Name: Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprenda a cultivar explantes de tejido óseo humano para estudiar la proliferación, colonización y migración de células de cáncer de mama en el nicho metastásico óseo.

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Fueron financiados Estos estudios, en parte, por subvenciones de la Fundación Alternativa de Investigación y Desarrollo (107.588), el Instituto Nacional de Salud (1U54CA136465-04S1), y el Programa de Investigación del Cáncer de Seno de California (201B-0141). Agradecemos a los Dres. Andrew Wilber y R. Scott McIvor por la generosa donación de su <pkt2 lubig=""> transponson y PK / hubiC-SB11 plásmidos transposasa. Agradecemos John Tamaresis, Ph.D. para el asesoramiento sobre métodos estadísticos, Timothy Brown para realizar citometría de flujo, Georgette Henrich consejo sobre ensayos migraciones, y Nancy Bellagamba para facilitar la recogida de muestras THR. </pkt2>

Cabezas femorales se obtuvieron de los pacientes sometidos a cirugía electiva THR en el Departamento de Cirugía Ortopédica en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Todos los tejidos se recogieron como muestras sin identificación, de acuerdo con las regulaciones de la Oficina de Cumplimiento de Investigación de la Universidad de Stanford. 1. Selección de una línea (s) Celular del Cáncer de Mama <ol><li> Obtener o transfectar la línea celular de cáncer de mama deseado (s) con un reportero luciferase construir-GFP. Los siguientes experimentos se realizaron utilizando el MCF-7 de cáncer de mama líneas celulares de ingeniería para la expresión estable de la luciferasa de luciérnaga (fLUC) y proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) MDA-MB-231 y por transfección con el plásmido transposón de belleza durmiente pKT2 / Lubig y el pK plásmido transposasa / hubiC-SB11 45,46. NOTA: Las líneas celulares transfectadas se conocen como MDA-MB-231-fLuc-EGFP, y MCF-7-fLuc-EGFP. </li></ol> 2. Aislar Tissue Fragments de Cabezas femorales <ol><li> Después de la cirugía THR, recoger la cabeza femoral desechado en un recipiente estéril lleno de solución salina fisiológica. Transferir la muestra al laboratorio y procesarla dentro de 1-3 horas de la cirugía. Nota: si hay un retraso en el procesamiento, coloque la muestra a 4 ° C. </li><li> Prepare un área de trabajo mediante la colocación de los siguientes elementos en una estera absorbente en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar: guantes estériles, gubia quirúrgica, fórceps, vaso de precipitado con isopropanol al 70% para enjuagar los instrumentos y los vasos de cultivo de tejidos como se estipula a continuación para cada tipo de experimento . </li><li> El uso de un guante quirúrgico estéril para mantener la cabeza del fémur ronda en una mano, utilice la gubia en la otra mano para extraer fragmentos de hueso trabecular del tamaño deseado (~ 5.2 mm) del eje superior expuesta del fémur. Transferencia de fragmentos de hueso en el recipiente de cultivo (por ejemplo, 6, 12, o 24 y placa de cultivo de tejidos o la cámara de migración), dependiendo del tipo de la proliferación, colonization o migración experimento, tal como se describe en los pasos 3, 4 o 5. NOTA: fragmentos de tejido óseo debe ser cosechada como se describe anteriormente después de completar los pasos iniciales para cada ensayo específico proliferación, colonización o migración. Fragmentos variarán en tamaño como se muestra en la Figura 2. Los fragmentos pueden ser pesados ​​antes o después de los experimentos con el propósito de la normalización. </li></ol> 3. Las células de cáncer de mama co-cultivo adyacentes a fragmentos de hueso para medir la proliferación de células de mama Utilizando BLI <ol><li> Antes del experimento, preparar una suspensión que contiene 2 x 10 5 células de cáncer de mama / 50 l, y preparar tapones de cera de hueso para inmovilizar los fragmentos de hueso en cultivo. Cortar una punta de micropipeta P200 en 3 pedazos y usar el extremo estrecho de la pieza más grande de una manera &quot;cortador de galletas&quot; para cortar pequeños (~ 35 mg) piezas de cera de hueso. Utilice el extremo ancho de la pieza más pequeña para expulsar los tapones de cera de hueso en una placa de Petripara el almacenamiento. </li><li> Coloque un pedazo de cera de hueso en la posición de las 12 de cada bien y presione suavemente hacia abajo con un dedo índice estéril enguantada. </li><li> Pipetear 50 l de suspensión de células que contiene 1 x 10 5 células de cáncer de mama en DMEM-FBS al 10% + Pen-Strep en el centro de cada pocillo de una placa de 6 pocillos. (Alternativamente, las