Name: Visualización de Streptococcus pneumoniae Dentro cardíacos microlesiones y la remodelación cardiaca posterior (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende a visualizar microlesiones cardíacas causadas por Streptococcus pneumoniae en ratones mediante técnicas de tinción convencional e inmunofluorescencia. Este protocolo permite evaluar la remodelación cardíaca y comprender los efectos dañinos de la neumonía invasora.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención 13IRG14560023 de la Asociación Americana del Corazón y los NIH AI078972 y HL108054 a CJO. El apoyo a AOB provino del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales de los NIH, el ULTR001120 de los NIH y el F31 A110417701.

NOTA: Todos los experimentos con ratones fueron revisados ​​y aprobados por los Comités Use y Cuidado de Animales Institucional de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio (protocolo # 13032-34-01C). Cuidado de los animales y los protocolos experimentales se adhirieron a la Ley Pública 89-544 (Ley de Protección de los Animales) y sus modificaciones, directrices servicios de salud pública, y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos). 1. Infección <ol><li> Obtener ratones BALB / c de ambos sexos entre las edades de 10 a 12 semanas de edad. NOTA: S. pneumoniae serotipo 4 cepa TIGR4 es un aislado clínico virulento que ha sido secuenciado 16. </li><li> Crecer TIGR4 en caldo de Todd-Hewitt a 37 ° C en 5% de CO 2 hasta alcanzar una densidad óptica (OD) 620 de 0,5 (correspondiente a 1,0 x 10 8 unidades formadoras de colonias [CFU / ml)]. Sedimentar la cultura neumocócica por centrifugación durante 10 min a 3, 500 xg y eliminar el sobrenadante usando una línea de vacío. Suspender y bacterias con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) se diluye hasta una concentración final de 1,0 x 10 4 CFU / ml. </li><li> El uso de una cámara de inducción, anestesiar a los ratones con 2,5% de isoflurano vaporizado en oxígeno. Confirme estado anestesiado por pizca dedo del pie suave con pinzas romas. <ol><li> Sosteniendo el ratón anestesiado por su pescuezo y en posición vertical con una mano, se inyectan cada ratón por vía intraperitoneal (ip) con 100 l de la S. pneumoniae suspensión con una jeringa con una aguja de calibre 27-30 (correspondiente a una dosis de prueba de 1,0 x 10 3 CFU). Coloque la parte posterior del ratón en su jaula. Los ratones normalmente despiertan 30-40 segundos después de la inyección. </li></ol></li><li> Deje que la infección de proceder por lo menos 24 (anticipada) o 30 (avanzado) hr. <ol><li> La eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2. Realizar dislocación cervical para garantizar ratón ha fallecido. La eutanasia se ve confirmado por la eliminacióndel corazón en el paso 1.6. </li></ol></li><li> Desinfectar la cola con un algodón con alcohol y cortar una sección de 2.3 mm. Recoger 2 l de sangre en serie y diluir la sangre de 10 veces en PBS que contenía heparina sódica 1 U / ml cinco veces. Placa de diluciones en serie en una placa de agar sangre de soja tríptico y se incuba durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2. El siguiente extrapolar días de la colonia cuenta el nivel de bacteriemia. </li><li> Inmovilizar el ratón en una posición supina sobre una plataforma quirúrgica. Rocíe el pecho con etanol al 70% y secar. Con unas tijeras quirúrgicas y pinzas abren la cavidad torácica, retire la caja torácica, y seccionar el diafragma para exponer el corazón y los pulmones. Con unas tijeras cortan los vasos sanguíneos conectados al corazón y los impuestos especiales suavemente el corazón con cuidado para evitar hematomas con fórceps. </li><li> Enjuague el corazón con PBS y luego se coloca en casetes de recogida de muestras de tejido tal que las secciones coronales se obtendrían durante el corte del tejido. Para la inclusión en parafina, place los cassettes en 10% de solución amortiguadora de formalina y al día siguiente para enviar inclusión en parafina. <ol><li> Alternativamente congelación ultrarrápida usando Compuesto OCT dentro de un criomolde que se ha colocado en hielo seco. </li></ol></li></ol> 2. La visualización de las lesiones cardiacas y neumococos dentro de las lesiones <ol><li> Reduzca secciones cardíacos incluidos en parafina de tal manera que las 4 cámaras del corazón son visibles en cada sección de tejido. Cortar las diapositivas en espesor de 5 micras. </li><li> Desparafinar y mancha diapositivas con hematoxilina y eosina (H &amp; E) utilizando métodos estándar 17. </li><li> Ver H &amp; E manchadas secciones