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El objetivo general del siguiente experimento es demostrar un protocolo reproducible para la formación de microlesiones cardíacas por ESMO dentro del corazón de ratones infectados. Esto se logra infectando ratones con ESMO y permitiendo el desarrollo de bacteriemia, lo que permite a las bacterias acceder a la vasculatura cardíaca, invadir el miocardio y formar lesiones microscópicas. Luego, los corazones se incluyen en parafina y se tiñen de forma convencional, o se fijan en compuesto OCT para tinción inmunofluorescente.

La evaluación de las secciones teñidas puede mostrar microlesiones cardíacas distribuidas aleatoriamente a través del miocardio, depósitos de colágeno y secciones de miocardio en fase de convalecencia, así como cápsulas de pneumococo dentro de la microlesión cardíaca, demostrando el procedimiento. ¿Es Armand Brown un estudiante de posgrado en mi laboratorio? Aunque este método puede proporcionar información sobre los efectos cardiotóxicos de S. pneumoniae durante la enfermedad pneumocócica invasiva en ratones.

También puede aplicarse a muestras cardíacas de otros sistemas, como primates no humanos o humanos. Comience cultivando la cepa del serotipo cuatro ESMO Tiger cuatro en caldo Todd Hewitt hasta una densidad óptica de 0,5 a 620 nanómetros. Cuando alcance la densidad adecuada, centrifugue el cultivo a 3.500 ×g durante 10 minutos.

Luego, elimine el sobrenadante utilizando una línea de vacío y re suspenda las bacterias con PBS estéril a 10.000 unidades formadoras de colonias por mililitro. Ahora, anestesie ratones valve C de 10 a 12 semanas de edad y confirme su estado anestesiado mediante un suave pellizco en el dedo del pie con un par de pinzas romas, cargue la jeringa con la suspensión bacteriana y coloque una aguja de calibre 27 a 30. A continuación, tome un ratón anestesiado por la nuca con una mano mientras inyecta intraperitonealmente 100 microlitros de la suspensión utilizando la otra mano, y coloque cada ratón nuevamente en su jaula.

Los ratones suelen despertar entre 30 y 40 segundos después de la inyección. Es fundamental administrar la dosis correcta de S pneumoniae, ya que de lo contrario los ratones pueden recuperarse de la infección o desarrollar enfermedad neumocócica invasiva demasiado rápido para que se formen lesiones. Dado que cada cepa bacteriana presenta diferentes niveles de virulencia, puede ser necesario realizar varios intentos para identificar la dosis adecuada.

Deje que la infección progrese durante al menos 24 horas hasta una etapa temprana o durante 30 horas para una infección avanzada. Posteriormente, eutanasiar cada ratón infectado. Primero, tome una muestra de sangre, desinfecte la cola con un hisopo de alcohol y corte una sección de dos a tres milímetros.

Recolecte dos microlitros de sangre del sitio de corte. Diluya la sangre seriada y diez veces en PBS que contenga heparina sódica a una unidad por mililitro. Inocule cinco niveles de diluciones en placas de agar sangre de soya tripticasa, e incúbelas durante la noche.

Al día siguiente, tome los recuentos de colonias. Continúe con la recolección del corazón según se describe en la siguiente sección. Alternativamente, 30 horas postinfección.

Intente rescatar al ratón administrando ampicilina por vía intraperitoneal en 100 microlitros de solución salina. Continúe administrando ampicilina cada 12 horas durante 36 horas y recolecte los corazones en los puntos de tiempo deseados. Primero, extraiga el corazón.

Inmovilice el ratón sacrificado en posición supina sobre una plataforma quirúrgica y rocíe el tórax con etanol al 70 %, luego seque con palmaditas. Con tijeras y pinzas quirúrgicas, abra la cavidad torácica. Retire la caja torácica y seccione el diafragma para exponer el corazón y los pulmones.