células de semillas en un patrón disperso si lo desea.) Colocar la placa en un C de cultivo de tejidos incubadora a 37 ° durante 45 min para promover la unión celular. </li><li> Coloque el fragmento 1 hueso en 1 pieza de cera de hueso para cada pozo experimental y aplicar una presión suave con la gubia para asegurarlo. Realizar experimentos por triplicado tal que 3 fragmentos óseos de una muestra de THR dados se colocan en los tres primeros pozos, mientras que los tres pocillos de fondo contienen cera de hueso sólo como controles. </li><li> Usando una pipeta de 5 ml, entregar suave y lentamente 5 ml de DMEM-FBS al 10% a un lado de cada pocillo para evitar que se desprenda de las células de la mama o fragmentos de hueso. Colocar la placa en un 3776; C incubadora de cultivo de tejidos de 20 a 24 h. </li><li> Para realizar imágenes de bioluminiscencia (BLI) retire la placa de la incubadora y añadir sustrato luciferina (para lograr una concentración de 300 mg / ml) a cada pocillo. Imagen de la placa de inmediato en una plataforma de imágenes IVIS utilizando los siguientes parámetros: f-stop de 1, pequeña de agrupación, el tiempo de exposición de 1 segundo, el nivel D. Mide la intensidad de la señal de cada uno así como la luminosidad media (fotones / segundo / centímetro cuadrado / estereorradián). </li><li> Utilice software de imagen para definir regiones de interés (ROI) para cuantificar la radiación promedio para todos los pozos experimentales y de control. Exportar valores medios luminosidad a una hoja de Excel para realizar estadísticas y generar gráficos. </li></ol> 4. Las células de cáncer de mama co-cultivo sembrados directamente en fragmentos de hueso para el Estudio de Colonización y número de la célula <ol><li> El uso de fórceps para colocar los fragmentos de hueso directamente en los pocillos vacíos de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos (1 fragmento / pocillo). </li><li> PepitaETTE un 50 l suspensión de células de gotita de DMEM-FBS al 10% que contiene 1 x 10 3-6 células de cáncer de mama directamente en la parte superior de cada fragmento de hueso. Colocar la placa en un 37 ° C tejido cultura incubadora durante 45 minutos para promover la unión celular. Añadir suavemente 1-2 ml DMEM-FBS al 10% en el lado de cada pocillo de tal manera que el fragmento se sumerge totalmente en medio. Incubar la placa en un 37 ° C tejido cultura incubadora durante 20 a 24 horas. </li><li> Después de la incubación, el uso de fórceps para transferir cada fragmento de tejido óseo a una placa de 24 pocillos fresco que contenía 1 ml de DMEM-FBS al 10% en cada pocillo. Para realizar BLI, siga los pasos 3.6 a 3.7 anteriores. Además, los fragmentos pueden ser vistos usando un microscopio de fluorescencia, o tirarse por obtener la población ósea para el análisis de los números de células de cáncer de mama y las propiedades como se describe en el paso 6. </li><li> Para preparar los fragmentos intactos para la evaluación cualitativa por microscopía de fluorescencia después de BLI, pipeta de 5 l de solución de etiquetado bisfosfonato fluorescente (precomparación de acuerdo con las instrucciones del fabricante) en cada pocillo para etiquetar las espículas mineralizados de los fragmentos de hueso. Se incuba la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante otras 24 h. </li><li> Tras 24 horas de cultivo en solución de etiquetado bisfosfonato fluorescente, use pinzas para transferir los fragmentos de placas de cultivo de tejidos que contienen medio sin rojo fenol y vista usando un microscopio de fluorescencia configurado para GFP imagen (485 nm) y la etiqueta con bifosfonatos (680 nm). </li></ol> 5. Medición de la migración de células de cáncer de mama a los fragmentos de tejido óseo y cultivadas Fragmento de hueso sobrenadantes <ol><li> La migración hacia el tejido óseo sobrenadante de cultivo. NOTA: Realice experimentos por triplicado tal que 3 fragmentos de un espécimen THR dados se utilizan para generar 3 sobrenadantes. Para cada experimento, se compara la migración a través de tres pocillos que contienen sobrenadantes de hueso frente a tres pocillos que contienen medio de control solamente. <ol><li> Generar tis huesodemandar sobrenadantes mediante la colocación de fragmentos de hueso en los pocillos de una placa de 12 pocillos que contenía 2,2 ml de DMEM-FBS al 10% por pocillo. Cultura en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejido durante 24 horas. Retire el medio a las 24 horas y reemplazar con 2,2 ml DMEM-FBS al 10%. Los pocillos de control de tratamiento que contiene DMEM-FBS al 10% de la misma manera. ATENCIÓN: se cambió el medio a las 24 horas para eliminar factores secretados en respuesta al trauma del tejido resultante de la cirugía. Debido a que los sobrenadantes del tejido óseo se generan en contenía FBS al medio, los pocillos que contenían FBS medio que contiene sólo se incluyen para controlar las contribuciones de FBS a la migración de células de cáncer de mama. </li><li> En 48 horas, recoger 0,9 ml de cada uno / medio de control sobrenadante y pipeta en los pocillos de una placa receptora. Los insertos posteriormente serán colocados en estos pozos. Incubar la placa receptora en la cultura incubadora de tejido mientras la siembra de las inserciones. Nota: El resto de sobrenadante (~ 1 ml después de la evaporación) se pueden recoger para el análisis de secretoma factors si se desea 44. </li><li> Para sembrar las inserciones Transwell, colóquelos en un estándar, de 24 pocillos placa de cultivo tisular vacía. Pipetear 350 l suspensión de células que contiene 1 x 10 5 células de cáncer de mama en DMEM-FBS al 10% sobre la superficie de la membrana superior, interior de cada inserto como se muestra en la Figura 1A. Coloque la placa de 24 pocillos que contenía los insertos de cabezas de serie en el 37 ° C de cultivo de tejidos incubadora durante 45 min para promover la unión. </li><li> Una vez que las células se han unido a los insertos, el uso de fórceps para transferir los insertos a la placa de receptor de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ángulo de cada inserto cuando la coloque en el receptor así para evitar la formación de burbujas entre la membrana de inserción y el receptor así sobrenadante. Incubar la placa receptora con inserciones durante 20 horas en un 37 ° C tejido cultura incubadora. NOTA: Verifique el lado inferior de la placa receptora de burbujas entre la membrana de inserción y el receptor así supernatant. Si se ven burbujas, extraiga los protectores específicos y colocarlos de nuevo en el receptor bien hasta que no queden burbujas están presentes. </li><li> Después de 20 horas de uso de fórceps para extraer los insertos de la placa receptora. Usando los procedimientos en los pasos 3.6 a 3.7 realizar BLI a la imagen de las células que han migrado en y unidos a la parte inferior de los pocillos de la placa receptor. </li></ol></li><li> La migración hacia los fragmentos de tejido óseo. NOTA: Realice experimentos por triplicado tal que 3 fragmentos de un espécimen THR dados se colocan en 3 inserciones separadas, y 3 perlas de vidrio se colocan en 3 inserciones separadas como controles. <ol><li> Preparar la placa receptora pipeteando 0,9 ml de DMEM-FBS al 10% en cada pocillo. Colóquelo en la cultura incubadora tejido mientras se preparan los insertos. </li><li> Para sembrar las inserciones, ellos invertir en la superficie de una caja de tubo de microcentrífuga de plástico que tiene una tapa. Pipetear 50 l de suspensión celular gota de DMEM-FBS al 10% que contiene 1 x 10 5 células de cáncer de mama directly sobre la superficie exterior, parte inferior de cada membrana de inserción (que está mirando hacia arriba en los insertos invertidas). Cubrir la caja del tubo de microcentrífuga con la tapa entreabierta y la transfiere a la incubadora a 37 ° tejido durante 45 min para promover la unión celular. </li><li> Transferir la caja del tubo de microcentrífuga a la campana de cultivo de tejido, y el uso de fórceps para girar los insertos sembradas lado derecho hacia arriba y transferirlos en los pocillos de la placa receptora. Pipetear 0,450 ml de DMEM-FBS al 10% en cada taza de inserción. Con unas pinzas, transferir un fragmento de tejido óseo (~ 3 mm) en cada taza de inserción preparado. Opcionalmente, utilizar cuentas de vidrio como controles negativos en pozos adicionales. Colocar la placa en una cultura incubadora tejido durante 20 horas. </li><li> Para medir la migración, preparar una placa de cultivo tisular estándar de 24 pocillos que contenía 1 ml de DMEM-FBS al 10% por pocillo. Retire la placa receptora de la incubadora y el uso de fórceps para transferir los fragmentos de hueso y los granos de cada insertar en pocillos separados de la placa estándar. Añadir luciferinasustrato (para lograr una concentración final de 300 mg / ml) a cada pocillo y realizar BLI usando los procedimientos en los pasos 3.6 a 3.7. </li></ol></li></ol> 6. Los análisis adicionales pre y post-experimentales <ol><li> Análisis de médula enrojecida. <ol><li> Transferencia de un fragmento de hueso en un filtro de células de 70 micras colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Utilice una jeringa de 10 ml con una aguja de 25 