin embargo, estas poblaciones de células son difíciles de estudiar porque las técnicas actuales permiten el aislamiento de sólo unas pocas células. Las técnicas actualmente ampliamente utilizados para el aislamiento de células T de la piel humana se combinan disociación mecánica de la piel con tratamiento enzimático. Las biopsias de piel humana son ampliamente picada y se incubaron con enzimas como la tripsina, colagenasa y / o EDTA 6-8. Teniendo en cuenta que la piel es un tejido de barrera que es altamente resistente a las fuerzas de tracción y desagregación mecánica, los métodos establecidos de aislamiento de células T producen muy pocas células, e incluso un menor número de células viables, lo que hace ex vivo de cultivo de células de estas poblaciones de células difícil y desafiante. Aquí, se presenta un método modificado para aislar los linfocitos de la piel humana psoriásica saludable y participar mediante la combinación de mechandisociación ical de la piel usando un disociador de tejido automatizado en lugar del método establecido de picado ampliamente, junto con la digestión enzimática usando colagenasa. Se observaron varios subconjuntos de células inmunes viables, incluyendo países en desarrollo y las células T después de la preparación de una suspensión de una sola célula. Es importante destacar que la expresión de los marcadores de superficie CD3, CD4 y CD8 se conservó bien. Las células preparadas de este modo, están listos para su uso en cultivos de células ex vivo o análisis de citometría de flujo. Este protocolo se ha empleado con éxito para el análisis de biopsias de piel individuales (4 mm) derivadas de la piel lesional de pacientes con psoriasis. Los resultados mostraron que las células T de la piel del paciente residente producen citoquinas inflamatorias como la más IL-17 y IFN en comparación con voluntarios sanos 9.

<table><tbody><tr><td>Punch de biopsia desechable</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Bisturíes estériles desechables</td><td>Dalhausen 1100000510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Tubo C</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Con tapa azul, utilizado como tubo de disociación.</td></tr><tr><td>gentleMACS Disociator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Disociador de tejidos automatizado. Uso del "programa spleen_01" para la disociación de la biopsia de piel.</td></tr><tr><td>Colador de células&nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 y micro; m nylon</td></tr><tr><td>Placa inferior en U de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humano Suero agrupado (HPS)</td> <td>preparado</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td>Colagenasa I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Tipo 1-A, adecuado para cultivo celular</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun 3623140</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Colorante de viabilidad fijable (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Teñir las células muertas antes de la fijación celular; diluir con PBS a 1:1.000</td></tr><tr><td>Concentrado de fijación/permeabilización</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de fijación/permeabilización</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de permeabilización (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Ratón anti-humano CD45</td><td>BD</td><td></td><td>563879 Clon: HI30; factor de dilución 1:50</td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Clon: TUK4; factor de dilución 1:50</td></tr><tr><td>PE Ratón anti-humano CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Clon: MOC-1; factor de dilución 1:50</td></tr><tr><td>ECD Ratón anti-humano CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Clon: UCHT1; factor de dilución 1:50 para la tinción superficial; factor de dilución 1:25 para la tinción intracelular.</td></tr><tr><td>PC5.5 Ratón anti-humano CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Clon: 13B8.2; factor de dilución 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Ratón anti-humano CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Clon: BU15; factor de dilución 1:50</td></tr><tr><td>APC Ratón anti-humano CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Clon: AD5-8E7; factor de dilución 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Ratón anti-humano CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Clon: B9.11; factor de dilución 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Ratón antihumano CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Clon: J3-119; factor de dilución 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Ratón antihumano CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Clon: BC96; factor de dilución 1:50</td></tr><tr><td>&nbsp; Rata PE anti-humana CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>clon: HECA-452; factor de dilución 1:</td></tr><tr><td>eFluo450 Rata anti-humana Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Clon: PCH101; tinción intracelular; factor de dilución 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Ratón anti-humano IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Clon: eBio64DEC17; tinción intracelular; factor de dilución 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Ratón anti-humano IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Clon: 4S. B3; tinción intracelular; factor de dilución 1:400</td></tr><tr><td>fluorosferas de recuento de flujo</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Cuentas de conteo, para citometría de flujo</td></tr></tbody></table>

el aislamiento de linfocitos de la piel humana para el análisis y fenotípica<em&gt; ex vivo</em&gt; cultivo celular