cardiacas utilizando un microscopio de luz a baja (100X, 200X) y alta (aceite de inmersión: 400X, 1.000X) aumentos. Caracterizar corazones la presencia de microlesiones en el miocardio. En este caso, la adquisición de H &amp; E imágenes utilizando un microscopio Zeiss Axioskop 2 equipado con un 100X 1.3 numérica objetivo abertura Plan-Neofluar. NOTA: en las primeras etapas l cardiacaesions son discriminados por su apariencia de color diferencial y en algunos casos la presencia de células inmunes (monocitos y granulocitos) lo que parecen ser los monocitos. En lesiones avanzadas, en particular los que se observan en 30 h, las células inmunes son lesiones vacuolas como ausentes y grandes se observan en su lugar. Es importante observar que mientras que puede ocurrir la afluencia de células inmune durante las primeras etapas del desarrollo de la lesión cardiaca no parece ser un requisito. </li></ol> 3. inmunofluorescencia microscopía para neumococos dentro microlesiones <ol><li> Sección corazón en criomoldes con micrótomo hasta un espesor de 5 micras y secciones lugar en portaobjetos de vidrio cargados positivamente. Permitir secciones cardiacas congelados se descongelen y secar al aire. Fijar secciones durante 10 min en 10% de formalina tamponada neutra (pH 6.8 a 7.2 a 25 ° C). </li><li> Lavado de los portaobjetos (3x) en PBS durante 5 min, permeabilizar durante 15 min en 0,2% de Triton X-100 en PBS, luego se lava de nuevo en PBS. </li><li> Secti tejido Bloquear<html> en el portaobjetos con 10% de suero de cabra en PBS durante 1 hora. </li><li> Se lavan los portas con PBS, tapa e incubar las secciones cardiacas con conejo anti-serotipo 4 neumococo antisuero a escala 1: 1000 en PBS con 10% de suero de cabra durante 2 horas a 37 ° C. NOTA: Para los controles negativos investigadores deben utilizar antisuero de conejo ingenuo </li><li> Después de lavar con PBS, la cubierta e incubar las secciones con 10% de suero de cabra-PBS con cabra anti-conejo FITC anticuerpo conjugado a 1: 2000 durante 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Siguiendo las instrucciones del fabricante, utilice DAPI (4 &#39;, 6- diamidino-2-fenilindol) a 5 mg / ml para la visualización de los núcleos eucariotas. Lave y montar las secciones de tejido con Fluorsave. </li><li> Adquirir imágenes fluorescentes utilizando un sistema de microscopía confocal, tanto en baja y alta magnificación. Ajuste la apertura numérica en consecuencia para obtener resultados óptimos. Aquí, adquirir imágenes fluorescentes utilizando un sistema confocal con un objetivo 60X apertura numérica 1,42. </li></ol>&quot;&gt; 4. Antibiótico Rescate de ratones séptico <ol><li> Comience con ratones infectados ip con 1,0 x 10 3 UFC de TIGR4 como se indica anteriormente en el paso 1. </li><li> A partir de las 30 horas después de la infección, administrar farmacéutica ampicilina grado ip (80 mg / kg de peso corporal) en 100 l de solución salina cada 12 horas durante 36 horas. Recoge los corazones en el punto de tiempo deseado y el proceso como se describe en el paso 1.6 para la inclusión en parafina y el tejido, el corte. </li></ol> 5. El colágeno Detección Deposición <ol><li> El uso de xileno y lavados de alcohol graduadas con agua, Desparafinar y tejidos hidrato secciones desionizada utilizando métodos estándar 17. Tratar secciones con ácido acuoso 0,2% fosfomolıbdico durante 5 minutos y enjuagar con agua desionizada durante 5 min. </li><li> Secciones mancha con 0,1% rojo sirio en ácido pícrico durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las secciones en ácido clorhídrico 0,01 N durante 3 min y enjuagar el uso de etanol al 70% durante 1 min. </li><li> DeshidrataciónTA El secciones usando el idéntico pero el orden de lavados al descrito en 5.1 revertir, deshidratar secciones cardiacas en el aumento y la clasificación concentraciones de etanol y después xileno. </li><li> Secciones de tejido monte con una solución de montaje para la evaluación microscópica. </li><li> Para identificar las regiones del depósito de colágeno, examinar secciones de tejido teñido de áreas de tinción de lectura profunda en condiciones de baja y alta magnificación utilizando un microscopio de luz. Cualquier área dentro de los ventrículos del corazón, que es de color rojo es un área donde el colágeno se ha depositado. Áreas sin esta mancha roja son sitios de tejido sano que carecen de la deposición de colágeno. Aquí, adquirir Picro Sirius Red imágenes teñidas utilizando un microscopio equipado con un objetivo 20X apertura numérica 0.5. NOTA: Las manchas rojas atrio en los tejidos sanos. </li></ol>