G para enjuagar vigorosamente el fragmento con 10 ml de PBS para obtener una suspensión de células de médula en el tubo cónico. Centrifugar la suspensión de células durante 3 minutos a 300 xg y 21 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en PBS u otra solución deseada para citometría de flujo. NOTA: los volúmenes de resuspensión variarán dependiendo del tamaño del sedimento celular después de la centrifugación, y la aplicación. </li><li> Para los ensayos de viabilidad ~ 75-300 mu l volúmenes de PBS son apropiados, y estas suspensiones se pueden analizar utilizando fluorescenc disponible comercialmenteensayos de viabilidad basado en correo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pipetearon en un hemocitómetro convencional, y se contaron usando un microscopio de fluorescencia invertido. </li><li> Para el análisis de citometría de flujo o de la clasificación basada en la detección de células de cáncer de mama positivas para GFP, resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS que contenía 2% de FBS, 2 mM de EDTA, y 10 mM HEPES tal que la concentración es 1 x 10 6 células / ml. </li></ol></li><li> H &amp; E tinción inmunohistoquímica y. <ol><li> Para procesar los fragmentos de hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción y / o inmunohistoquímica, colocar los fragmentos en cassettes de plástico marcadas con un lápiz número 2, y sumergirse en un recipiente lleno con 10% de formalina tamponada durante 24 hr. </li><li> Tejidos de proceso para la inclusión en parafina, seccionamiento y tinción usando protocolos rutinarios que incluyen una etapa de descalcificación para dar cuenta de las espículas mineralizadas dentro de cada fragmento. </li></ol></li></ol>

No hay divulgaciones que informar.

Mehra et al., Han descrito previamente la recogida y análisis de muestras de hueso postmortem de pacientes con cáncer de próstata metastásico cosechadas en el momento de la autopsia, que revela los tejidos de alta calidad y validar el uso de muestras de huesos humanos para estudiar el proceso metastásico 47. Aquí hemos descrito los protocolos de recolección, procesamiento y uso de fragmentos de tejidos óseos humanos obtenidos de cabezas femorales desechados después de la cirugía THR en un sistema de ...

El microambiente tumoral es ampliamente reconocida como un determinante crítico de la conducta de células de cáncer durante la progresión del cáncer de mama metastásico y repartidas 1-3. El objetivo del método que aquí se presenta es la de facilitar el estudio de las células de cáncer de mama en el microambiente del tejido óseo humano, el sitio más frecuente de metástasis del cáncer de mama 4-6. El hueso se compone de compartimentos mineralizadas y médula ósea 7-9, ambos de los cuales albergan células y factores secretados implicados en la progresión metastásica 10,11. Aunque es ampliamente utilizado en modelos in vivo de ratón facilitar estudios sistémicos del proceso metastásico 12-15, interacciones de las células dentro del esqueleto no son de fácil acceso para la observación y la perturbación directa. Sistemas de modelo para el estudio y el cultivo de tejidos óseos ratón y células de médula de ratón proporcionan un mejor acceso y han dado muchas ideas con respecto a la interferencia y los mecanismos que subyacen a las células del cáncer de mama metastasis del esqueleto murino 16-22. Sin embargo, los estudios han sugerido que puede haber patrones de osteotropism específicas de la especie por el tejido óseo 23,24. Estos patrones podrían reflejar especies específicas inherentes diferencias en las propiedades del tejido óseo, las diferencias resultantes de poblaciones de médula ósea alterados en ratones inmunodeficientes 11, y / o la edad relativamente joven de los ratones utilizados en los experimentos, todos los cuales son posibles determinantes de la médula microambiente. In vitro enfoques para el estudio de las células de cáncer de mama en co-cultivos óseos humanos se han centrado generalmente en los tipos de células óseas específicas tales como osteoblastos derivados de médula o de células estromales cultivadas como monocapas o dentro de la ingeniería de sistemas modelo de 3 dimensiones 25-35. Aunque los modelos de cultivo de células de 2 dimensiones han formado la base del in vitro enfoques para la investigación del cáncer, desde hace tiempo se ha reconocido que el comportamiento celular se altera fundamentalmente en monolayer sistemas de cultivo 18,36,37. Esto ha llevado al desarrollo de microambientes de ingeniería que imitan la complejidad de los tejidos vivos de 3 dimensiones, incluyendo la Matriz y