Name: Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a establecer un modelo de xenoinjerto de mieloma múltiple humano en embriones de pollo para evaluar el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis. Esta técnica permite el cribado preclínico de fármacos anticancerígenos en un entorno 3D vivo.

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Los autores quieren agradecer a la Sra. Cornelia Heis por su excelente asistencia técnica en inmunohistoquímica y preparación de embriones de pollo. Este trabajo ha contado con el apoyo del Fondo Austriaco para la Ciencia (subvención FWF n.º P19552) y de la Unión Europea (proyecto FP7 de la UE Optatio n.º 278570).

De acuerdo con la ley austriaca, y la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio de los embriones de aves de servicios de salud pública de Estados Unidos no son considerados como animales vertebrados vivos hasta hatching.The Oficina de NIH de Laboratorio Bienestar Animal ha proporcionado orientación escrita en esta área (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm y NIH Publication No .: 06-4515). 1. Cultivo de células y transfección Lentiviral <ol><li> Líneas de cultivo de células MM OPM-2, RPMI-8226 y las células madre mesenquimatosas humanas de la médula ósea en medio RPMI 1640, suplementado con 10% de suero bovino fetal de ternera y 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y glutamina 2 mM en presencia de 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Transfectar 5 x 10 6 células HEK 293FT con la mezcla viral empaquetamiento del ADN (9 g) y 3 g pLenti6 / V5 dest eGFP vector por el uso de 30 l de reactivo de transfección liposomal y medio de transfección (10 ml). Retire medio de transfección después de 12 h, yañadir 10 ml de medio DMEM con 10% de suero bovino de ternera y 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA). </li><li> Después de 5 días, recoger los sobrenadantes de células HEK293FT después de la centrifugación de las células de natación (1.000 xg, 5min). Determinar el título viral por PCR en tiempo real como se describe en otra parte 28. </li><li> Transfectar 1 x 10 6 células MM con partículas lentivirales eGFP (1 x 10 5 partículas) en una placa de 24 pocillos en medio de crecimiento completo. Después de 3 días, iniciar el proceso de selección mediante la adición de 2 mg / ml blasticidina al medio de cultivo. Para el eGFP lentivirus comercialmente disponible, utilizar 500 mg / ml de neomicina. </li><li> Después de 2 semanas de selección, aparecerá racimos de células que expresan eGFP MM; recoger las células por centrifugación (1.000 xg, 5 min) y expandirlos como OPM-2 eGFP y RPMI-8226 sublíneas eGFP para experimentos (sección 2 y 3). </li></ol> 2. 3D-múltiple Modelo mieloma esferoide <ol><li> Solución de colágeno tipo I y Chill 10 x DMEM on hielo. </li><li> Mezclar 1/10 de volumen de 10 x medio DMEM en matriz de colágeno; añadir NaOH (0,2 N) para neutralizar la solución ácida de colágeno a un valor de pH de 7,4; colágeno tienda / solución del medio en el hielo. </li><li> Mezclar líneas celulares MM transgénicos (OPM-2 eGFP o RPMI-8226 eGFP; 250,000 por esferoide,) con las células humanas mesenquimales (50.000 células / esferoide, es decir, 30 l de caída). </li><li> Mezcla de células centrífuga en tubos de 15 ml (1.000 xg, 5min), agregar la mezcla de colágeno preparada fría (1 ml) al sedimento celular y mezclar bien (con 1.000 l punta). </li><li> Inmediatamente pipetear 30 l de la mezcla de colágeno / célula (con 100 l punta) en una placa de 24 pocillos en la película de parafina estéril y permitir que la mezcla de célula / colágeno para polimerizar durante 30 min a 37 ° C (véase la Figura 1A). </li><li> Esferoides MM de superposición con 1 ml de medio de cultivo que contiene 1, 10 y 100 nM bortezomib (ver Figura 1B). </li><li> Después de 72 h de incubación a 37 ° C, documento esferoides porestereomicroscopía de fluorescencia (véase la Figura 1C). </li><li> Transferir cada esferoide por el uso de fórceps con mordazas planas anchas en un tubo de reacción para la medición de GFP (véase la Figura 1D). </li></ol> 3. 