Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar la neuroprotección tras el acondicionamiento hipóxico repetitivo o RHP, midiendo simultáneamente el volumen del infarto y la integridad de la barrera hematoencefálica. Esto se logra sometiendo a ratones a nueve exposiciones hipóxicas estocásticas que varían tanto en duración como en intensidad, para proporcionar protección neurovascular frente al accidente cerebrovascular. Luego se induce un accidente cerebrovascular en el ratón y se sigue con la inyección de azul de Evans.

El azul de Evans se une selectivamente a la albúmina y permite cuantificar la alteración de la barrera hematoencefálica tras el sacrificio del animal después de la inyección. El cerebro se extrae y tiñe con TTC para cuantificar el volumen del infarto. Los resultados muestran beneficios neuroprotectores del acondicionamiento repetitivo por hipoxia en ratones tras un accidente cerebrovascular isquémico.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el acondicionamiento hipóxico con exposición única es que el RHP produce neuroprotección durante al menos ocho semanas en ratones. Este método de cuantificación dual puede responder preguntas clave en la investigación del accidente cerebrovascular, como cómo medir simultáneamente los volúmenes de infarto en la alteración de la barrera hematoencefálica, aunque este método pueda utilizarse para obtener información sobre el accidente cerebrovascular isquémico, el RHP también puede aplicarse a otros estados de enfermedad proinflamatorios sistémicos y basados en el SNC. Para comenzar, divida los ratones en dos grupos.

El grupo RHP, que recibe exposiciones de 8 % y 11 % de oxígeno, y el grupo control, que recibe exposiciones de 21 % de oxígeno simultáneamente, retiran la tapa superior del filtro de cada jaula y colocan la jaula, con las botellas de alimento y agua intactas, dentro de las cámaras conectadas a sus respectivos tanques de oxígeno. Cierre y asegure la tapa de la cámara. Abra la válvula principal de gas de los tanques y ajuste el flujo inicial para cada cámara de inducción a dos litros por minuto o LPM.

Después de cinco minutos de exposición, reduzca el caudal a un LPM para el resto de la exposición. Al final de la exposición, reduzca el caudal a cero LPM y cierre la válvula de gas. Para los tanques.

Abra las tapas de las cámaras y sustituya la tapa superior con filtro en cada jaula. Coloque las jaulas en condiciones de alojamiento estándar hasta la siguiente exposición hipóxica. Rocíe cada cámara de inducción con un desinfectante y desodorizante después de cada uso.

Exponga tanto a los ratones RHP como a los controles a la misma hora del día durante el transcurso de las dos semanas del protocolo. Luego, realice una oclusión transitoria de la arteria cerebral media o A-T-M-C-A-O, como se describe en el texto. La inyección de EB debe realizarse 22 horas después de la reperfusión y debe circular por el torrente sanguíneo durante dos horas antes de la sacrificio para la tinción NTTC.

Prepare la cantidad de EB necesaria para la inyección. Luego aspire la cantidad deseada de temperatura ambiente en una jeringa de insulina de 0,3 cc. Con una aguja de calibre 29, sujete al ratón utilizando un sujetador de fondo plano.

Sujete la cola de modo que la vena lateral quede en la parte superior. Las venas laterales se encuentran a ambos lados de la línea central de la cola. Sujete la punta de la cola para mantener al ratón estable durante la inyección.

Introduzca la aguja en la vena aproximadamente de tres a cinco milímetros. Teniendo cuidado de no perforar la vena, inyecte todo el colorante durante el transcurso de un minuto. Si la solución está entrando en la vena, debería haber una resistencia mínima al aplicar presión sobre la jeringa.

Confirme la administración sistémica exitosa de EB mediante un cambio inmediato de color en las extremidades caudales y los ojos del ratón. Retire la aguja de la cola y aplique suavemente presión con gasa limpia para detener la hemorragia. Comience a contar el tiempo.

Cuando la piel del ratón se vuelva azul, permita que el EB circule durante dos horas para que penetre la barrera hematoencefálica debilitada. La perfusión y la tinción con TTC deben realizarse 24 horas después de la reperfusión, es decir, 24 horas después de la T-M-C-A-O y dos horas después de la administración de EB; sacrifique al animal con una sobredosis de isoflurano en una pequeña cámara de inducción. La perfusión debe comenzar inmediatamente después del sacrificio para minimizar la autólisis, que comienza en ausencia de oxígeno tras la muerte.

