Name: Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprende a cuantificar la neuroprotección mediante precondicionamiento hipóxico repetitivo en ratones. Este método mide simultáneamente el volumen del infarto y la integridad de la barrera hematoencefálica tras oclusión de la arteria cerebral media.

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Un agradecimiento especial al laboratorio Gidday por su trabajo en el desarrollo del protocolo RHP, así como al Neuro-Models Facility (UTSW) por su asistencia en las cirugías de tMCAo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Americana del Corazón (AMS), el Centro Haggerty para Lesiones y Reparaciones Cerebrales (UTSW; AMS), y la Fundación para la Investigación de la Parálisis Espástica del Distrito Internacional de Illinois-Este de Iowa de Kiwanis International (JMG).

Los autores no tienen nada que revelar.

Una sola exposición a la hipoxia sistémica (es decir, 2 hr de 11% O 2) en ratones protege &quot;transitoriamente&quot; el cerebro de tMCAo, 29 es decir, la respuesta epigenética al desafío de preacondicionamiento hipóxica es de corta duración, y el fenotipo de la línea de base se restablece dentro de día. Presentaciones repetitivo del estímulo hipóxico preacondicionamiento se extienden dramáticamente la duración del fenotipo neuroprotector. 6 Muchos estudios han demostrado que l...

Como la principal causa de discapacidad en los adultos y la cuarta causa principal de muerte, accidente cerebrovascular es uno de los estados de enfermedad más debilitantes que enfrenta la población adulta de los Estados Unidos. 1 Los modelos animales de accidente cerebrovascular permiten para la investigación experimental de nuevos métodos de reducción de la lesión isquémica y mejorar la recuperación después de un accidente cerebrovascular. Una vía novedosa para este tipo de investigación traslacional se preacondicionamiento. Preacondicionamiento es el uso intencional de un estímulo no perjudicial para reducir el daño de una posterior, y más grave, lesiones. 2 hipóxico preacondicionamiento se ha demostrado que producen cambios pleiotrópicos en el cerebro que proporcionan protección contra el accidente cerebrovascular en tanto in vivo e in vitro . 3 Sin embargo, una sola exposición a la hipoxia sólo ofrece neuroprotección corto plazo, lo que induce a menos de 72 horas de la tolerancia frente a la isquemia en ratones adultos. 4 incluso después de cuatro semanas de exposiciones diarias 14 hr a la hipoxia hipobárica, Lin et al. found neuroprotección que solamente se mantuvo durante una semana. 5 precondicionamiento hipóxico repetitiva (RHP) se caracteriza por las variaciones estocásticas en la frecuencia, duración e intensidad de las exposiciones hipóxicas. En contraste con un único reto preacondicionamiento, RHP induce un fenotipo cerebroprotectora que dura hasta ocho semanas en ratones. 6 RHP redujo los volúmenes de infarto, barrera hematoencefálica (BBB) ​​perturbación, inflamación vascular y diapedesis de leucocitos durante semanas después de la exposición hipóxica definitiva . RHP reduce específicamente la inflamación en el cerebro isquémico mediante la reducción de las células T, monocitos, macrófagos y las poblaciones, mientras que el mantenimiento de las poblaciones de células B en el hemisferio isquémico. 7 De hecho, RHP induce un fenotipo inmunosupresor en ratones antes de cualquier lesión del SNC, incluido el accidente cerebrovascular. Células B tratados con RHP aisladas de ratones sanos tratados-RHP exhibieron un fenotipo antiinflamatorio único, con una regulación a la baja tanto de la presentación de antígenos y la producción de anticuerpos. Losreducción general en mecanismos inmunes adaptativos pro-inflamatorias hace RHP una excelente metodología para inducir inmunosupresión endógena no sólo para enfermedades inflamatorias del SNC-específicos, sino también modelos de lesión o enfermedad sistémica que incluyen una patología pro-inflamatorio. RHP reduce tanto el volumen del infarto y la disrupción de la BHE tras una oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAo). Los