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

La piel humana tiene una función de barrera importante y contiene diversas células inmunes que contribuyen a la homeostasis del tejido y la protección contra los agentes patógenos. A medida que la piel es relativamente fácil acceso, que proporciona una plataforma ideal para estudiar los mecanismos de regulación inmune periférica. células residentes inmunes en sano conducta piel inmunovigilancia, pero también juegan un papel importante en el desarrollo de trastornos inflamatorios de la piel, tales como psoriasis. A pesar de ideas emergentes, nuestra comprensión de la biología subyacente de diversas enfermedades inflamatorias de la piel es aún limitada. Hay una necesidad de una buena calidad de las poblaciones (individual) de células aisladas a partir de muestras de piel biopsia. Hasta ahora, los procedimientos de aislamiento han sido seriamente obstaculizados por la falta de la obtención de un número suficiente de células viables. El aislamiento y el análisis posterior también se han visto afectados por la pérdida de marcadores de linaje de células inmunes, debido a la tensión mecánica y química causada por los procedimientos de disociación actuales para obtenersuspensión de células individuales. A continuación, describimos un método modificado para aislar las células T de la piel humana psoriásica saludable y participar mediante la combinación de disociación mecánica de la piel utilizando un disociador automatizado de tejidos y el tratamiento de colagenasa. Esta metodología conserva la expresión de la mayoría de los marcadores de linaje inmunes tales como CD4, CD8, Foxp3 y CD11c en la preparación de suspensiones de células individuales. Se muestran ejemplos de éxito de aislamiento de células T CD4 + y la posterior fenotípica y análisis funcional.

El protocolo que aquí se presenta producirá entre 2.200 ± 615 (media ± SEM, piel de voluntarios sanos) hasta 178.000 ± 760 (media ± SEM, piel lesionada de pacientes con psoriasis) linfocitos viables de la piel humana cuando se utiliza una sola biopsia de piel de 4 mm. Se identificaron diferentes tipos de células CD45 + en una sola célula suspensiones derivadas de la piel de individuos sanos, incluyendo las células T CD4 + (~ 45%), las células T CD8 + (~ 30%),...

Describimos un protocolo para aislar eficientemente las células T residentes en la piel de biopsias de piel humana. Este protocolo proporciona un número suficiente de linfocitos residentes viables en la piel humana para el análisis de citometría de flujo y el cultivo ex vivo.

