Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

El objetivo de este procedimiento es estudiar la proliferación, colonización y migración de células de cáncer de mama en un sistema de modelo de tejido óseo humano ex vivo. Esto se logra aislado fragmentos de tejido óseo trabecular de especímenes quirúrgicos de cabezas femorales y cultivándolos con células de cáncer de mama que expresan luciferasa y proteína verde fluorescente. Se utiliza imagenología de bioluminiscencia para medir la proliferación celular y verificar la colonización de las células de cáncer de mama en los fragmentos de tejido óseo.

Los patrones de colonización de células de cáncer de mama se visualizan mediante microscopía de fluorescencia. El compartimento medular puede lavarse a partir de los fragmentos para su análisis mediante citometría de flujo, ensayos de luminiscencia y tinción. La migración de células de cáncer de mama hacia sobrenadantes de cultivo celular y fragmentos de tejido óseo se mide en cámaras de migración Transwell con imágenes de bioluminiscencia. El hueso es el sitio más frecuente de metástasis del cáncer de mama, y en última instancia, este modelo proporciona una nueva ventana para estudiar las células de cáncer de mama dentro del nicho metastásico óseo.

Una gran ventaja de este modelo es que proporciona acceso directo al microentorno de fragmentos de tejido óseo humano, lo que nos permite observar y analizar fácilmente el comportamiento de las células de cáncer de mama durante experimentos de co-cultivo a corto plazo. Este método puede utilizarse para estudiar preguntas clave sobre los mecanismos subyacentes al cáncer de mama y a la metástasis ósea, con el objetivo de identificar estrategias terapéuticas para prevenir y tratar eficazmente esta afección. Aunque este modelo puede ofrecer información sobre la metástasis del cáncer de mama, también puede emplearse para investigar otras malignidades que afectan al hueso, como el cáncer de próstata.

Se deben obtener fragmentos de tejido óseo en varios puntos de cada ensayo. Esto comienza con la recolección y el transporte de una muestra femoral en solución salina y la preparación del área de trabajo en una cabina de seguridad biológica utilizando un guante quirúrgico. Sujete la cabeza del fémur con una mano y utilice un instrumental quirúrgico para extraer el hueso trabecular.

Los fragmentos tienen un tamaño aproximado de dos a cinco milímetros. Las pinzas no funcionarán para este paso. Necesita una lanceta quirúrgica de buena calidad.

Para este experimento, prepare una suspensión de células de cáncer de mama con 100.000 células por 50 microlitros de DMEM más 10 % de FBS. Además, prepare tapones de cera ósea para movilizar los fragmentos óseos utilizando los extremos recortados de una punta de micropipeta, y guarde los tapones en una placa de Petri. Luego, con pinzas, transfiera los tapones a una placa de seis pocillos y, usando un guante estéril, presiónelos en la posición de las 12 en punto.

A continuación, pipetee 50 microlitros de la suspensión celular en el centro de cada uno. Coloque la placa en un incubador de cultivo de tejidos durante 45 minutos para favorecer la adhesión celular mientras la placa incuba y extrae los fragmentos óseos con las células adheridas a la placa. Coloque un fragmento de tejido óseo sobre la cera para hueso en tres pocillos y presione cada uno usando el GER; tres pocillos sin fragmentos servirán como controles.

A continuación, agregue lentamente cinco mililitros de DMEM más 10% de FBS a la pared de cada pocillo. No deben desalojarse la cera ósea ni los fragmentos óseos. Luego, incube el cultivo durante 20 a 24 horas.

Al día siguiente, primero capture las imágenes de las células. Añada 300 microgramos por mililitro de Lucifer a cada pocillo y, a continuación, obtenga inmediatamente imágenes de la placa con una plataforma de imagen Ivis. Este experimento requiere una suspensión de células de cáncer de mama como la anterior.

Después de extraer los fragmentos óseos, utilice pinzas para transferir cada fragmento a un pocillo vacío de una placa de 24 pocillos, luego pipetee 50 microlitros de la suspensión celular directamente sobre cada fragmento óseo y transfiera la placa a una incubadora durante 45 minutos para favorecer la adhesión celular. Una vez que las células hayan adherido, agregue suavemente uno a dos mililitros de medio a cada pocillo, suficiente para sumergir el fragmento óseo. A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 20 a 24 horas.

Como preparación para la obtención de imágenes mediante Ivis, imágenes de fluorescencia o recolección de células de médula para análisis mediante Ivis, transfiera los fragmentos óseos a una placa de 24 pocillos con un mililitro de medio fresco por pocillo. Añada 300 microgramos por mililitro de Lucifer a cada pocillo y continúe como se describió previamente para microscopía de fluorescencia. Pipetee cinco microlitros de solución fluorescente de bisfosfonato en cada pocillo para marcar las espículas óseas del fragmento óseo e incube la placa durante otras 24 horas.