3D mieloma múltiple modelo de xenoinjerto en la CAM <ol><li> Incubar huevos de gallina en una incubadora especial para huevos de aves a 37 ° C y 70% de humedad durante tres días. </li><li> A partir de entonces, los huevos abiertos y embriones de transferencia para esterilizar con barcos de etanol, cuadrada, de 10 cm de plástico con un peso con placa de cultivo celular de tapa e incubar &quot;ex ovo&quot; para los otros seis días, por lo que la CAM es capaz de desarrollar (ver Figura 2 A). </li><li> Solución I-colágeno tipo Chill y 10 x DMEM en hielo, se mezclan un décimo de volumen de 10 x medio DMEM en matriz de colágeno, Añadir NaOH (0,2 N) para neutralizar la solución ácida de colágeno a un valor de pH de 7,4; colágeno tienda / solución del medio en el hielo. </li><li> Mezclar líneas celulares MM transgénico (OPM-2 eGFP oRPMI-8226 eGFP; 250.000 por esferoide,) con células mesenquimales humanas (50.000 células / esferoide). </li><li> Centrifugar las células en tubos de 15 ml (1.000 xg, 5 minutos; para cada compuesto de ensayo 1 vial), añadir 1 ml de mezcla de colágeno preparada frío con el fármaco (a una concentración de trabajo deseada) al sedimento celular y mezclar bien (con 1.000 l punta). </li><li> Coloque colágeno gotas (30 l cada uno) sobre Parafilm en un 6 así paté durante 30 min para permitir la polimerización de la matriz extracelular a 37 ° C. </li><li> Transferencia &quot;onplants&quot; desde el paso 3.6 con el uso de fórceps a la superficie sin tratar de la CAM (2 cm del embrión) de embriones de pollo de 9 días de edad (4 onplants para cada embrión de pollo, vea la Figura 2B) </li><li> Después de 5 días de crecimiento in vivo en una incubadora de huevos a 37 ° C y 70% de humedad, documento xenoinjertos por estereomicroscopía de fluorescencia (véase la Figura 2C). La eutanasia a los embriones de pollo por hipotermia a 4 ° C en la nevera durante 5 h. </li><li> Retire xenoinjertos con tejido CAM subyacente por una tijera oftálmica y pinzas con mandíbulas planas anchas. Úsalos para la medición de las buenas prácticas agrarias (artículo 4, ver Figura 2D) o para el análisis inmunohistoquímico de los vasos sanguíneos y / o las células tumorales invasoras (sección 5). </li></ol> 4. Cuantificación de eGFP de proteínas por ELISA <ol><li> Transferir cada esferoide MM o xenoinjerto extirpado en 0,5 ml RIPA tampón que contenía inhibidores de la proteasa / ml 200 g. </li><li> Homogeneizar esferoide / xenoinjerto con un homogeneizador de tejidos en el hielo. </li><li> Haz tres de congelación / descongelación ciclos en nitrógeno líquido y 37 ° C baño de agua. </li><li> Centrifugar homogeneizado a 4 ° C durante 20 min (12000 g) y almacenar sobrenadantes. </li><li> Diluir las muestras 1:20 en tampón de ensayo (200 l) del kit de ELISA. Mida GFP-niveles por una GFP comercial ELISA Kit utilizando anticuerpos anti-GFP biotinilados, de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol> 5. ImmunohiAnálisis stochemical de los vasos sanguíneos y las células tumorales invasoras <ol><li> Fijar xenoinjertos extirpados con área CAM en el 4% paraformaldehido O / N a 4 ° C. </li><li> Coloque xenoinjertos fijos en cassettes de inclusión y transferirlos a una estación de incrustación de tejido con una serie graduada de alcohol creciente (50%, 70%, 80%, 95% de etanol, xilol y parafina; cada paso 60 min). </li><li> Sección xenoinjertos (5 M) por el uso de un micrótomo rotatorio banco de trabajo. Hornee secciones de parafina sobre portaobjetos de vidrio O / N a 56 ° C. </li><li> Desparafinar secciones por una serie graduada de alcohol bajando a agua bidestilada (xilol, 95%, 80%, 70%, etanol al 50%, agua bidestilada; cada paso 10 min). </li><li> Realizar la recuperación de antígenos en un baño de agua (95 ° C, 20 min) con una solución de recuperación de antígeno (tampón citrate-; pH 7,0; volumen de 100 l). </li><li> Bloquear la actividad peroxidasa endógena con 100 l 3% H 2 O 2 / metanol durante 30 min. </li><li> Secciones de bloque en PBS que contenía10% de suero de ternero fetal durante 45 min (volumen 100 l). </li><li> La mancha durante 1 hora con 100 l de anticuerpo primario (1μg / ml) diluido en PBS que contenía 1% de suero de ternera fetal a TA. </li><li> Después de lavar 3 veces en PBS, se incuban durante 1 hora con el anticuerpo secundario biotinilado (0,1 mg / ml) en PBS que contenía 1% de suero de ternera fetal a TA. </li><li> Después de lavar 3 veces en PBS realizar la reacción de color por la solución de avidina / (DAB) de sustrato-biotina (ABC) y la diaminobencidina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> 5.11. Detener la reacción mediante la transferencia de secciones al agua bidestilada, contratinción con hematoxilina y montaje de las secciones con un medio de montaje sintético. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia

El desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para refractario MM requiere menos tiempo y caros sistemas in vivo para evaluar la sensibilidad de las células MM humanos a las drogas. Hasta ahora, solamente pocos sistemas in vivo están disponibles para la evaluación preclínica de nuevas terapias anti-mieloma. Todos ellos tienen sus limitaciones para el cribado a gran escala de bibliotecas de compuestos 29. Los mejores modelos actuales de las células MM humanos son altamente ratones inmunodeficientes...

El mieloma múltiple (MM) se caracteriza por la proliferación de células plasmáticas malignas en la médula ósea, lesiones óseas e inmunodeficiencia 1. Aunque existen nuevas opciones de tratamiento, como los inhibidores del proteasoma (bortezomib) y los fármacos inmunomoduladores (pomalidomida y lenalidomida), el MM sigue siendo una neoplasia maligna incurable con un pronóstico sombrío 2. El mal pronóstico podría explicarse por la extraordinaria heterogeneidad de los clones de células MM que contribuye a respuestas variables a la terapia, en particular bajo tratamiento a largo plazo y presión de selección de clones MM 3.
Las pruebas preclínicas de nuevos fármacos y sus combinaciones in vitro e in vivo son un paso crítico y que requiere mucho tiempo para el desarrollo futuro de fármacos. Por lo tanto, se requieren modelos in vivo útiles de MM para obtener una mejor comprensión de la biología de la enfermedad y permitir el descubrimiento de nuevos fármacos. De hecho, los mejores modelos de xenotrasplante para neoplasias hematológicas y terapéuticas son los ratones inmunodeficientes, como los ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID) 4-7, los ratones diabéticos/SCID (NOD/SCID) no obesos 8,9 o los ratones NOD/SCID con β microglobulina knockout 10,11.
Aunque los modelos murinos de MM humano en algunos aspectos pueden parecerse al fenotipo de la enfermedad humana, los ratones inmunodeficientes son endogámicos, por lo tanto, simulan solo una respuesta individual a un medicamento y los costos son muy altos. Debido a la inmunosupresión, los animales requieren condiciones especiales de mantenimiento y el injerto de MM humano en ratones requiere de 6 semanas a 2 meses 9,12, a menos que las células se injerten directamente en la médula ósea mediante un procedimiento técnicamente exigente con menores tasas de supervivencia animal 7,13. Por lo tanto, se han establecido nuevos métodos que utilizan modelos de organoides basados en células madre 14, ingeniería de tejidos 15 o modelos sofisticados de cultivo celular en 3D 16. Competirán en un futuro próximo con los experimentos clásicos con animales para las pruebas preclínicas de fármacos, pero no pueden sustituir a las pruebas de toxicidad sistémica en organismos vivos.
El embrión de pollo ha demostrado antes ser un organismo adecuado para el xenotrasplante de células y tejidos humanos debido a la falta de respuesta inmune adaptativa hasta la eclosión 17-19. Además, cada embrión de pollo refleja una reacción individual a los medicamentos aplicados o a las células tumorales debido a la diversidad genética dentro de la población de pollos. La membrana corioalantoidea (MCA) es un sistema consolidado para el estudio de la angiogénesis tumoral dependiente 20-22. Cuando los tumores sólidos se injertan en la CAM, muestran muchas características de los cánceres in vivo, incluyendo proliferación, invasión, angiogénesis y metástasis 23-27. 
Sobre la base de la experiencia previa de nuestro grupo con modelos de xenoinjertos CAM20,26,27, se estableció un modelo MM humano que combina la ventaja de un sistema de cultivo 3D humano con el modelo de embriones de pollo en desarrollo ex ovo. Este sistema de modelo MM permite el seguimiento en tiempo real de la progresión del crecimiento de MM, la cuantificación de la masa celular y las pruebas preclínicas de fármacos.