El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultivo Celular

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar de manera eficiente las células T residentes en la piel a partir de biopsias de piel humana. Esto se logra primero obteniendo biopsias de piel humana mediante un punch de biopsia circular. A continuación, cada biopsia de piel se corta en cuatro piezas más pequeñas en una placa de Petri.Luego, el tejido cutáneo se disocia mecánica y enzimáticamente para obtener una suspensión de células individuales. Finalmente, los linfocitos residentes en la piel se analizan mediante citometría de flujo y se cultivan ex vivo. En última instancia, se pueden aislar y analizar cantidades suficientes de linfocitos viables residentes en la piel humana mediante inmunotinción y análisis por FACS.Este método ayudará a responder preguntas clave en dermatología e inmunología de tumores cutáneos. Por ejemplo, cómo contribuyen los linfocitos T residentes en la piel a la enfermedad. El procedimiento será demostrado por Xuehui He, un estudiante de doctorado de nuestro laboratorio.Después de preparar el medio de cultivo, según el protocolo descrito, añada dos mililitros de medio completo a tres pocillos de una placa de cultivo estéril de seis pocillos. Luego, utilice un punzón de biopsia redondo de cuatro milímetros para obtener una biopsia de piel. Colóquela en medio de cultivo completo RPMI 1640 y déjela a temperatura ambiente durante hasta cuatro horas, o bien a cuatro grados Celsius durante la noche.Mientras la biopsia se incuba, etiquete un tubo de disociación con tapón azul y agregue cinco mililitros de medio de cultivo completo. A continuación, use herramientas estériles para colocar la biopsia en el primer pozo y enjuagarla. Transfiera el tejido al segundo pozo, enjuague y luego repita el proceso una vez más en el tercer pozo.Transfiera la biopsia de piel bien enjuagada a una placa de Petri estéril y añada con pipeta 100 microlitros de medio de cultivo completo encima de la muestra. Luego, utilice un escalpelo desechable estéril de acero inoxidable para raspar cuidadosamente el tejido de grasa subcutánea. En una placa de Petri estéril nueva, corte cada biopsia de piel en cuatro trozos más pequeños.Luego transfiera las muestras al tubo de disociación preparado que contiene cinco mililitros de medio completo. Tape fuertemente el tubo y sujételo boca abajo en la manga del disociador automático de tejidos. Asegúrese de que todo el material de la muestra se encuentre en la zona del rotor.A continuación, inicie el proceso de disociación ejecutando el programa M bazo cero uno. Para disociar la biopsia a la velocidad de rotación adecuada durante 56 segundos. Después del procesamiento, retire el tubo de disociación del disociador y asegúrese de que todo el material disociado se recoja en la parte inferior del tubo.Añada 150 microlitros de colágeno tipo I A al tubo de disociación e incube la muestra en un baño de agitación a 37 grados Celsius durante 60 minutos. A continuación, añada 100 microlitros de DNasa al tubo de disociación y mezcle bien. Fije el tubo de disociación a la camisa del disociador automático de tejidos y ejecute el programa M spleen 01 para disociar la biopsia una vez más.Luego, coloque un filtro de celdas de nailon de 70 micro-molares en la parte superior de un tubo falcón de 50 mililitros y aplique los materiales de la muestra disociada sobre el filtro para eliminar los agregados celulares y los restos de tejido. Use cinco mililitros de medio completo para lavar el filtro una vez. A continuación, centrifugue el filtrado a 450 G y 20 grados Celsius, más o menos dos grados, durante 10 minutos antes de aspirar el sobrenadante.Después de repetir el paso de lavado una vez más, use 300 microlitros de medio de cultivo completo para resuspender los pellet celulares. Las suspensiones de células individuales ya están listas para su análisis posterior. Para realizar la tinción intracelular de citocinas, use PMA, ionomicina y brefeldina A para estimular las células e incube a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono durante cuatro horas antes de realizar el análisis por citometría de flujo.Para realizar la activación policlonal de linfocitos T residentes en la piel, alícuota 100 microlitros de la suspensión celular única en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Añada microesferas recubiertas con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28, citocina humana recombinante, IL-2 e IL-1B. Cubra la placa de cultivo con una tapa etiquetada y coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius, 5 por ciento de dióxido de carbono y 100 por ciento de humedad.Luego, cuando el color del medio se vuelva amarillo, cámbielo. En el día ocho se puede observar una colonia clara de células en cultivo celular. Para realizar el análisis de FACS, transfiera las células de interés a una placa de 96 pocillos con fondo en V.Centrifugar a 450 G y 20 grados Celsius, más o menos dos grados, durante dos minutos. Luego, aspirar el sobrenadante. Utilice 100 microlitros de tinte fijable viable fluorescente 780 preparado para teñir las células incubando a cuatro grados Celsius durante 30 minutos.Luego, agregue 100 microlitros de tampón FACS y centrifugue antes de aspirar el sobrenadante. A continuación, tras seleccionar los anticuerpos monoclonales contra marcadores de superficie celular de la lista proporcionada en el protocolo del texto, utilice el tampón FACS para preparar las soluciones de anticuerpos. Utilice el control isotópico de los anticuerpos junto con una muestra no teñida para definir los ajustes de las compuertas.Ahora, agregue 25 microlitros de la mezcla de anticuerpos de ratón preparada en cada pocillo y proteja de la luz. Incube a 20 grados Celsius durante 20 minutos. Añada 100 microlitros de tampón FACS, centrifugue y aspire el sobrenadante.Utilizando los tampones preparados para la tinción de foxp3 según el protocolo descrito, agregue 100 microlitros de tampón de fijación y permeabilización para resuspender los pallets. Mezcle bien e incube a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Luego, agregue 100 microlitros de tampón de permeabilización a cada pocillo y centrifugue antes de aspirar el sobrenadante.Después de lavar las células una vez más y seleccionar los anticuerpos correctos, agregue 20 microlitros de la mezcla preparada de anticuerpos monoclonales a cada pocillo y proteja de la luz antes de incubar a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Usando tampón de permeabilización, lave las células una vez más. Luego, use 110 microlitros de tampón FACS para resuspender los pellet y transfiera las suspensiones celulares a tubos FACS micro.Finalmente, si se requiere el número exacto de células, agregue 10 microlitros de una suspensión uniforme bien mezclada de flurosferas a cada muestra inmediatamente antes de realizar las mediciones por citometría de flujo. Como se muestra aquí, diferentes tipos de leucocitos positivos para CD45 fueron identificados en suspensiones de células individuales derivadas de la piel de individuos sanos, incluyendo células T positivas para CD4, células T positivas para CD8 y células dendríticas positivas para CD11c.Si bien se observaron pocas células B, células NK o macrófagos. Además, la metodología permite el análisis de células CD4 positivas, CD25 positivas y foxp3 positivas en biopsias de piel humano. Por ejemplo, mediante la tinción intracelular tras fijación y permeabilización, es posible demostrar la expresión del factor de transcripción foxp3 en células T CD25 positivas.Como se muestra aquí, para evitar la auto-fluorescencia de fondo y la población celular auto-fluorescente, se recomienda el uso del anticuerpo monoclonal anti-humano CD45 de ratón conjugado con un fluorocromo brillante violeta 421 para la selección de la población de linfocitos. Esta figura ilustra que la mayoría de las células residentes en la piel humana eran linfocitos T positivos para CD3. Para el análisis de viabilidad celular, se recomienda utilizar un colorante de viabilidad fijable para distinguir las células viables de las muertas o en proceso de muerte.Para un análisis funcional adicional, mediante una única biopsia cutánea de cuatro milímetros de piel lesional de pacientes con psoriasis, se demostró que las células T derivadas de la biopsia produjeron IL-17a e interferón gamma. Tras una estimulación de cuatro horas con PMA e ionomicina en presencia de brefeldina A. Finalmente, esta figura muestra que las células T de individuos con psoriasis tienen una capacidad mucho mayor para producir las citoquinas asociadas a la psoriasis IL-17a e interferón gamma. No olvide que trabajar con tejido humano y agentes de laboratorio puede ser peligroso.Siempre tenga en cuenta las medidas de seguridad.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La migración de los linfocitos T se produce durante la recalada de los órganos linfoides, la salida de la vasculatura, y entrar en los tejidos periféricos. Aquí se describe un protocolo que se puede utilizar para analizar la migración de los linfocitos...