Luego, corte los vasos sanguíneos conectados al corazón y use pinzas para extirpar suavemente el corazón sin provocar contusiones. Enjuague el corazón con PBS y colóquelo en una cassette para muestras de tejido destinada al corte coronal. A continuación, transfiera las cassettes a una solución de formalina tamponada al 10%, y al día siguiente, envíelas para inclusión en parafina.

En las primeras etapas, las lesiones cardíacas pueden identificarse por el cambio en su apariencia de color y, en algunos casos, por la presencia de células inmunitarias. En lesiones avanzadas, las células inmunitarias estarán ausentes y se encontrarán lesiones similares a VA de gran tamaño en su lugar.

Utilizando una sección cardíaca de cinco micrones sobre portaobjetos de vidrio con carga positiva, primero congele las secciones, luego désielas y déjelas secar al aire. Fije los portaobjetos en formalina tamponada al 10 % neutra durante 10 minutos a 25 grados Celsius. A continuación, elimine el fijador con tres lavados con PBS durante cinco minutos por cada lavado.

Permeabilice el tejido con Tritón X-100 al 0,2 % en PBS durante 15 minutos. Elimine el detergente con tres lavados adicionales en PBS puro. A continuación, bloquee el tejido con suero de caballo al 10 % en PBS durante una hora tras un enjuague en PBS, y cubra la sección con antisuero durante dos horas a 37 grados Celsius.

Trate los controles negativos con antisuero de conejo no inmunizado. Debido a que el tejido cardíaco absorbe fácilmente la tinción inmunofluorescente XI, lo que provoca niveles elevados de fondo, es probable que sea necesario optimizar la concentración y el tiempo de incubación para diferentes tipos de anticuerpos. Dos horas después, lave el antisuero con PBS. A continuación, reemplace la solución con un anticuerpo secundario y deje que las laminillas incuben a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Ahora aplique DPI a cinco miligramos por mililitro y lave las laminillas con PBS.

Finalmente, monte las láminas en bálsamo, guárdelas y obtenga imágenes mediante microscopía confocal. Comience por eliminar la parafina e hidratar las secciones de tejido. Utilice lavados con xilol seguidos por una serie graduada de lavados con alcohol.

Luego, sumerja los cortes en ácido fosfomolíbdico al 0,2 % durante cinco minutos, seguido de un enjuague con agua durante cinco minutos. A continuación, tiña con rojo de congo al 0,1 % y ácido acético durante dos horas. Después, lave los cortes con ácido clorhídrico 0,01 N durante tres minutos y enjuáguelos con etanol al 70 % durante un minuto. Ahora, deshidrate los cortes invirtiendo la serie de baños de alcohol graduado, seguido de lavados con xileno, monte para microscopía de luz y evalúe las laminillas.

Los ratones desarrollaron una enfermedad neumocócica invasiva tras una exposición al tigre. Se observaron microlesiones cardíacas de cuatro cepas en los ventrículos, y se notó un aumento en el tamaño y número de lesiones entre las 24 y las 30 horas posteriores a la infección para verificar que S. pneumoniae efectivamente se encontraba dentro de las lesiones. Las secciones fueron teñidas para detectar el polisacárido capsular del serotipo cuatro producido por Tiger cuatro.

Esto confirmó la presencia de agregados densos y estrechamente empaquetados dentro de los sitios de microlesión. Se realizó la tinción con piro rojo serio en secciones cardíacas de ratones que habían sido rescatados con ampicilina y controles no infectados. En los rescates.

Hubo un aumento dramático en la presencia e intensidad de la tinción con bandas que se extendían desde lo que parecen ser sitios anteriores de lesiones en los ventrículos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar infectar a los ratones con una cantidad suficiente de S pneumoniae para permitir que la infección progrese durante al menos 28 a 30 horas, de modo que la bacteriemia y las microlesiones cardíacas tengan tiempo suficiente para formarse.