Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano.

El objetivo de este procedimiento es estudiar la proliferación, colonización y migración de células de cáncer de mama en un sistema modelo de tejido óseo humano. Esto se logra aislando fragmentos de tejido óseo trabecular de muestras quirúrgicas de cabeza femoral y cultivándolos con células de cáncer de mama que expresan luciferasa y proteína fluorescente verde. Las imágenes de bioluminiscencia se utilizan para medir la proliferación de células y verificar la colonización de células de cáncer de mama en los fragmentos de tejido óseo.

Los patrones de colonización de las células del cáncer de mama se observan mediante microscopía de fluorescencia. El compartimento de la médula se puede lavar de los fragmentos para su análisis por citometría de flujo mediante luminiscencia y ensayos de tinción. La migración de células de cáncer de mama hacia el cultivo de tejidos, sobrenadantes y fragmentos de tejido óseo se mide en cámaras de migración Transwell con imágenes de bioluminiscencia: el hueso es el sitio más frecuente de metástasis de cáncer de mama y, en última instancia, este modelo proporciona una nueva ventana para estudiar las células de cáncer de mama dentro del nicho metastásico óseo.

Una gran ventaja de este modelo es que proporciona acceso directo al microambiente de los fragmentos de tejido óseo humano, lo que nos permite observar y analizar fácilmente el comportamiento de las células de cáncer de mama durante experimentos de cocultivo a corto plazo. Este método se puede utilizar para estudiar cuestiones clave sobre los mecanismos subyacentes al cáncer de mama, de las metástasis óseas con el objetivo de identificar estrategias terapéuticas para prevenirlo y tratarlo eficazmente. Aunque este modelo puede proporcionar información sobre la metástasis del cáncer de mama, también se puede utilizar para estudiar otras neoplasias malignas buscadoras de hueso, como el cáncer de próstata.

Los fragmentos de tejido óseo deben extraerse en varios puntos de cada ensayo. Esto comienza con la recolección y el transporte de una muestra femoral en solución salina y la preparación de la estación de trabajo en un gabinete de bioseguridad con un guante quirúrgico. Sujete la cabeza del fémur con una mano y utilice un hueso quirúrgico para extraer el hueso trabecular.

Los fragmentos muestran un tamaño de entre dos y cinco milímetros. Los fórceps no funcionarán para este paso. Necesita una carne cruda quirúrgica de buena calidad.

Para este experimento, prepare una suspensión de células de cáncer de mama con 100.000 células por 50 microlitros de DMEM más 10% de FBS. Además, prepare tapones de cera ósea para movilizar los fragmentos óseos utilizando los extremos cortados de la punta de una micropipeta, guarde los tapones en una placa de Petri. Luego, con pinzas, transfiera los tapones a una placa de seis pocillos y, con un guante estéril, presione los tapones en la posición de las 12 en punto.

A continuación, pipetee 50 microlitros de la suspensión celular en el centro de cada uno. Coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos durante 45 minutos para promover la unión celular mientras la placa incuba, extraiga los fragmentos óseos con las células adheridas a la placa. Coloque un fragmento de tejido óseo sobre la cera ósea en tres pocillos y presione cada uno hacia abajo utilizando los controles de los servidores GER de tres pocillos sin fragmentos.

A continuación, agregue lentamente cinco mililitros de DMEM más 10% de FBS a la pared de cada pocillo. La cera ósea y los fragmentos óseos no deben desprenderse. Luego incube el cultivo durante 20 a 24 horas.

Al día siguiente, primero tome una imagen de las celdas. Agregue 300 microgramos por mililitro de Lucifer a cada pocillo, y luego obtenga inmediatamente una imagen de la placa con una plataforma de imágenes Ivis. Este experimento requiere una suspensión de células de cáncer de mama como la anterior.

Después de extraer los fragmentos óseos, use fórceps para transferir cada fragmento a un pocillo vacío de una placa de 24 pocillos, luego pipetee 50 microlitros de suspensión celular directamente sobre cada fragmento óseo y transfiera la placa a una incubadora durante 45 minutos para promover la unión celular. Una vez que las células se hayan adherido, agregue suavemente uno o dos mililitros de medio a cada pozo, lo suficiente como para sumergir el fragmento de hueso. A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante 20 a 24 horas.

En preparación para la obtención de imágenes de Ivis, la obtención de imágenes de fluorescencia o la recolección de células de médula ósea para su análisis para la obtención de imágenes de Ivis, transfiera los fragmentos óseos a una placa de 24 pocillos con un mililitro de medio fresco por pocillo. Agregue 300 microgramos por mililitro de Lucifer a cada pocillo y proceda como se describió anteriormente para la microscopía de fluorescencia. Pipetear cinco microlitros de solución de marcaje de bifosfato fluorescente en cada pocillo para etiquetar las espículas óseas del fragmento óseo e incubar la placa durante otras 24 horas.