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

Una forma rápida y robusta de aislar células viables de adultos epiteliales madre de la piel humana se describe. El método utiliza la digestión enzimática de la matriz de colágeno la piel, seguido por el punteo de los folículos pilosos y el aislamiento de las suspensiones de células individuales o fragmentos de tejido para el cultivo celular.

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Este protocolo describe la disociación rápida no enzimática de fragmentos de tejido humano fresco para la evaluación cualitativa y cuantitativa de células CD45+ (linfocitos/leucocitos) presentes en varios tejidos humanos normales y malignos. Además, el sobrenadante obtenido del homogeneizado de tejido primario puede recogerse y almacenarse para su posterior análisis o experimentación.

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Preparación de suspensiones de una sola célula para el Análisis cytofluorimetric de diferentes regiones de piel de ratón

El objetivo de este protocolo es aislar las células endoteliales que recubren linfáticos malformación linfática buques y prepucios humanos como quistes utilizando células activadas por fluorescencia (FACS). Cultivo celular posterior y la expansión de estas células permite un nuevo nivel de sofisticación experimental para estudios genéticos, proteómicos, funcionales y diferenciación celular.

Aislamiento de células endoteliales linfático humano por Multi-parámetro de clasificación de células activadas por fluorescencia

Este protocolo describe la digestión enzimática de la piel de ratón en un medio rico en nutrientes seguida de una separación en gradiente para aislar leucocitos.  Las células así derivadas se pueden utilizar para diversas aplicaciones posteriores. Se trata de una alternativa eficaz, económica y mejorada a las máquinas de disociación de tejidos y a los protocolos más estrictos de digestión de tejidos basados en tripsina y dispasas.

Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

Describimos aquí un protocolo para aislar células mieloides de la piel del ratón y drenar el ganglio linfático después de la inyección intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. La citometría de flujo de las células recolectadas proporciona un ensayo confiable para caracterizar la respuesta inflamatoria de la piel y los ganglios linfáticos de drenaje al parásito.

El aislamiento de las células mieloides de ratón de la piel y el drenaje de ganglios linfáticos Siguiendo intradérmica La inmunización con viva atenuada<em&gt; Plasmodium</emLos esporozoitos&gt;

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Aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana mediante la clasificación celular activada por fluorescencia

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Aprende a aislar linfocitos residentes de piel humana mediante biopsia y disociación enzimática para análisis por citometría de flujo y cultivo ex vivo. Este protocolo mejora la eficiencia en dermatología e inmunología tumoral.

El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica

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