Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

El objetivo general de este procedimiento es construir un equivalente tridimensional de piel de espesor completo, que se asemeje a la piel natural y generar heridas precisas y reproducibles en condiciones estériles utilizando un dispositivo de herida automatizado. Esto se logra incorporando primero fibroblastos dérmicos humanos primarios en un hidrogel de colágeno uno. A continuación, los queratinocitos epidérmicos humanos primarios se asientan en la parte superior del hidrogel recubierto de fibronectina.

Luego, el modelo se cultiva en condiciones sumergidas, y luego, bajo una interfaz de aire líquido, se forma un equivalente de piel tridimensional de espesor completo, compuesto por un componente dérmico y una epidermis de múltiples capas. Finalmente, se genera una herida estandarizada en un ambiente estéril. En última instancia, la tinción inmunohistoquímica y la microscopía se utilizan para evaluar la estructura histológica del equivalente cutáneo de espesor completo herido.

La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como los modelos animales, por ejemplo, es que el equivalente de piel de espesor completo está compuesto por células humanas primarias. Por lo tanto, junto con el dispositivo de herida automatizado, podemos generar heridas estandarizadas, por lo que el dispositivo de herida automatizado puede proporcionar información sobre los procesos de curación de heridas de la piel en un entorno humanizado. También se puede aplicar a nuestros sistemas, como la ingeniería de tejidos óseos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la cicatrización de heridas, como los procesos biológicos, la reparación subyacente de la piel y la diafonía celular entre el componente epidérmico y el dérmico. Para empezar, disuelva el colágeno con ácido acético al 0,1% hasta una concentración final de seis miligramos por mililitro. Prepare la solución de neutralización en gel mezclando 232,5 mililitros de dos X dmm, 7,5 mililitros de FCS, 7,5 mililitros de tres dientes molares y 2,5 mililitros de cinco miligramos por mililitro.

El sulfato de condroitina coloca insertos en los pocillos de una placa de 24 pocillos, separa los fibroblastos dérmicos humanos o HDFS y centrifuga las suspensiones celulares durante cinco minutos. A 270 G, cuente las células y centrifugue un Eloqua de 1.200.000 HDF durante cinco minutos. A 270 G, retire el snat y use cuatro mililitros de solución de neutralización de gel enfriada para resuspender cuidadosamente el HDF sin causar burbujas de aire.

A continuación, vuelva a suspender la solución con ocho mililitros de solución de colágeno. A continuación, utilice una pipeta de varios pasos y añada 500 microlitros de mezcla de células de colágeno a cada inserto. En la placa de 24 pocillos, incube los geles durante 20 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para permitir que los geles se solidifiquen.

A continuación, utilice dos mililitros de multímetro digital más un 10% de FCS por pocillo. Para sumergir los geles, incube los geles durante 24 horas. Use agua ultrapura para disolver la proteína de fibronectina humana a una concentración final de 50 microgramos por mililitro.

Después de incubar los geles equivalentes dérmicos durante 24 horas, retire el medio. Use 25 microlitros de solución de fibronectina para cubrir cada equivalente dérmico e incube los geles durante 30 minutos. Mientras tanto, resuspenda la epidermis humana, los queratinocitos o HKS con kgm dos más 5%FCS hasta una concentración final de 1 millón de células por litro de semilla, 100, 000 heeks encima de cada gel.

A continuación, incubar los geles durante 45 minutos para permitir que las células se adhieran utilizando kgm dos ready más 5%FCS sumergieron las células y continuaron la incubación. Después de incubar durante dos o tres días, reemplace el medio con 2% de FCS seguido de un reemplazo del medio sin FCS, dos o tres días después. Día siete, retire completamente el medio.

Use pinzas estériles para colocar cada inserto en un pocillo de una placa de seis pocillos. A continuación, añada 1,5 mililitros de medio de transporte aéreo por pocillo. Teniendo cuidado de no mojar la superficie del FTSC.

Cambie el medio cada dos o tres días durante 14 días adicionales. Prepare el dispositivo de herida automatizado utilizando etanol al 70% y luz ultravioleta para desinfectar el área de trabajo con pinzas estériles. Coloque los equivalentes de piel en las áreas designadas de la placa portadora de muestras del autoclave.

Coloque una placa portadora de muestras en el zócalo debajo del cabezal de perforación. Utilice el software de control para configurar los parámetros de herida de la siguiente manera. Velocidad de giro 15.000 RPM de penetración, 1,5 milímetros.

Propulsión: 100 hercios. Transfiera los parámetros de herida al dispositivo de herida automatizado. Comience el procedimiento de herida cuando esté completo.

Retire la placa portadora de la muestra del encaje y utilice pinzas estériles para transferir el FTSE herido de vuelta al inserto utilizado para el cultivo. Incubar el FTSE herido hasta la evaluación experimental. Utilice los modelos para su análisis histológico en cualquier momento.

Las HDFS y HKS aisladas se caracterizaron mediante tinción inmunohistoquímica antes de usarlas para FTSE. Las HDF son positivas para mentón, un marcador de fibroblastos HEK primario que expresa en gran medida la proteína de diferenciación temprana CITOQUERATINA 14, pero casi ninguna proteína de diferenciación tardía de queratinocitos CITOQUERATINA 10. Los FTSE se cultivaron durante siete días en condiciones de medio sumergido, seguidos de 14 días en la interfaz aire-líquido.

Durante este proceso, la FTSC contrae significativamente dentro de los 21 días. Los HEK están proliferando cambiando el nivel medio de tal manera que la superficie de los modelos está expuesta al aire. Y al aumentar la concentración de calcio, se estimula a los HKS para que se diferencien en una epidermis multicelular que está compuesta por varias capas celulares vitales de queratinocitos.

En diferentes estados de diferenciación D y córnea de aurícula. Al comparar la tinción de hematina y eosina del FTSE con la piel humana nativa, se hace obvio que el FTSE imita la arquitectura histológica de la piel. El HDF en el hidrogel de colágeno uno se puede teñir con anticuerpos primarios contra la vimentina.

Además, los queratinocitos forman una capa epidérmica compuesta por células positivas para citoqueratina 14 y el marcador de diferenciación tardía. La citoqueratina 10 se expresa en las capas superbasales. Además, el cornio St.Stratum es positivo para RIN después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la dermatología exploraran la cicatrización de heridas cutáneas y una configuración in vitro estandarizada que imita de cerca la piel humana.