<table><tbody><tr><td>Células RPMI-8226 Células</td><td>DSMZ</td><td>ACC 9</td><td>STR perfiladas</td></tr><tr><td>OPM-2 células</td><td>DSMZ</td><td>ACC 50</td><td>STR perfiladas</td></tr><tr><td>Células madre mesenquimales humanas&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>PC-C-12974</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT células&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino&nbsp; HyClone</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut- Pen- Solución de estreptococos</td><td>Sigma</td><td>G6784</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medio</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Medio de transfección/Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>eGFP partículas lentivirales</td><td>GeneCopoeia</td><td>LPP-EGFP-LV105</td><td>Partículas virales listas para usar</td></tr><tr><td>pLenti6/V5Dest6 eGFP vector</td><td>Invitrogen</td><td>PN 35-1271</td><td>de los autores</td></tr><tr><td>ViralpowerTM mezcla de embalaje&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>N/P 35-1275</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección/ Lipofectamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Biochrom</td><td>A2912</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno-Tipo1&nbsp; Cola de rata</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>polvo DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>Art.Nr. 10338582</td><td></td></tr><tr><td>plitidepsina</td><td>Pharmamar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bortezomib</td><td>LKT Lab., Inc.</td><td>B5871</td><td></td></tr><tr><td>Huevos de gallina blancos SPF</td><td>Charles River</td><td></td><td>Fertilizado&nbsp; Leghorn blanco&nbsp; huevos de gallina</td></tr><tr><td>Barcos de pesaje de plástico</td><td>neoLab</td><td>Art.Nr. 1-1125</td><td>para cultivo ex ovo</td></tr><tr><td>Placa de Petridish cuadrada (Tapas)</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td>para cultivo ex ovo</td></tr><tr><td>Tampón RIPA (10x)</td><td>Señalización celular</td><td>#9806</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa Comprimidos inhibidores Roche</td><td></td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Mini Completo sin EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP ELISA</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>Histocette II</td><td>Simport</td><td>M493-6</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp; 37%</td><td>Roth</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>Normapur</td><td>20,821,321</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histol</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6640.4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Sigma</td><td>A6330</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio SuperFrost</td><td>R. Langenbrinck&nbsp;</td><td>Art.-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>Labor- u. Medizintechnik</td><td>03-0060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation Wash Buffer 10x</td><td>DakoCytomation</td><td>Code-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 3006</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de recuperación de objetivos (10x)&nbsp; pH 6,1</td><td>Código DAKO</td><td>Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 1699</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu ASMA clon 1A4</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu CD138 clon MI15</td><td>DAKO</td><td>M7228</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Vimentin clon V9</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu clon Desmin D33</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; M0760</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Ki67&nbsp; clon MIB-1&nbsp; &nbsp;</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; M7240</td><td></td></tr><tr><td>cabra biotinilada- anti-ratón Vector Laboratories</td><td>Inc.</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit</td><td>Laboratorios Vector Inc.</td><td># PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Juego de tabletas FAST DAB.</td><td>Sigma Biochemicals</td><td># D4293</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s haemalaun solution</td><td>Merck</td><td>1.092.490.500</td><td></td></tr><tr><td>Roti Histokitt</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6638.2</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotativo de sobremesa</td><td>Thermo Electron, Shandon Finesse ME+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estación de inclusión de tejidos</td><td>Leica, TP1020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de huevos</td><td>Grumbach&nbsp;</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de fluorescencia equipado con una cámara digital conectada con una cámara digital (Olympus E410) y luz fría flexible&nbsp;</td><td>Olympus, SZX10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Turrax&nbsp;</td><td>Homogeneizador</td> <td>IKA T10</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de un modelo de xenoinjerto humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

