Visualización de Streptococcus pneumoniae Dentro cardíacos microlesiones y la remodelación cardiaca posterior

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar un protocolo reproducible para la formación de microlesiones cardíacas ESMO en el corazón de ratones infectados. Esto se logra infectando ratones con ESMO y permitiendo el desarrollo de bacteriemia, dando así a las bacterias acceso a la vasculatura cardíaca donde pueden invadir el miocardio y formar lesiones microscópicas. A continuación, los corazones se incrustan en parafina, se incrustan y se tiñen de forma convencional o se fijan en un compuesto OCT para la tinción inmunofluorescente.

La evaluación de las secciones teñidas puede mostrar micro lesiones cardíacas distribuidas aleatoriamente a través de las deposiciones de colágeno del miocardio y secciones de corazón convalecientes y cápsulas neumocócicas dentro de la micro lesión cardíaca Demostrando el procedimiento. ¿Armand Brown es un estudiante de posgrado en mi laboratorio? Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre los efectos dañinos cardíacos de la neumonía S durante la enfermedad neumocócica invasiva en ratones.

También se puede aplicar a muestras cardíacas de otros sistemas, como primates no humanos o humanos. Comience con el crecimiento de la cepa Tiger cuatro del serotipo ESMO en caldo Todd Hewitt hasta una densidad óptica de 0,5 a 620 nanómetros. Cuando tenga la densidad correcta, pegue el cultivo a 3, 500 G durante 10 minutos.

A continuación, retire el sobrenadante utilizando una línea de vacío y vuelva a suspender las bacterias con PBS estéril a 10.000 unidades formadoras de colonias por mililitro. Ahora anestesiados ratones con válvula C de 10 a 12 semanas de edad y confirman su estado anestesiado con un suave pellizco en la punta del pie con un par de pinzas romas, jeringa de loto con la suspensión bacteriana y colocan una aguja de calibre 27 a 30. A continuación, agarre un ratón anestesiado por el pescuezo con una mano mientras inyecta intraperitonealmente 100 microlitros de suspensión con la otra mano, vuelva a colocar a cada ratón en su jaula.

Por lo general, los ratones se despiertan de 30 a 40 segundos después de la inyección. Obtener la dosis correcta de neumonía por S es fundamental, o los ratones pueden recuperarse de la infección o llegan a la enfermedad neumocócica invasiva demasiado rápido para que se desarrollen lesiones. Dado que cada cepa bacteriana tiene diferentes niveles de cristalino en el oído, puede ser necesario ensayo y error para identificar la dosis correcta.

Permita que la infección continúe durante al menos 24 horas hasta una etapa temprana o hasta 30 horas para una infección en etapa avanzada. Más tarde, eutanasia a cada ratón infectado. Primero, toma una muestra de sangre, desinfecta la cola con un hisopo con alcohol y corta una sección de dos a tres milímetros.

Recoge dos microlitros de sangre del sitio de la corte. Diluir en serie la sangre diez veces en PBS que contiene heparina de sodio a una unidad por mililitro. Coloque cinco niveles de diluciones en placas de agar sangre de soja tríptico y colévelas durante la noche.

Al día siguiente se realizan los recuentos de colonias. Proceda con la cosecha del corazón como se describe en la siguiente sección. Alternativamente, 30 horas después de la infección.

Intento de rescatar al ratón mediante la administración de ampicilina interperitoneal en 100 microlitros de solución salina. Continúe suministrando ampicilina cada 12 horas durante 36 horas y recoja corazones en los puntos de tiempo deseados. Primero, cosecha el corazón.

Inmovilizar al ratón sacrificado en posición supina sobre una plataforma quirúrgica y rociar el pecho con etanol al 70% y secar. Con unas tijeras quirúrgicas y fórceps, abra la cavidad torácica. Retire la caja torácica y atraviese el diafragma para exponer el corazón y los pulmones.

Luego, corte los vasos sanguíneos conectados al corazón y use fórceps para extirpar suavemente el corazón sin que quede moretones. Enjuague el corazón con PBS y colóquelo en un casete de recolección de muestras de tejido para la sección coronal. A continuación, transfiera los casetes a una solución de formol tamponada al 10% y, al día siguiente, envíelo a la inclusión en parafina.

En las primeras etapas, las lesiones cardíacas se pueden identificar por su cambio en la apariencia de color y, en algunos casos, por la presencia de células inmunitarias. En las lesiones avanzadas, las células inmunitarias estarán ausentes y serán grandes. En su lugar se encuentran lesiones similares a las de VA.

Usando una sección cardíaca de cinco micras en portaobjetos de vidrio cargados positivamente, primero congele las secciones, luego descongélelas y déjelas secar al aire. Fije los portaobjetos en formina tamponada neutra al 10% durante 10 minutos a 25 grados centígrados. A continuación, retire el fijador con tres lavados y PBS durante cinco minutos por lavado.

A continuación, permeable el tejido con 0,2%tritton X 100 en PBS durante 15 minutos. Retire el detergente con tres lavados más en PBS puro. A continuación, bloquee el tejido con 10%cubrir el suero en PBS durante una hora después de un enjuague en PBS, cubrir la sección con antisuero durante dos horas a 37 grados centígrados.

Debido a que el tejido cardíaco absorbe fácilmente la tinción inmunofluorescente XI, lo que conduce a niveles de fondo altos, es probable que sea necesario optimizar la concentración en el tiempo de incubación para diferentes tipos de anticuerpos. Dos horas después, lave el suero antis con PBS. A continuación, sustituya la solución por un anticuerpo secundario y deje que los portaobjetos se incuben a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Ahora aplique DPI a cinco miligramos por mililitro y lave los portaobjetos con PBS.

Por último, monte los portaobjetos en el suelo, guárdelos y visualícelos con microscopía confocal. Comience por retirar la parafina e hidratar las secciones de tejido. Use lavados con xileno seguidos de una serie gradual de lavados con alcohol.

A continuación, bañar las secciones con ácido fosfométrico al 0,2 % durante cinco minutos, seguido de un enjuague con agua de cinco minutos y enjuagar la siguiente mancha con ácido rojo y rico al 0,1 % durante dos horas. A continuación, lavar las secciones con ácido clorhídrico normal 0,01 durante tres minutos y enjuagarlas con etanol al 70% durante un minuto. Ahora deshidrate las secciones invirtiendo la serie de baños de alcohol graduados, seguido de lavados con xileno utilizando un soporte de microscopía óptica y evalúe los portaobjetos.

Los ratones desarrollaron una enfermedad neumocócica invasiva después de un desafío con el tigre. Se observaron microlesiones cardíacas de cuatro cepas en los ventrículos y se observó un aumento en el tamaño y número de lesiones entre 24 y 30 horas después de la infección para verificar que efectivamente había neumonía dentro de las lesiones. Las secciones se tiñeron para el polisacárido capsular del serotipo cuatro producido por Tiger 4.

Esto confirmó la presencia de agregados densos y muy compactos dentro de los sitios de las microlesiones. Se realizó una tinción roja grave de piro en secciones cardíacas de ratones que habían sido rescatados con ampicilina y controles no infectados. En rescates.

Hubo un aumento dramático en la presencia e intensidad de la tinción con bandas que fluían desde lo que parecen ser sitios de lesiones anteriores en los ventrículos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar infectar a los ratones con un uso suficiente de neumonía por S para permitir que la infección continúe durante al menos 28 a 30 horas para que la bacteriemia y las microlesiones cardíacas tengan tiempo suficiente para formarse.