modelos basados ​​en los andamios compuestos de materiales naturales tales como colágeno, o polímeros sintéticos sembraron con tipos específicos de células para crear microambientes similar a un tejido 36-41. Enfoques de ingeniería también han incluido el uso de las plataformas de biorreactores para controlar y estudiar el entorno hormonal del microambiente 18,19,41-43. Aunque los modelos biomiméticos y biorreactores proporcionan muchos elementos de un microambiente del tejido complejo en un entorno controlado, y se han aplicado con éxito para avanzar en el estudio de la metástasis del cáncer de mama al hueso 18,19,35,42,43, sistemas de modelos de ingeniería por lo general no incorporan el espectro completo de tipos de células y componentes de la matriz extracelulares presentes en el entorno hueso nativo. Hasta hace poco, el cáncer de mamacélulas no se han estudiado en el microambiente nativo, intacto, 3-dimensional de tejidos óseos humanos. Recientemente hemos informado de la elaboración de un modelo de co-cultivo utilizando fragmentos de tejidos óseos humanos aislados de reemplazo total de cadera (THR) cirugía especímenes 44. Estos especímenes albergan tanto los compartimentos mineralizadas y ósea necesarias para estudiar los mecanismos subyacentes de micro-metástasis en cultivo a corto plazo. En trabajos anteriores hemos establecido una prueba de principio para el uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI) para monitorear la proliferación de células de cáncer de mama que expresan luciferasa (MDA-MB-231-fLuc) co-cultivadas con fragmentos de hueso 44. Aquí presentamos detallamos los protocolos experimentales para el estudio de la proliferación celular del cáncer de pecho, la colonización y la migración dentro del contexto de la microambiente nativo usando explantes de tejido óseo humano. En primer lugar se presenta un protocolo para el co-cultivo de células de cáncer de seno adyacentes a fragmentos de hueso para medir mamala proliferación celular usando BLI. En esta sección, las suspensiones celulares de mama se siembran en forma de manchas de células en placas de 6 pocillos adyacentes a fragmentos óseos, que están inmovilizados por piezas de cera de hueso. Los pocillos de control contienen cera de hueso, pero no fragmento de hueso. Una vez manchas de células se adhieren, se añade medio y la placa se cultivaron durante 24 h, después de lo cual la intensidad de señal bioluminiscente (asociado con el número de células) se mide con BLI. En el siguiente paso se presentan métodos para células de cáncer de mama co-cultivo sembradas directamente sobre fragmentos de hueso para estudiar la colonización y proliferación. Aquí las suspensiones de células de mama se pipetean directamente sobre los fragmentos de tejido óseo, que se controlan mediante cultivo por BLI y microscopía de fluorescencia con el tiempo para realizar un seguimiento de la colonización y el número de células. En este método, el compartimiento de la médula se puede lavar a partir de los fragmentos de hueso en cualquier punto de tiempo para el análisis de las células de cáncer de mama colonizados por citometría de flujo, o los ensayos de viabilidad ósea. Además, Deescriba dos enfoques diferentes para medir la migración de células de cáncer de mama. En el primer método pasos se describen para la medición de la migración hacia los sobrenadantes de cultivo de tejido óseo. En este protocolo las células de cáncer de mama se siembran en las superficies interiores, superiores de las membranas Transwell insertan con un 8 micras de tamaño de poro (como se muestra en la Figura 1A). Los insertos se colocan en un plato receptor con pocillos que contienen sobrenadante tejido óseo o medio de control. En el transcurso de un período de incubación de 20 h, pequeñas cantidades de células de cáncer de mama migran a través de las membranas de inserción hacia abajo en los pocillos de cultivo de tejidos más bajos donde se unen para la detección por BLI. En el segundo método de migración de las células de cáncer de mama se siembran en las superficies inferiores, exteriores de las membranas de inserción Transwell. Fragmentos de tejido de hueso se colocan en las tazas de inserción y las células de cáncer de mama migran a través de las membranas para colonizar los fragmentos de hueso (como se muestra en la Figura 1B), el cualluego son proyectados utilizando BLI.