modelos animales de accidente cerebrovascular, tales como el comúnmente usado tMCAo, mejorar dramáticamente la comprensión de la fisiopatología del accidente cerebrovascular, así como el diseño de Neurotherapeutics más eficaces. Primero desarrollado por Koizumi et al., En 1986, el procedimiento tMCAo 8 es un método ampliamente utilizado de inducir accidente cerebrovascular en roedores y uno de los métodos preferidos para la investigación de la inflamación después de la reperfusión. Como los métodos para tMCAo evolucionan, el uso más reciente de filamentos recubiertos de silicona reducir aún más el riesgo de hemorragia subaracnoidea en comparación con otros modelos de 9,10 &lt;/ Sup&gt; y mejorar la fiabilidad, aunque por desgracia tMCAo menudo produce una amplia variación en los volúmenes de infarto. 11-13 La mayor parte de estos estudios delinear regiones de infarto en el cerebro secciones coronales mediante tinción con cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio (TTC), considerado un estándar de oro para la cuantificación del infarto debido a que es una manera simple y barata de producir vivos, resultados replicables. TTC sirve como un sustrato de deshidrogenasas presentes en las mitocondrias. Cuando rodajas de cerebro están expuestos a la solución de TTC, TTC se toma selectivamente en células vivas donde su producto de reducción no soluble, formazán, precipita a un color rojo intenso en la mitocondria viables. Debido a la disfunción mitocondrial en el tejido isquémico, este tejido permanece blanco, lo que permite la diferenciación del tejido dañado y sano. 14 RHP también reduce la acreditación interrupción en el hemisferio isquémico. 6 Por lo tanto, la doble cuantificación de acreditación integridad dentro de la misma blluvias como el volumen del infarto basado en TTC Determinaciones 15 proporcionaría información útil sobre la eficacia plena de la protección endógena, y posibles relaciones causales entre la disrupción de la BHE y el infarto en los animales no tratados y tratados. La afluencia de sangre periférica a través de una acreditación interrumpido, secundaria a un accidente cerebrovascular, aumenta poblaciones de leucocitos, citoquinas pro-inflamatorias, estrés oxidativo, edema vasogénico y transformación hemorrágica en el hemisferio isquémico, en última instancia, el aumento de las tasas de infección y mortalidad en pacientes con ictus isquémico 16,17. Un método común de medir la disrupción de la BHE en modelos animales es a través de la cuantificación de azul de Evans (EB) de fugas de tinte en el cerebro. 15,18-21 EB se une selectivamente a la albúmina sérica, una proteína globular (MW = 65 kDa) que no atraviesa la BBB en animales no lesionados. 22 Tras el accidente cerebrovascular isquémico, EB se infiltra en el cerebro, y emite fluorescencia a 620 nm, lo que permite la medición de la densidad óptica within el parénquima lesionado perfundido. 22 La densidad óptica es directamente proporcional a la permeabilidad de la BBB cuando EB ha sido lavada fuera de la vasculatura cortical post-mortem por perfusión transcardiaca. Con el procesamiento inmediato de los cerebros teñidas con TTC en animales con administración EB, tanto el volumen del infarto y la disrupción de la BHE se pueden cuantificar de manera efectiva. Cabe señalar, sin embargo, que el daño neuronal y la disrupción de la BHE no son procesos concomitantes en el cerebro post-accidente cerebrovascular, 23,24 lo que la selección de tiempo de sacrificio es una consideración importante. El protocolo que sigue detalla el método RHP, el método tMCAo para inducir una oclusión arterial temporal que los modelos de las oclusiones de la arteria cerebral media en pacientes humanos, y los métodos histológicos duales para determinar neurales y vasculares puntos finales de lesiones accidente cerebrovascular. TTC mide la muerte celular y el daño tisular acumulativa, lo que permite la cuantificación de un infarto vol generalume, mientras que EB ofrece para la cuantificación hemisférica de acreditación daños.