24 horas después, utilice pinzas para transferir los fragmentos a placas que contengan medio sin rojo de fenol. Luego, observe las placas mediante un microscopio de fluorescencia configurado para obtener imágenes a 485 nanómetros para localizar las células cancerosas de mama que expresan GFP y a 680 nanómetros para identificar espolones óseos marcados con bifosfato, y lave el compartimento de médula ósea para analizar el número o las propiedades de las células.

Transfiera un fragmento a un filtro de 70 micrones colocado sobre un tubo crónico de 50 mililitros. Luego, utilice una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 25 para enjuagar vigorosamente el fragmento con 10 mililitros de PBS. Centrifugue la suspensión a 300 ×g durante tres minutos a temperatura ambiente para sedimentar las células. Aspire y deseche el sobrenadante.

Doble el pellet de células de médula en PBS u otras soluciones deseadas según los ensayos de citometría de flujo o de viabilidad. Comience generando una red de tejido óseo. Coloque los fragmentos óseos en los pocillos de una placa de 12.

Placa de cultivo que contiene 2,2 mililitros de DMEM con 10 % de FBS por pocillo y dejar algunos pocillos de control sin fragmentos óseos. Incubar la placa durante 24 horas. Luego aspirar y reemplazar el medio y continuar el cultivo durante otras 24 horas; a las 48 horas de cultivo, transferir 0,9 mililitros del sobrenadante a una placa receptora mientras se incuba temporalmente la placa receptora.

Coloque insertos transbien en una placa de 24 pocillos vacía. Luego, siembre 100.000 células de cáncer de mama en 350 microlitros sobre cada inserto. A continuación, cultive las placas durante 45 minutos para promover la adhesión celular. Después de 45 minutos, use pinzas para transferir los insertos a una placa receptora.

Asegúrese de colocar los insertos en ángulo al introducirlos en el receptor. Supine bien para que no se formen burbujas. Luego incube la placa con los insertos durante 20 horas a 37 grados Celsius al día siguiente.

Utilice pinzas para retirar los insertos y añada 300 microgramos por mililitro de Lucifer en cada uno. Realice la imagen de bioluminiscencia en la placa receptora para detectar células de cáncer de mama que hayan migrado a través de las membranas y se hayan adherido al fondo de los pocillos de la placa receptora. Primero, cargue una placa receptora con medio y colóquela en el incubador de cultivo de tejidos.

Para sembrar los insertos, inviértalos en una caja de tubos microfusos vacía con tapa. Luego, añada 100.000 células en 50 microlitros a la superficie inferior externa de cada membrana de inserto.

Cubra la caja dejando la tapa entreabierta e incube los insertos durante 45 minutos en el incubador de cultivo celular. Luego, use pinzas para invertir y transferir los insertos, colocando los pozos de una placa receptora dentro de cada copa de inserto con 0,45 mililitros de DMEM con 10% de FBS. A continuación, agregue un fragmento óseo de tres milímetros o una perla de vidrio a cada inserto y cultive en la placa durante 20 horas.

Al día siguiente, utilice pinzas para transferir los fragmentos y las perlas a una placa con pocillos que contengan un mililitro de medio fresco. Añada 300 microgramos por mililitro de Lucifer por pocillo y continúe con la imagen de bioluminiscencia. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Las células de cáncer de mama se cultivaron conjuntamente adyacentes a fragmentos óseos inmovilizados para medir la proliferación de las células mamarias. La imagen de bioluminiscencia tras 24 horas de cultivo mostró una proliferación aumentada de las células de cáncer de mama en presencia de fragmentos óseos en los tres pozos superiores, en comparación con la ausencia de fragmentos óseos en los tres pozos inferiores. Los resultados de experimentos utilizando fragmentos de tres especímenes quirúrgicos distintos mostraron una proliferación mayor en presencia frente a la ausencia de hueso.

En los tres casos, se observó mediante imágenes de bioluminiscencia la colonización de células MCF seven F Luke EGFP ubicadas directamente bajo fragmentos de tejido óseo tras 24 horas. Una señal disminuida se asoció con una densidad de siembra decreciente tras 48 horas. Los fragmentos sembrados directamente y marcados con el reactivo bifosfonato revelaron la colonización de las células de cáncer de mama positivas para GFP dentro de los compartimentos mineralizados y de médula ósea.

La migración de las células de cáncer de mama a través de la membrana porosa de migración hacia el cultivo de tejido óseo, los sobrenadantes observados en los tres primeros pocillos fueron robustos en comparación con la migración hacia el control. Medio observado en los tres pocillos inferiores. También se observó migración hacia tres fragmentos óseos de una muestra dada de THR, mientras que no se observó migración hacia las perlas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer fragmentos de tejido óseo humano de una muestra de cabeza femoral e iniciarlos en ensayos de cultivo conjunto para medir comportamientos de células de cáncer de mama, incluyendo migración, colonización y proliferación.