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Complementa todos los DMEM con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de Pen/Estreptococo</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>Complementa todos los McCoy's con un 10% de suero fetal bovino y un 1%</td></tr> de <tr><td>suero bovino fetal</td> Penicillen Life <td>Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillen Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blastocidina (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>Medios complementarios utilizados para líneas celulares transfectadas.</td></tr><tr><td>Halcón&reg; Insertos de cultivo celular para placa de 24 pocillos con membrana de PET transparente (8.0 &mu; </td><td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; 24 Pozos Placa complementaria de inserción de cultivo celular de poliestireno tratado con TC</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Kit de Viabilidad/Citotoxicidad *para células de mamíferos*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina luciérnaga, sal de potasio 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Colador de células estériles 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>6 pocillos de cultivo celular tratado con TC</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12 pocillos</td> tratados con TC <td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24 pocillos TC Cluster de cultivo celular tratado con TC</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Cera ósea</td><td>Corporación de Especialidades Quirúrgicas</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Plataforma de imágenes Caliper</td><td>Life Sciences/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software Program&nbsp;</td><td>Calibrador de Ciencias de la Vida/PerkinSistema</td><td></td> de imagen Elmer 133026 <td></td></tr><tr><td>EVOS FL</td><td>Life Technologies</td><td>versión 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>Células de cáncer de mama MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 células de cáncer de mama</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Ratón monoclonal anti-citoqueratina humana clon</td><td>de citomatación DAKO</td><td>(AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos de explantes de tejidos el cultivo fémur humano para el estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la niche metastásico

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

El hueso es el sitio más común de metástasis del cáncer de mama. Aunque es ampliamente aceptado que el comportamiento de las células del cáncer de influencias microambiente, poco se sabe acerca de las propiedades celulares de cáncer de mama y comportamientos dentro del microambiente natural de tejido óseo humano. Hemos desarrollado enfoques para realizar el seguimiento, cuantificar y modular las células de cáncer de mama humano en el microambiente de fragmentos humanas cultivadas de tejido óseo aisladas de cabezas femorales desechados después de cirugía de reemplazo total de cadera. El uso de células de cáncer de mama de ingeniería para la luciferasa y la proteína fluorescente (EGFP) expresión verde mejoradas, somos capaces de cuantificar de forma reproducible la migración y proliferación de patrones de uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI), interacciones celulares pista dentro de los fragmentos de hueso mediante microscopía de fluorescencia, y evaluar las células del seno después la colonización con citometría de flujo. Las principales ventajas de este modelo son: 1) a, microE tejido arquitectónico intacto nativambiente que incluye tipos de células humanas pertinentes, y 2) el acceso directo al microambiente, lo que facilita cuantitativo rápido y monitoreo cualitativo y perturbación de mama y de células óseas propiedades, comportamientos e interacciones. Una limitación principal, en la actualidad, es la viabilidad finito de los fragmentos de tejido, lo que limita la ventana del estudio de cultivo a corto plazo. Aplicaciones del sistema de modelo incluyen el estudio de la biología básica del cáncer de mama y otros tumores malignos por el hueso dentro del nicho metastásico, y el desarrollo de estrategias terapéuticas para orientar eficazmente las células de cáncer de mama en los tejidos óseos.

El aislamiento de fragmentos de tejido de Cabezas femorales Cabezas femorales se obtuvieron de igual número de hombres y mujeres (44 a 90 años de edad) sometidos a cirugía electiva de reemplazo total de cadera en el Departamento de Cirugía Ortopédica en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Cada cabeza femoral desechado contiene una pequeña porción de la parte superior del fémur, que alberga el tejido óseo trabecular compuesto por espículas mineralizadas y ósea. Este tejido e...

Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano.

Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

El objetivo de este procedimiento es estudiar la proliferación, colonización y migración de células de cáncer de mama en un sistema de modelo de tejido óseo humano ex vivo. Esto se logra aislado fragmentos de tejido óseo trabecular de especímenes quirúrgicos de cabezas femorales y cultivándolos con células de cáncer de mama que expresan luciferasa y proteína verde fluorescente. Se utiliza imagenología de bioluminiscencia para medir la proliferación celular y verificar la colonización de las células de cáncer de mama en los fragmentos de tejido óseo.Los patrones de colonización de células de cáncer de mama se visualizan mediante microscopía de fluorescencia. El compartimento medular puede lavarse a partir de los fragmentos para su análisis mediante citometría de flujo, ensayos de luminiscencia y tinción. La migración de células de cáncer de mama hacia sobrenadantes de cultivo celular y fragmentos de tejido óseo se mide en cámaras de migración Transwell con imágenes de bioluminiscencia. El hueso es el sitio más frecuente de metástasis del cáncer de mama, y en última instancia, este modelo proporciona una nueva ventana para estudiar las células de cáncer de mama dentro del nicho metastásico óseo.Una gran ventaja de este modelo es que proporciona acceso directo al microentorno de fragmentos de tejido óseo humano, lo que nos permite observar y analizar fácilmente el comportamiento de las células de cáncer de mama durante experimentos de co-cultivo a corto plazo. Este método puede utilizarse para estudiar preguntas clave sobre los mecanismos subyacentes al cáncer de mama y a la metástasis ósea, con el objetivo de identificar estrategias terapéuticas para prevenir y tratar eficazmente esta afección. Aunque este modelo puede ofrecer información sobre la metástasis del cáncer de mama, también puede emplearse para investigar otras malignidades que afectan al hueso, como el cáncer de próstata.Se deben obtener fragmentos de tejido óseo en varios puntos de cada ensayo. Esto comienza con la recolección y el transporte de una muestra femoral en solución salina y la preparación del área de trabajo en una cabina de seguridad biológica utilizando un guante quirúrgico. Sujete la cabeza del fémur con una mano y utilice un instrumental quirúrgico para extraer el hueso trabecular.Los fragmentos tienen un tamaño aproximado de dos a cinco milímetros. Las pinzas no funcionarán para este paso. Necesita una lanceta quirúrgica de buena calidad.Para este experimento, prepare una suspensión de células de cáncer de mama con 100.000 células por 50 microlitros de DMEM más 10 % de FBS. Además, prepare tapones de cera ósea para movilizar los fragmentos óseos utilizando los extremos recortados de una punta de micropipeta, y guarde los tapones en una placa de Petri. Luego, con pinzas, transfiera los tapones a una placa de seis pocillos y, usando un guante estéril, presiónelos en la posición de las 12 en punto.A continuación, pipetee 50 microlitros de la suspensión celular en el centro de cada uno. Coloque la placa en un incubador de cultivo de tejidos durante 45 minutos para favorecer la adhesión celular mientras la placa incuba y extrae los fragmentos óseos con las células adheridas a la placa. Coloque un fragmento de tejido óseo sobre la cera para hueso en tres pocillos y presione cada uno usando el GER; tres pocillos sin fragmentos servirán como controles.A continuación, agregue lentamente cinco mililitros de DMEM más 10% de FBS a la pared de cada pocillo. No deben desalojarse la cera ósea ni los fragmentos óseos. Luego, incube el cultivo durante 20 a 24 horas.Al día siguiente, primero capture las imágenes de las células. Añada 300 microgramos por mililitro de Lucifer a cada pocillo y, a continuación, obtenga inmediatamente imágenes de la placa con una plataforma de imagen Ivis. Este experimento requiere una suspensión de células de cáncer de mama como la anterior.Después de extraer los fragmentos óseos, utilice pinzas para transferir cada fragmento a un pocillo vacío de una placa de 24 pocillos, luego pipetee 50 microlitros de la suspensión celular directamente sobre cada fragmento óseo y transfiera la placa a una incubadora durante 45 minutos para favorecer la adhesión celular. Una vez que las células hayan adherido, agregue suavemente uno a dos mililitros de medio a cada pocillo, suficiente para sumergir el fragmento óseo. A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 20 a 24 horas.Como preparación para la obtención de imágenes mediante Ivis, imágenes de fluorescencia o recolección de células de médula para análisis mediante Ivis, transfiera los fragmentos óseos a una placa de 24 pocillos con un mililitro de medio fresco por pocillo. Añada 300 microgramos por mililitro de Lucifer a cada pocillo y continúe como se describió previamente para microscopía de fluorescencia. Pipetee cinco microlitros de solución fluorescente de bisfosfonato en cada pocillo para marcar las espículas óseas del fragmento óseo e incube la placa durante otras 24 horas.24 horas después, utilice pinzas para transferir los fragmentos a placas