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<li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflicto de intereses en este estudio.

En este informe, un método altamente reproducible para inducir S. pneumoniae mediada microlesiones cardíacas en ratones durante IPD y las técnicas para su visualización se demuestra. Los ratones se infectan con una dosis de bacterias que supera el umbral del sistema inmune para el despacho, dando lugar a bacteremia de alto grado, similar a la que ocurre durante la sepsis humana, y conduce a la translocación bacteriana eventual en el miocardio. Por razones aún desconocidas, S. pneumoniae en el corazón e...

La hospitalización de adultos para la neumonía adquirida en la comunidad (NAC) conlleva un riesgo documentado de eventos cardiacos adversos que contribuyen a la mortalidad 1-4. En un estudio reciente de Corrales-Medina et al. Se encontraron complicaciones cardíacas que se asocia con y / o responsable del 27% de las muertes por neumonía asociada a 3. Streptococcus pneumoniae (neumococo), la causa más común de la PAC y la sepsis 5, se ha asociado directamente con eventos cardíacos adversos en hasta el 19% de los pacientes adultos ingresados ​​6. Eventos cardíacos adversos asociados con la neumonía son la insuficiencia nuevo o empeorado cardíaca congestiva, arritmias, infarto de miocardio y en orden decreciente de frecuencia 6. En un reciente artículo de PLoS Pathogens por Brown et al., S. pneumoniae se encontró que era capaz de traslocación a través del endotelio vascular cardíaco, la entrada en el myocardium, y la formación de lesiones microscópicas no purulentas discretas (microlesiones) llenos de bacterias en los ventrículos durante la enfermedad neumocócica invasiva (ENI) 7. Se observó evidencia de formación microlesión cardiaca en muestras cardíacas de los primates no humanos y personas que habían sucumbido a la infección neumocócica. Asimismo, los ratones infectados experimentalmente desarrollaron de manera reproducible microlesiones cardíacas. En los ratones, el tamaño y el número microlesión se correlacionó positivamente con la duración y la gravedad de la bacteriemia, los niveles de troponina cardíaca en el suero, y la electrofisiología cardiaca aberrante. La translocación bacteriana en el corazón se encontró que se produzca a través de los mismos mecanismos responsables de la translocación del neumococo través de la barrera sangre-cerebro y el desarrollo de la meningitis neumocócica, es decir, la proteína de unión a colina-A mediada por invasión de células endoteliales vasculares en un receptor de laminina y de plaquetas receptor del factor de -activating manera dependiente de 8. Microlesformación de iones también requiere la neumolisina neumocócica toxina formadora de poros que se encontró para matar a los cardiomiocitos 7. Microlesiones cardíacos neumocócicas son distintos del purulenta de partes blandas y abscesos cardíacas que son causadas por otras bacterias Gram-positivas, incluido el Staphylococcus aureus. Estos se caracterizan por una sola focos de bacterias rodeadas por los neutrófilos y 9,10 deposición de fibrina. Microlesiones formado por S. pneumoniae son de menor tamaño, distribuidos a lo largo de un corazón afectado, y carecen de infiltrados de células inmunes. Durante las primeras etapas de la infección, microlesiones causadas por S. pneumoniae aparecen como áreas de tejido dañado o inflamado evocador de las muestras patológicas de la cardiomiopatía. Algunos monocitos se pueden observar durante este tiempo, sin embargo, su presencia es de corta duración y las lesiones se convierten rápidamente necrótico en apariencia y llena de bacterias, mientras que al mismo tiempo continuar a GRujo de tamaño hasta la muerte del animal o la intervención antimicrobiana. Es importante destacar que, en el plazo de 3 días de la intervención a los antibióticos, profusa infiltración de células inmunes se observa en el antiguo sitio de la lesión y esto va acompañado de robusto depósito de colágeno. La remodelación cardiaca similar se ha reportado que ocurre después de un infarto junto con consecuencias duraderas sobre la función cardíaca 11-15. Por lo tanto, microlesiones son una posible explicación para los eventos cardíacos adversos que ocurren durante el IPD y, posiblemente, el aumento de la incidencia de la mortalidad relacionada con el corazón en personas convalecientes que han sobrevivido al episodio de la enfermedad. En este documento, se proporciona la instrucción en el modelo experimental de ratón de IPD y formación de la lesión cardiaca y la visualización de microlesiones cardíacos en las primeras y últimas etapas de la infección. El protocolo para la detección de la deposición de colágeno en los animales que han sido salvados por la intervención antimicrobiana se demuestra. El objetivo de este artículo es facilitar la investigación de otros investigadores sobre este importante y novedoso patología neumocócica.