Sujete rápidamente al animal sobre una plataforma de espuma de poliestireno con los antebrazos fijados a través de las patas. Realice una incisión lateral a través de la pared abdominal desde la línea media, justo debajo de la caja torácica. Corte cuidadosamente el diafragma para exponer el corazón.

Inicie la bomba de perfusión a un flujo de cinco mililitros por minuto con una jeringa de 60 cc llena con solución salina tamponada con fosfato 0,01 molar fría con hielo o PBS conectada a una aguja de infusión alada de calibre 27. Coloque la punta de la aguja aproximadamente 0,5 centímetros dentro del ventrículo izquierdo del corazón y corte el atrio derecho. Durante la perfusión, debe fluir progresivamente sangre venosa diluida desde el atrio hasta que aparezca sangre venosa. Perfunda 30 mililitros de PBS 0,01 molar incolora a través del corazón.

A continuación, agregue cinco mililitros de solución de TTC en 20 frascos transparentes para centelleo. Inmediatamente después de la perfusión, seccione la cabeza de los animales y extraiga los cerebros utilizando tijeras pequeñas y, si es necesario, una espátula. Verifique que el hemisferio contralateral a la arteria cerebral media ocluida aparezca pálido, sin filtración evidente de EB ni edema.

A continuación, vierta PBS en una matriz cerebral de acrílico diseñada para obtener secciones coronales de 1,0 milímetro de grosor de un cerebro de ratón. Coloque el cerebro con la cara dorsal hacia arriba en la matriz e inmediatamente vierta PBS sobre el cerebro. Mantenga el cerebro húmedo.

Retire los bulbos olfativos insertando una cuchilla de acero inoxidable de 0,21 milímetros de grosor en la segunda ranura desde el lado rostral de la matriz. Luego, retire el cerebelo insertando una cuchilla en la cuarta ranura desde el lado caudal de la matriz. Inserte una cuchilla en la ranura central de las ranuras restantes en la matriz.

Luego, inserte las cuchillas restantes dividiendo uniformemente el tejido restante para asegurar la distribución más homogénea posible del tejido durante el corte. Una vez que se hayan insertado todas las cuchillas, agregue una o dos gotas de PBS al cerebro para humedecerlo. A continuación, retire las cuchillas una por una de la matriz, comenzando por la región rostral.

Guarde las siete primeras rebanadas para el análisis con TTC. Después de T-M-C-A-O, use una espátula pequeña para transferir cuidadosamente las rebanadas desde la cuchilla al vial lleno de TTC. Una vez que todas las secciones estén en el vial, tápelo y colóquelo en un baño de agua tibia hasta que las secciones se vuelvan rosadas.

Gire suavemente el frasco en el baño, si es necesario, para evitar la superposición de secciones, lo que podría provocar una tinción desigual. Luego deseche el TTC y vierta una solución de paraformaldehído al 4% en el frasco para cubrir las secciones cerebrales. Esto detiene la reacción química del TTC.

Organice inmediatamente las secciones sobre un portaobjetos de vidrio limpio de una por tres pulgadas y oriente las secciones de rostral a caudal cuando estén colocadas sobre el portaobjetos. Escanee el portaobjetos. Utilizando un escáner estándar, configure la resolución a un mínimo de 600 DPI para el análisis de imágenes.

Asegúrese de incluir el nombre del animal y una regla métrica en la imagen escaneada. Finalmente, dé la vuelta al portaobjetos y escanee el reverso para garantizar que se recopilen todos los datos. RHP reduce los volúmenes de infarto en un 46 % en comparación con los ratones de control, pero no tiene efecto sobre la hinchazón hemisférica derivada de los datos de TTC en los mismos animales.

La RHP reduce la alteración de la barrera hematoencefálica definida por la fuga de Azul de Evans normalizada al hemisferio contralateral, con tinciones representativas de TTC tanto de los tratados con RHP como de los controles expuestos al 21% de oxígeno. Se muestran ratones con los volúmenes de infarto correspondientes y la fuga de Azul de Evans indicados debajo de cada muestra. El lado ipsilateral corresponde al hemisferio cerebral isquémico y el contralateral al lado no afectado del cerebro.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar inyectar el azul de Evans 22 horas después de la fusión y permitir que circule durante dos horas antes del sacrificio del animal tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación preclínica del accidente cerebrovascular exploraran los mecanismos de protección endógena frente al accidente cerebrovascular en ratones. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo medir el efecto neuroprotector del RHP mediante la cuantificación dual de la integridad de la barrera hematoencefálica y los volúmenes de infarto.