que contengan medio sin rojo de fenol. Luego, observe las placas mediante un microscopio de fluorescencia configurado para obtener imágenes a 485 nanómetros para localizar las células cancerosas de mama que expresan GFP y a 680 nanómetros para identificar espolones óseos marcados con bifosfato, y lave el compartimento de médula ósea para analizar el número o las propiedades de las células.Transfiera un fragmento a un filtro de 70 micrones colocado sobre un tubo crónico de 50 mililitros. Luego, utilice una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 25 para enjuagar vigorosamente el fragmento con 10 mililitros de PBS. Centrifugue la suspensión a 300 ×g durante tres minutos a temperatura ambiente para sedimentar las células. Aspire y deseche el sobrenadante.Doble el pellet de células de médula en PBS u otras soluciones deseadas según los ensayos de citometría de flujo o de viabilidad. Comience generando una red de tejido óseo. Coloque los fragmentos óseos en los pocillos de una placa de 12.Placa de cultivo que contiene 2,2 mililitros de DMEM con 10 % de FBS por pocillo y dejar algunos pocillos de control sin fragmentos óseos. Incubar la placa durante 24 horas. Luego aspirar y reemplazar el medio y continuar el cultivo durante otras 24 horas; a las 48 horas de cultivo, transferir 0,9 mililitros del sobrenadante a una placa receptora mientras se incuba temporalmente la placa receptora.Coloque insertos transbien en una placa de 24 pocillos vacía. Luego, siembre 100.000 células de cáncer de mama en 350 microlitros sobre cada inserto. A continuación, cultive las placas durante 45 minutos para promover la adhesión celular. Después de 45 minutos, use pinzas para transferir los insertos a una placa receptora.Asegúrese de colocar los insertos en ángulo al introducirlos en el receptor. Supine bien para que no se formen burbujas. Luego incube la placa con los insertos durante 20 horas a 37 grados Celsius al día siguiente.Utilice pinzas para retirar los insertos y añada 300 microgramos por mililitro de Lucifer en cada uno. Realice la imagen de bioluminiscencia en la placa receptora para detectar células de cáncer de mama que hayan migrado a través de las membranas y se hayan adherido al fondo de los pocillos de la placa receptora. Primero, cargue una placa receptora con medio y colóquela en el incubador de cultivo de tejidos.Para sembrar los insertos, inviértalos en una caja de tubos microfusos vacía con tapa. Luego, añada 100.000 células en 50 microlitros a la superficie inferior externa de cada membrana de inserto.Cubra la caja dejando la tapa entreabierta e incube los insertos durante 45 minutos en el incubador de cultivo celular. Luego, use pinzas para invertir y transferir los insertos, colocando los pozos de una placa receptora dentro de cada copa de inserto con 0,45 mililitros de DMEM con 10% de FBS. A continuación, agregue un fragmento óseo de tres milímetros o una perla de vidrio a cada inserto y cultive en la placa durante 20 horas.Al día siguiente, utilice pinzas para transferir los fragmentos y las perlas a una placa con pocillos que contengan un mililitro de medio fresco. Añada 300 microgramos por mililitro de Lucifer por pocillo y continúe con la imagen de bioluminiscencia. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.Las células de cáncer de mama se cultivaron conjuntamente adyacentes a fragmentos óseos inmovilizados para medir la proliferación de las células mamarias. La imagen de bioluminiscencia tras 24 horas de cultivo mostró una proliferación aumentada de las células de cáncer de mama en presencia de fragmentos óseos en los tres pozos superiores, en comparación con la ausencia de fragmentos óseos en los tres pozos inferiores. Los resultados de experimentos utilizando fragmentos de tres especímenes quirúrgicos distintos mostraron una proliferación mayor en presencia frente a la ausencia de hueso.En los tres casos, se observó mediante imágenes de bioluminiscencia la colonización de células MCF seven F Luke EGFP ubicadas directamente bajo fragmentos de tejido óseo tras 24 horas. Una señal disminuida se asoció con una densidad de siembra decreciente tras 48 horas. Los fragmentos sembrados directamente y marcados con el reactivo bifosfonato revelaron la colonización de las células de cáncer de mama positivas para GFP dentro de los compartimentos mineralizados y de médula ósea.La migración de las células de cáncer de mama a través de la membrana porosa de migración hacia el cultivo de tejido óseo, los sobrenadantes observados en los tres primeros pocillos fueron robustos en comparación con la migración hacia el control. Medio observado en los tres pocillos inferiores. También se observó migración hacia tres fragmentos óseos de una muestra dada de THR, mientras que no se observó migración hacia las perlas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer fragmentos de tejido óseo humano de una muestra de cabeza femoral e iniciarlos en ensayos de cultivo conjunto para medir comportamientos de células de cáncer de mama, incluyendo migración, colonización y proliferación.

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