24 horas después, use fórceps para transferir los fragmentos a placas que contengan un medio libre de rojo fenol. A continuación, observe las placas utilizando un microscopio de fluorescencia configurado para obtener imágenes a 485 nanómetros para localizar células de cáncer de mama que expresan GFP colonizadas y a 680 nanómetros. Identificar espículas óseas marcadas con bifosfato para lavar el compartimento de la médula ósea para el análisis del número de células o las propiedades.

Transfiera un fragmento a un colador de 70 micras sobre un tubo de crónica de 50 mililitros. A continuación, utilice una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 25 para enjuagar vigorosamente el fragmento con 10 mililitros de centrífuga PBS. La suspensión a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente para pellet las células, aspirar y desechar el reus supinado.

Doble la pastilla de células de médula ósea en PBS u otras soluciones deseadas según citometría de flujo o ensayos de viabilidad. Comience por generar una red de tejido óseo. Coloque los fragmentos de hueso en los pozos de un 12.

Placa de pocillo que contiene 2,2 mililitros de DMEM 10%FBS por pocillo y deja algunos pocillos de control sin fragmentos óseos. Cultive la placa durante 24 horas. A continuación, aspire y reemplace el medio y continúe el cultivo durante otras 24 horas, 48 horas después del cultivo transfiera 0,9 mililitros de supinato a una placa receptora mientras incuba temporalmente la placa receptora.

Coloque los insertos transwell en una placa vacía de 24 pocillos. A continuación, iPet 100.000 células de cáncer de mama en 350 microlitros en cada inserto. A continuación, cultive las placas durante 45 minutos para promover la adhesión de las células Después de 45 minutos, utilice pinzas para transferir las placas a una placa receptora.

Asegúrese de inclinar los insertos cuando los coloque en el receptor. Bien supinar para que no se formen burbujas. A continuación, incubar la placa con insertos durante 20 horas a 37 grados centígrados al día siguiente.

Use pinzas para quitar los insertos y agregue 300 microgramos por mililitro de Lucifer a cada uno. Realice bien las imágenes de bioluminiscencia en la placa receptora para detectar células de cáncer de mama que han migrado a través de las membranas y se han adherido a la parte inferior de los pocillos de la placa receptora. Primero, cargue una placa receptora con medio y colóquela en la incubadora de cultivo de tejidos.

Para inicializar las inserciones. Inviértalos en una caja vacía de tubos microfusionados con tapa. A continuación, añada 100.000 células en 50 microlitros a la superficie inferior exterior de cada membrana de inserción.

Cubra la caja dejando la tapa agrietada e incube los insertos durante 45 minutos en la incubadora de cultivo de tejidos. A continuación, utilice pinzas para invertir y transferir los insertos, los pocillos de una placa receptora a cada copa de inserto a 0,45 mililitros de DMEM con 10% de FBS. A continuación, añada un fragmento de hueso de tres milímetros o una cuenta de vidrio a cada inserto y córtelo en la placa durante 20 horas.

Al día siguiente, use fórceps para transferir los fragmentos y las cuentas a un plato con pocillos que contenga un mililitro de medio fresco. Agregue 300 microgramos por mililitro de Lucifer por pocillo y proceda con las imágenes de bioluminiscencia. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Las células de cáncer de mama se cultivaron junto a fragmentos óseos inmovilizados para medir la proliferación de células mamarias. Las imágenes de bioluminiscencia después de 24 horas de cultivo mostraron una mayor proliferación de células de cáncer de mama en presencia de fragmentos óseos en los tres pocillos superiores en comparación con la ausencia de fragmentos óseos en los tres pocillos inferiores. Los resultados de los experimentos con fragmentos de tres especímenes quirúrgicos separados mostraron una mayor proliferación en presencia de hueso frente a la ausencia de hueso.

En los tres casos, se observó la colonización de las células EGFP MCF siete F Luke asentadas directamente debajo de los fragmentos de tejido óseo con imágenes de bioluminiscencia después de 24 horas. La disminución de la señal se asoció con la disminución de la densidad de siembra después de 48 horas. Los fragmentos sembrados directamente marcados con el reactivo de bifosfonatos revelaron la colonización de las células de cáncer de mama positivas para GFP dentro de los compartimentos mineralizados y de médula.

La migración de las células de cáncer de mama a través de la membrana de migración porosa hacia el cultivo de tejido óseo, los sobrenadantes observados en los tres pozos superiores, fue robusta en comparación con la migración al control. Medio visto en los tres pozos inferiores. También se observó la migración a tres fragmentos óseos de un espécimen de THR dado, mientras que no se observó ninguna migración a las cuentas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer fragmentos de tejido óseo humano de una muestra de cabeza femoral e iniciarlos en ensayos de cocultivo para medir el comportamiento de las células de cáncer de mama, incluida la migración, la colonización y la proliferación.