El mieloma múltiple (MM), una enfermedad de las células plasmáticas malignas, sigue siendo incurable y nuevos fármacos son necesarios para mejorar el pronóstico de los pacientes. Debido a la falta del microambiente óseo y factores de crecimiento de auto / paracrina células MM humanos son difíciles de cultivar. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer adecuado in vitro y en sistemas de cultivo in vivo para estudiar la acción de nuevas terapias en las células MM humanos. Aquí se presenta un modelo para crecer células de mieloma múltiple humanos en un entorno 3D complejo in vitro e in vivo. Líneas celulares de MM OPM-2 y RPMI-8226 fueron transfectadas para expresar el transgén GFP y se cultivaron en la presencia de células mesenquimales humanos y de colágeno de tipo I matriz como esferoides tridimensionales. Además, esferoides fueron injertados en la membrana corioalantoidea (CAM) de embriones de pollo y el crecimiento tumoral se controló por microscopía de fluorescencia estéreo. Ambos modelos permiten el estudio de la novela dru terapéuticags en un entorno 3D complejo y la cuantificación de la masa celular del tumor después de la homogeneización de los injertos en un GFP-ELISA-transgén específico. Por otra parte, las respuestas angiogénicas de la acogida y la invasión de células tumorales en el tejido huésped subyacente pueden ser monitoreados diariamente por un microscopio estéreo y se analizaron por tinción inmunohistoquímica frente a células tumorales humanas (Ki-67, CD138, vimentina) o células anfitrionas murales que cubren los vasos sanguíneos (desmina / ASMA). En conclusión, el sistema onplant permite estudiar el crecimiento de células MM y la angiogénesis en un entorno 3D complejo y permite la detección de nuevos compuestos terapéuticos dirigidos a la supervivencia y proliferación de las células MM.

El análisis in vitro de los compuestos de interés en los ensayos de esferoide mieloma múltiple 3D Debido a la limitación de cultivo de células MM humanas primarias in vitro establecimos nuevos modelos de cultivo in vitro en 3D para líneas celulares de MM humanos que hacen uso de una matriz de crecimiento extracelular y células mesenquimales humanas primarias de apoyo de la médula ósea (Figura 1A, B). Líneas celulares de MM transgén...

Las células humanas de mieloma múltiple (MM) requieren el microambiente de apoyo de células mesenquimales y componentes de la matriz extracelular para la supervivencia y proliferación. Hemos establecido un modelo in vivo de embriones en pollo con células de mieloma y mesenquimales humanas injertadas para estudiar los efectos de fármacos contra el cáncer en el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis.

Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

El objetivo general del siguiente experimento es establecer un modelo in vivo de embrión de pollo con células humanas de mieloma y células mesenquimales injertadas para estudiar los efectos de fármacos contra el cáncer sobre el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis. Esto se logra generando células transgénicas de mieloma múltiple humano para su análisis en modelos tridimensionales in vitro e in vivo. Las células se transfectan con un lentivirus que proporciona GFP para la visualización y resistencia a la blasticidina para la selección de células transfectadas.Como segundo paso, viroides 3D. Con las células transfectadas, se generan células mesenquimales y matriz extracelular, lo que permite la realización de cribados a gran escala de fármacos anticancerígenos en un entorno complejo in vitro en 3D. A continuación, tumor 3D.El EHF puede cultivarse in vivo en embriones de pollo para evaluar los efectos de fármacos novedosos sobre el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis. En última instancia, el tamaño del tumor y las respuestas angiogénicas pueden documentarse diariamente y tras la eutanasia. Los tumores pueden examinarse mediante GFP, ELISA e inmunohistoquímica.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los modelos de xenoinjertos por reflejo es la ECX en el manejo y la obtención de imágenes de tumores humanos. Las células tumorales humanas, junto con células estromáticas humanas de apoyo y compuestos de la matriz extracelular, pueden crecer in vivo en embriones de pollo que aún carecen de respuestas inmunitarias adaptativas. Este método puede ayudar al desarrollo de nuevas terapias y permite un cribado preclínico rápido para el tratamiento de pacientes que padecen mieloma múltiple.La demostración visual de este método es fundamental porque las células de mieloma múltiple humano sufren fácilmente apoptosis debido al estrés, y los embriones de mejilla pueden morir si se manipulan inadecuadamente o si las condiciones de cultivo ex vivo no son apropiadas. El procedimiento y todos sus pasos críticos serán demostrados por Cornelia. Hes y una técnica experimentada de nuestro laboratorio. Para este protocolo, prepare cultivos de líneas celulares de mieloma múltiple, OPM2, RPMI 8226 y células madre mesenquimales humanas a partir de médula ósea; incube las células normalmente en medio suplementado siguiendo el protocolo descrito. Transfecte un millón de células de mieloma múltiple con 100.000 partículas lentivirales.En una placa de 24 pocillos con medio de crecimiento completo, después de tres días, comience a seleccionar las células transfectadas añadiendo dos microgramos de blastina por cada mililitro de medio de cultivo o utilice 500 microgramos de neomicina por mililitro para el lentivirus EGFP disponible comercialmente. Después de dos semanas de selección, busque agrupaciones de células que expresen EGFP. Recolecte los agregados celulares, flotantes o adherentes, suspendiéndolos cuidadosamente en un tubo de centrífuga, pelete las células D-E-G-F-P a 1000 GS durante cinco minutos y expándalas como sublíneas. Después de la selección y propagación de células de mieloma múltiple que expresan GFP, verifique siempre su capacidad antes de utilizarlas en experimentos posteriores.Para comenzar, enfríe en hielo una solución de colágeno tipo I y 10 XDMM. Una vez enfriada, mezcle un volumen de uno a diez del medio 10 X-D-M-E-M en la solución de colágeno. Luego agregue hidróxido de sodio 0,2 N gota a gota para neutralizar la solución hasta un pH de 7,4.Mantenga la solución en hielo y confirme el pH con una tira reactiva. A continuación, mezcle las líneas celulares transgénicas de mieloma múltiple con las células mesenquimales humanas. Ahora, centrifugue la mezcla celular en tubos de 15 mililitros a 1000 G durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y, utilizando una pipeta P1000, resuspenda el sedimento en un mililitro de la mezcla fría de colágeno.Utilizando una punta P 100, transferir inmediatamente alícuotas de 30 microlitros de la mezcla sobre parafina estéril. En una placa de cultivo de 24 pocillos, dejar que la mezcla polimerice durante 30 minutos a 37 grados Celsius, formando así esteroides. A continuación, superponer los esteroides con un mililitro de medio preparado con diferentes tratamientos.Por ejemplo, un fármaco puede aplicarse en diferentes concentraciones. Después de 72 horas de incubación a 37 grados Celsius, documente el EFP mediante microscopía estereoscópica de fluorescencia. Luego, utilizando pinzas de mandíbulas anchas y planas, transfiera cada esteroide a un tubo de reacción para medir la expresión de GFP.Como preparación para este procedimiento, incubar huevos de pollo en una