<table><tbody><tr><td>Caldo Todd-Hewitt&nbsp;</td><td>Compuesto</td><td>Neogen 7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T&nbsp;</td><td>Tissue-Tek (Sakura Finetek)&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>anti-serotipo 4 antisuero antineumococo&nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo conjugado FITC anti-conejo de cabra &nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>ácido fosfomolíbdico 0.2%&nbsp;</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Rojo Sirio en ácido pícrico &nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico 0.01 N&nbsp;</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de tachuela</td><td>de tejido Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Ungüento veterinario Paralube</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción de hematoxilina y eosina</td><td>sin especificar&nbsp;</td><td></td><td>estándar</td></tr></tbody></table>

visualización de<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; dentro cardíacos microlesiones y la remodelación cardiaca posterior

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Durante bacteriemia Streptococcus pneumoniae puede trasladar a través del endotelio vascular en el miocardio y formar bacterias llenos discretas lesiones microscópicas (microlesiones) que son notable debido a la ausencia de la infiltración de células inmunes. Debido a su liberación de productos cardiotóxicos, S. pneumoniae dentro microlesiones se cree que contribuyen a la insuficiencia cardíaca que se observa con frecuencia durante la enfermedad neumocócica invasiva fulminante en adultos. En esto se demuestra un protocolo para la infección experimental de ratón que lleva a la formación reproducible microlesión cardíaco dentro de 30 horas. La instrucción es proporcionada en la identificación microlesión en hematoxilina y eosina secciones de corazón de colores y las distinciones morfológicas entre microlesiones principios y finales se destacan. La instrucción es proporcionada en un protocolo para la verificación de S. pneumoniae dentro microlesiones utilizando anticuerpos contra el polisacárido capsular de neumococo ymicroscopía de inmunofluorescencia. Por último, se proporciona un protocolo de intervención antibiótico que rescata los ratones infectados y para la detección y evaluación de la formación de cicatrices en los corazones de los ratones convalecientes. Juntos, estos protocolos facilitar la investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la invasión cardiaca neumocócica, muerte de los cardiomiocitos, la remodelación cardiaca como resultado de la exposición a S. pneumoniae, y la respuesta inmune a los neumococos en el corazón.

Visualización de microlesiones por H &amp; E Se observaron microlesiones cardíacos en los ventrículos del H &amp; E manchadas secciones cardíacas de ratones con IPD tras su desafío ip con TIGR4. La Figura 1 muestra el aumento en el tamaño de estas lesiones entre 24 y 30 horas después de la infección (hpi), con un mayor número de hematoxilina teñidas (es decir, púrpura-azul) neumococos visible dentro de la lesión. Microlesiones se caracterizaron por una morf...

