Un

El objetivo general del siguiente experimento consiste en aplicar este modelo de latencia in vitro para estudiar mecanismos moleculares y celulares y generar hipótesis que puedan evaluarse en modelos in vivo más biológicamente complejos. Esto se logra cultivando células de cáncer de mama positivas para estrógenos en placas de cultivo tisular codificadas con fibrina a densidad congénica, donde sus interacciones son principalmente con el sustrato y no entre ellas. Como segundo paso, se activa un estado de latencia en algunas de las células positivas para estrógenos, sostenido y mantenido por FGF-2 y fibronectina, representativo de las células de cáncer de mama en la médula ósea.

A continuación, el sistema se perturba mediante la adición de anticuerpos, inhibidores, péptidos o ácidos nucleicos con el fin de interrumpir diversos aspectos fenotípicos y moleculares de las células inactivas y determinar su papel en el mantenimiento del estado de latencia. Los resultados muestran el número y la apariencia de colonias en crecimiento y latentes, que son el resultado del tratamiento de células incubadas con FGF dos en placas recubiertas de fibronectina. Este método puede ayudar a responder qué vías de señalización, moléculas de adhesión u otros mecanismos moleculares específicos son responsables del desarrollo y mantenimiento de la latencia en células de cáncer de mama dependientes del estrógeno ubicadas en el microambiente de la médula ósea.

Para comenzar, aspire el medio de cultivo de las placas que tienen aproximadamente un 50 % de confluencia con líneas celulares CF siete y enjuáguelas con PBS precalentado. A continuación, agregue un mililitro de solución de tripsina-EDTA al punto 25 disuelta en medio DMEM con alta concentración de glucosa y sin suero fetal de ternera. Incube las placas durante uno a cuatro minutos a 37 grados Celsius mientras las células comienzan a desprenderse.

Una vez que las células se desprendan de la placa y comiencen a formar una suspensión de células individuales, rompa cualquier grumo celular remanente pipeteando varias veces hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de dos mililitros. Si persisten grumos celulares después de cuatro minutos de tripsina, deseche las células y prepare nuevas células en cultivo, ya que las células que siguen adheridas entre sí después de cuatro minutos probablemente introduzcan errores al contar el número de colonias. Siembre las células tratadas con tripsina y resuspenda a 1.500 células por mililitro en medio de cultivo. Utilice una pipeta de cinco mililitros para mezclar suavemente la suspensión celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, cuente las células y verifique que la suspensión consista principalmente en células individuales mediante un contador celular automatizado.

Esto también puede hacerse manualmente utilizando una cámara de recuento bajo un microscopio de contraste de fases. A continuación, aspire tres mililitros de la suspensión celular y distribuya un mililitro en dos de los pocillos de una placa revestida con fibronectina de 24 pocillos a la vez. Para optimizar la distribución espacial de las células, asegúrese de pipetear la suspensión en el centro del pocillo y no someta la placa a movimientos adicionales antes de que las células se asienten y se adhieran.

Devuelva la suspensión celular restante a la mezcla maestra de células y, nuevamente, mezcle las células antes de aspirar otros tres mililitros. Este procedimiento reducirá la variabilidad en el número de células, ya que las células sedimentan continuamente en el tubo y la pipeta trabaja rápidamente para distribuir los grandes volúmenes de células, porque permitir que las células permanezcan en suspensión a temperatura ambiente y concentración de CO2 modulará su potencial congénico; incube las células a 37 grados Celsius y 5 %CO2. Esto se considera el día menos uno.

En la cronología del experimento. En el día cero del ensayo, reemplace el medio con un mililitro de medio fresco o de medio fresco que contenga 10 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos. El pequeño número de células en un pocillo después de seis días no afectará significativamente la composición de nutrientes o citoquinas ni el pH del medio original.

El tercer día, añada 100 microlitros de una solución que contenga 10 veces la concentración final prevista de un agente perturbador, como un inhibidor de la PI tres quinasa, LY 2 9 4 0 0 2, un control negativo LY 3 0 3 5 1 1 o un control de medio, al mililitro de medio ya presente en los pocillos, y deje que las soluciones se mezclen por difusión. Devuelva la placa al incubador durante tres días adicionales. El sexto día, disuelva 0,1 % de violeta cristal en una solución de etanol al dos por ciento y borato sódico 10 milimolar.

A pH nueve, aspire entonces el medio de los pocillos y agregue un mililitro de la solución de violeta de cristal a cada pocillo durante 20 minutos. Configure la estación de lavado colocando un recipiente con hielo en el fregadero y haciendo correr agua continuamente dentro del recipiente; lave las placas sumergiéndolas en el agua con las aberturas de los pocillos orientadas hacia abajo en un ángulo agudo respecto al recipiente. Incline la placa hasta una posición horizontal una vez sumergida para que las aberturas de los pocillos queden orientadas hacia abajo.

Luego incline la placa de nuevo hasta un ángulo agudo y retírela de una sola vez con un movimiento suave y continuo. Repita la inmersión dos o tres veces hasta que el agua en el fondo de los pocillos ya no aparezca azul. A continuación, coloque las placas boca abajo sobre toallas en la superficie del banco para que sequen durante la noche.

Una vez seco, coloque la placa bajo un microscopio invertido de contraste de fases y cuente el número de colonias en crecimiento y colonias inactivas en cada pocillo. A una magnificación de 40 x, cuente como colonias en crecimiento aquellas con más de 30 células y como colonias inactivas aquellas con 12 células o menos. Se muestra aquí el aspecto típico de una colonia en crecimiento y una colonia inactiva.

Las colonias en crecimiento contienen más de 30 células, y las colonias inactivas contienen 12 células o menos, que son muchas veces más grandes que las células en crecimiento, con grandes relaciones citoplasma/núcleo, sin la adición de FGF dos al cultivo. Las colonias están representadas predominantemente por clones en crecimiento. Aunque en presencia de FGF dos, la gran mayoría de los clones están inactivos, el efecto de agentes adicionales también puede evaluarse utilizando este sistema. Aquí, se añadieron dos agentes perturbadores en concentraciones previamente determinadas a los pocillos el día tres del ensayo Congénico.

La figura representa una inhibición preferencial de los clones durmientes por el inhibidor de la quinasa PI3K LY294002, pero una falta de efecto por el control negativo LY303511. Estos experimentos pueden utilizarse para ayudar a comprender los elementos que regulan la latencia y la resistencia a la terapia. Aquí, las células durmientes sobrevivientes tratadas con el inhibidor de la quinasa PI3K perdieron su apariencia extendida, se volvieron pequeñas y dendríticas y presentaron signos de estrés.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer este ensayo congénico para cultivar células en estado de latencia, cómo perturbar las células mediante la adición de inhibidores específicos o agentes perturbadores tras establecer la latencia y cómo cuantificar el efecto de los agentes perturbadores. Este ensayo puede utilizarse para evaluar tanto resultados cuantitativos como cualitativos mediante el conteo de colonias latentes o la medición de cualquier número de eventos inmuno fenotípicos, ultraestructurales o moleculares en las células latentes y perturbadas. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.