incubadora a 37 grados Celsius y 70 % de humedad durante tres días. Luego abrir los huevos y transferir los embriones a barquillas cuadradas de plástico esterilizadas de 10 centímetros, con plaquetas para cultivo celular, para lograr mayores tasas de supervivencia de embriones de pollo en cultivo ex ovo. Utilizar barquillas de plástico en lugar de placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros.Además, esterilice y previa con embarcaciones largas de PBS antes del uso. Continúe incubando los huevos ex ovo durante seis días más, durante los cuales se desarrollará la membrana corioalantoidea (CAM). Ahora prepare múltiples mielomas y células mesenquimales PHE según el procedimiento anterior, pero en una placa de seis pocillos; luego, utilizando fórceps, transfiera el esteroide como en plantas a la superficie no tratada de la CAM, aproximadamente a dos centímetros de distancia del embrión de embriones de pollo de nueve días de edad.Coloque cuatro plantas sobre cada embrión de pollo. Deje los embriones ex ovo con las plantas en la incubadora de huevos durante cinco días. Luego, documente los xenoinjertos mediante microscopía estéreo fluorescente.Después de la documentación, utilice tijeras y pinzas oftálmicas para extraer los xenoinjertos junto con algo de tejido circundante. Para medir la expresión de GFP o realizar un análisis inmunohistoquímico, comience transfiriendo cada xenoinjerto de mieloma múltiple esteroide u otro exciso a 0,5 mililitros de RIPA con inhibidores de proteasas. A continuación, use un homogeneizador sobre hielo para mezclar los tejidos; una vez homogeneizados, congele y descongele los homogenizados utilizando nitrógeno líquido y luego un baño de agua a 37 grados Celsius.Realice esto tres veces, luego centrifugue los homogenados a cuatro grados Celsius durante 20 minutos a 12.000 G y almacene los sobrenadantes. A continuación, diluya algo del sobrenadante de uno a 20 en el tampón de ensayo del kit ELIZA. Luego mida los niveles de GFP con anticuerpos anti-GFP biotinilados utilizando un kit.Comience con una fijación nocturna de los xenoinjertos excisados en paraformaldehído. Al día siguiente, deshidrate e incluya los xenoinjertos fijados. Primero, colóquelos en casetes.Luego pase las cassettes a través de una serie de alcoholes graduados. Deje que cada baño dure una hora completa y finalice el proceso con inclusión en parafina. A continuación, realice secciones de injertos heterotópicos de cinco micrones utilizando un micrótomo rotatorio de banco, y hornee las secciones de parafina recolectadas sobre portaobjetos de vidrio durante la noche a 56 grados Celsius.Al día siguiente, desparafine las secciones utilizando una serie descendente de alcohol hasta agua doblemente destilada. La preparación debe permanecer en cada baño durante solo 10 minutos. A continuación, siga el protocolo descrito para incubar con los anticuerpos primarios y secundarios respectivos y realice la detección colorimétrica con enzima y sustrato tras la contratincción con hematina, y monte los cortes con un medio de montaje sintético.Dos mielomas múltiples que expresan EGFP. Las líneas celulares se establecieron y se cultivaron durante tres días en presencia del fármaco. Las células tumorales de bortezomib y los esteroides se visualizaron entonces mediante la expresión de GFP en un microscopio estereoscópico de fluorescencia.La masa de células tumorales después del tratamiento con fármacos se cuantificó tras la homogenización de los EHP y la medición del contenido de EGFP mediante un ELISA de GFP. En otro experimento, embriones de pollo de tres días de edad se cultivaron ex ovo durante seis días. Al noveno día, se injertaron EHP de células de mieloma múltiple.Se unieron cuatro injertos de plantas a cada embrión. La sustancia objetivo, bortezomib, se aplicó tópicamente a una mol después de cinco días; las plantas desarrollaron tumores en comparación con los controles. El bortezomib inhibió el crecimiento de células de mieloma múltiple en el injerto, según la visualización de la masa tumoral fluorescente.Se extrajo un injerto individual de tres animales diferentes, se homogenizaron y posteriormente se midieron mediante ELISA de GFP. En comparación con los controles, el tejido tratado con bortezomib presentó una masa significativamente menor de células de mieloma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos si sus células cancerosas de interés se cultivan sobre embriones de pollo para analizar el crecimiento tumoral, la génesis y la invasión en el tejido del huésped tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del mieloma múltiple exploraran compuestos o fármacos novedosos en un organismo modelo de fácil manejo, lo cual es imprescindible para las pruebas preclínicas de fármacos.