Streptococcus pneumoniae forma lesiones microscópicas discretas no purulentas en el corazón. Se describe el protocolo para un modelo murino de formación de microlesiones cardíacas. Se proporciona instrucción sobre la visualización de microlesiones mediante microscopía, la discriminación entre microlesiones tempranas y tardías, y los métodos para detectar la remodelación cardíaca en el corazón de los animales convalecientes.

Visualización de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro cardíacos microlesiones y la remodelación cardiaca posterior

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar un protocolo reproducible para la formación de microlesiones cardíacas por ESMO dentro del corazón de ratones infectados. Esto se logra infectando ratones con ESMO y permitiendo el desarrollo de bacteriemia, lo que permite a las bacterias acceder a la vasculatura cardíaca, invadir el miocardio y formar lesiones microscópicas. Luego, los corazones se incluyen en parafina y se tiñen de forma convencional, o se fijan en compuesto OCT para tinción inmunofluorescente.La evaluación de las secciones teñidas puede mostrar microlesiones cardíacas distribuidas aleatoriamente a través del miocardio, depósitos de colágeno y secciones de miocardio en fase de convalecencia, así como cápsulas de pneumococo dentro de la microlesión cardíaca, demostrando el procedimiento. ¿Es Armand Brown un estudiante de posgrado en mi laboratorio? Aunque este método puede proporcionar información sobre los efectos cardiotóxicos de S. pneumoniae durante la enfermedad pneumocócica invasiva en ratones.También puede aplicarse a muestras cardíacas de otros sistemas, como primates no humanos o humanos. Comience cultivando la cepa del serotipo cuatro ESMO Tiger cuatro en caldo Todd Hewitt hasta una densidad óptica de 0,5 a 620 nanómetros. Cuando alcance la densidad adecuada, centrifugue el cultivo a 3.500 ×g durante 10 minutos.Luego, elimine el sobrenadante utilizando una línea de vacío y re suspenda las bacterias con PBS estéril a 10.000 unidades formadoras de colonias por mililitro. Ahora, anestesie ratones valve C de 10 a 12 semanas de edad y confirme su estado anestesiado mediante un suave pellizco en el dedo del pie con un par de pinzas romas, cargue la jeringa con la suspensión bacteriana y coloque una aguja de calibre 27 a 30. A continuación, tome un ratón anestesiado por la nuca con una mano mientras inyecta intraperitonealmente 100 microlitros de la suspensión utilizando la otra mano, y coloque cada ratón nuevamente en su jaula.Los ratones suelen despertar entre 30 y 40 segundos después de la inyección. Es fundamental administrar la dosis correcta de S pneumoniae, ya que de lo contrario los ratones pueden recuperarse de la infección o desarrollar enfermedad neumocócica invasiva demasiado rápido para que se formen lesiones. Dado que cada cepa bacteriana presenta diferentes niveles de virulencia, puede ser necesario realizar varios intentos para identificar la dosis adecuada.Deje que la infección progrese durante al menos 24 horas hasta una etapa temprana o durante 30 horas para una infección avanzada. Posteriormente, eutanasiar cada ratón infectado. Primero, tome una muestra de sangre, desinfecte la cola con un hisopo de alcohol y corte una sección de dos a tres milímetros.Recolecte dos microlitros de sangre del sitio de corte. Diluya la sangre seriada y diez veces en PBS que contenga heparina sódica a una unidad por mililitro. Inocule cinco niveles de diluciones en placas de agar sangre de soya tripticasa, e incúbelas durante la noche.Al día siguiente, tome los recuentos de colonias. Continúe con la recolección del corazón según se describe en la siguiente sección. Alternativamente, 30 horas postinfección.Intente rescatar al ratón administrando ampicilina por vía intraperitoneal en 100 microlitros de solución salina. Continúe administrando ampicilina cada 12 horas durante 36 horas y recolecte los corazones en los puntos de tiempo deseados. Primero, extraiga el corazón.Inmovilice el ratón sacrificado en posición supina sobre una plataforma quirúrgica y rocíe el tórax con etanol al 70 %, luego seque con