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El uso de PCR cuantitativa, se demuestra cómo la bien establecida chica modelo CAM se puede utilizar para analizar cuantitativamente la metástasis de células tumorales humanas a órganos distantes.

Análisis cuantitativo de la metástasis del cáncer utilizando un modelo de embrión aviar

Este video muestra el procedimiento de inyectar células cancerosas por vía intravenosa en la vasculatura de la membrana corioalantoidea del pollo para generar un modelo de metástasis de cáncer CAM. Las células inyectadas eventualmente forman colonias dispersas de células cancerosas individuales, lo que permite el estudio de la invasión del cáncer y la metástasis.

Inyección intravenosa de células cancerosas en la vasculatura de la membrana corioalantoidea de pollo: un procedimiento para establecer un modelo de cáncer de membrana corioalantoidea para estudiar la invasión y metástasis del cáncer

Xenoinjertos tumorales humanos en ratones inmunodeficientes son herramientas valiosas para el estudio de la biología del cáncer. Se describen los protocolos específicos para generar los xenoinjertos subcutáneos y intrahepática de células de carcinoma hepatocelular humano o fragmentos tumorales. La regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial en ratones receptores se presenta como una estrategia para facilitar el injerto intrahepática.

Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

La técnica establecida para inocular ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios requiere laparotomía y la movilización de la vejiga. Este procedimiento inflige una morbilidad significativa en los ratones, es técnicamente difícil y consume mucho tiempo. Lo tanto, desarrolló una alta precisión, abordaje percutáneo utilizando la guía del ultrasonido.

Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga

La membrana corioalantoidea (CAM) del pollo es inmunodeficiente y altamente vascularizada, lo que la convierte en un modelo natural in vivo de crecimiento tumoral y angiogénesis. En este protocolo, describimos un método confiable para el crecimiento de tumores tridimensionales de carcinoma hepatocelular vascularizado (CHC) utilizando el ensayo CAM.

los<em&gt; En Ovo</em&gt; Chick corioalantoidea de membrana (CAM) Ensayo como un modelo de xenoinjerto eficiente de carcinoma hepatocelular

El cáncer de próstata es la segunda causa más común de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. Un modelo ortotópico de cáncer proporciona un enfoque útil para comprender la biología del cáncer de próstata y evaluar la eficacia de los regímenes terapéuticos. Este protocolo describe los pasos detallados necesarios para establecer un modelo ortotópico de cáncer de próstata en ratones.

Preclínica modelo murino ortotópico de cáncer de próstata humano

El carcinoma metastásico de células renales de células claras es una enfermedad sin un modelo animal completo para una investigación preclínica exhaustiva. Este protocolo ilustra dos nuevos modelos animales para la enfermedad: el modelo de ratón implantado ortopédicamente y el modelo de membrana corioalantoica de pollo, que demuestran metástasis pulmonar similar a los casos clínicos.

Comparación de metastática célula sin fin renal Modelo establecido en el riñón del ratón y en la membrana chorioalantoica del pollo

Presentamos el modelo de membrana corioalantoica de pollo como un modelo alternativo, trasplantable, in vivo para el injerto de líneas celulares de cáncer ginecológico y urológico y tumores derivados del paciente.

Uso de la membrana chorioalantoica de pollo en vivo modelo para estudiar cánceres ginecológicos y urológicos

El presente protocolo describe el método para establecer un modelo de ratón de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) utilizando tejido de osteosarcoma humano.

Establecimiento de un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de un paciente con tejidos de osteosarcoma humano

Este protocolo describe el xenoinjerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B y T derivadas del paciente, que ocurre 4 días después de la inyección.

En Ovo Xenoinjerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-ALL)

Aprenda a establecer un modelo de xenoinjerto de mieloma múltiple humano en embriones de pollo para evaluar el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis. Esta técnica permite el cribado preclínico de fármacos anticancerígenos en un entorno 3D vivo.

Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis (Video) | JoVE Journal

Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis

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