palmaditas. Con tijeras y pinzas quirúrgicas, abra la cavidad torácica. Retire la caja torácica y seccione el diafragma para exponer el corazón y los pulmones.Luego, corte los vasos sanguíneos conectados al corazón y use pinzas para extirpar suavemente el corazón sin provocar contusiones. Enjuague el corazón con PBS y colóquelo en una cassette para muestras de tejido destinada al corte coronal. A continuación, transfiera las cassettes a una solución de formalina tamponada al 10%, y al día siguiente, envíelas para inclusión en parafina.En las primeras etapas, las lesiones cardíacas pueden identificarse por el cambio en su apariencia de color y, en algunos casos, por la presencia de células inmunitarias. En lesiones avanzadas, las células inmunitarias estarán ausentes y se encontrarán lesiones similares a VA de gran tamaño en su lugar.Utilizando una sección cardíaca de cinco micrones sobre portaobjetos de vidrio con carga positiva, primero congele las secciones, luego désielas y déjelas secar al aire. Fije los portaobjetos en formalina tamponada al 10 % neutra durante 10 minutos a 25 grados Celsius. A continuación, elimine el fijador con tres lavados con PBS durante cinco minutos por cada lavado.Permeabilice el tejido con Tritón X-100 al 0,2 % en PBS durante 15 minutos. Elimine el detergente con tres lavados adicionales en PBS puro. A continuación, bloquee el tejido con suero de caballo al 10 % en PBS durante una hora tras un enjuague en PBS, y cubra la sección con antisuero durante dos horas a 37 grados Celsius.Trate los controles negativos con antisuero de conejo no inmunizado. Debido a que el tejido cardíaco absorbe fácilmente la tinción inmunofluorescente XI, lo que provoca niveles elevados de fondo, es probable que sea necesario optimizar la concentración y el tiempo de incubación para diferentes tipos de anticuerpos. Dos horas después, lave el antisuero con PBS. A continuación, reemplace la solución con un anticuerpo secundario y deje que las laminillas incuben a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Ahora aplique DPI a cinco miligramos por mililitro y lave las laminillas con PBS.Finalmente, monte las láminas en bálsamo, guárdelas y obtenga imágenes mediante microscopía confocal. Comience por eliminar la parafina e hidratar las secciones de tejido. Utilice lavados con xilol seguidos por una serie graduada de lavados con alcohol.Luego, sumerja los cortes en ácido fosfomolíbdico al 0,2 % durante cinco minutos, seguido de un enjuague con agua durante cinco minutos. A continuación, tiña con rojo de congo al 0,1 % y ácido acético durante dos horas. Después, lave los cortes con ácido clorhídrico 0,01 N durante tres minutos y enjuáguelos con etanol al 70 % durante un minuto. Ahora, deshidrate los cortes invirtiendo la serie de baños de alcohol graduado, seguido de lavados con xileno, monte para microscopía de luz y evalúe las laminillas.Los ratones desarrollaron una enfermedad neumocócica invasiva tras una exposición al tigre. Se observaron microlesiones cardíacas de cuatro cepas en los ventrículos, y se notó un aumento en el tamaño y número de lesiones entre las 24 y las 30 horas posteriores a la infección para verificar que S. pneumoniae efectivamente se encontraba dentro de las lesiones. Las secciones fueron teñidas para detectar el polisacárido capsular del serotipo cuatro producido por Tiger cuatro.Esto confirmó la presencia de agregados densos y estrechamente empaquetados dentro de los sitios de microlesión. Se realizó la tinción con piro rojo serio en secciones cardíacas de ratones que habían sido rescatados con ampicilina y controles no infectados. En los rescates.Hubo un aumento dramático en la presencia e intensidad de la tinción con bandas que se extendían desde lo que parecen ser sitios anteriores de lesiones en los ventrículos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar infectar a los ratones con una cantidad suficiente de S pneumoniae para permitir que la infección progrese durante al menos 28 a 30 horas, de modo que la bacteriemia y las microlesiones cardíacas tengan tiempo suficiente para formarse.

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