<table><tbody><tr><td>Caudalímetros, reguladores</td><td>VetEquip, Inc</td><td>Pedido especial</td><td>Cuatro caudalímetros están conectados a un tubo de PVC flexible de 6,0 mm que se conecta al puerto de entrada de cada cámara de inducción con un conector hembra de plástico. Estos medidores de flujo están atornillados a una barra de metal de 6.5" x 1" x 1". Esta barra metálica está atornillada a un manómetro MI-246-P con una salida DISS. Este manómetro y equipo de caudalímetro se puede conectar a cada nuevo cilindro de gas con una llave.</td></tr><tr><td>21% O2 tanque</td><td>AirGas</td><td>OX USP200</td><td></td></tr><tr><td>11% O2 tanque</td><td>AirGas</td><td>Pedido</td><td></td>especial</tr><tr><td>8% O2 tanque&nbsp;</td><td>AirGas</td><td>Pedido</td><td></td>especial</tr><tr><td>Cámaras de inducción de 15 L</td><td>VetEquip</td><td>941454</td><td></td></tr><tr><td>Moor Laber Dopper Flow&nbsp;</td><td>Instrumentos de Moro&nbsp;</td><td>moorVMS-LDF1-HP</td><td>Sonda de 0,8 mm de diámetro&nbsp;</td></tr><tr><td>Iluminador de alta intensidad&nbsp;</td>Microscopio estereoscópico con zoom <td>Nikon</td><td>NI-150</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>NIkon</td><td>SMZ800</td><td>Se pueden utilizar otros microscopios quirúrgicos.</td></tr><tr><td>Kent Scientific Right Temperature CODA</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>Descontinuado</td><td>El reemplazo recomendado es PhysioSuite con RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).</td></tr><tr><td>Incubadora Hovabator</td><td>Stromberg's</td><td>2362-E</td><td>Nuestro modelo es el 2362N. 2362E es un modelo posterior e incluye un termostato electrónico.</td></tr><tr><td>V010 Sistema de anestesia&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>901807</td><td>Incluye: manguera de oxígeno de alta presión de diez pies, marco, medidor de flujo, conjunto de descarga de oxígeno, vaporizador, circuito de respiración, cámara, conos nasales, tubo de evacuación de gases residuales y dos filtros VapoGuard</td></tr> de <tr><td>isoflurano de 250 ml;</td><td>Butler Schein</td><td>NDC-11695</td><td></td></tr><tr><td>D-6 Vet Trim Recortadora inalámbrica para animales&nbsp;</td><td>Andis&nbsp;</td><td>#23905</td><td>Las cuchillas de repuesto están disponibles en Andis (#23995)</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-867&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Q-tips</td><td>Múltiples vendedores&nbsp;</td><td>Número de catálogo no disponible&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de gasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>67622</td><td></td></tr><tr><td>Paño quirúrgico</td><td>Fisher Scientific</td><td>GM300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suturas de seda&nbsp;</td><td>Look/Div Especialidades Quirúrgicas</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>Suturas de Nylon</td><td>Look/Div Especialidades Quirúrgicas</td><td>SP185</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 pinzas (2)&nbsp;</td><td>Herramientas de Bellas Ciencias&nbsp;</td><td>11251-35</td><td>Angulado 45&grados;</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas Herramientas de</td><td>ciencia fina&nbsp;</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>3 mm Vannas</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS600177</td><td>Hoja recta</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats&nbsp;</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>Filamentos oclusivos</td> Universidad de <td>Washington</td><td>Pedido de especialidad</td><td>Los filamentos están recubiertos de silicona en la Universidad de Washington y se proporcionan a las instalaciones de UTSW por una tarifa.</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma Aldritch</td><td>E2129-10G</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro &nbsp;</td><td>Sigma Aldritch</td><td>WHA1001150</td><td>150 mm, círculos, Grado 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Pesaje de barcos</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-101</td><td>2.5" de diámetro</td></tr><tr><td>0.9% Inyección de cloruro de sodio USP&nbsp;</td><td>Farmacia Baxter&nbsp;</td><td>2B1321</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina de 0,3 cc con aguja de calibre 29</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Restrictivo de fondo plano&nbsp;</td><td>Braintree Scientific&nbsp;</td><td>FB&nbsp; M</td><td>2.0" diámetro</td></tr><tr><td>TTC Sigma</td><td></td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Múltiples vendedores&nbsp;</td><td>Número de catálogo no disponible&nbsp;</td><td>Los tubos de centelleo con TTC pueden sostenerse manualmente bajo agua caliente corriente como alternativa al baño de agua.</td></tr><tr><td>Tablero de espuma de poliestireno</td><td>Múltiples vendedores&nbsp;</td><td>Número de catálogo no disponible&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de jeringa grande</td><td>PumpSystems Inc</td><td>P-SYRKIT-LG</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusión</td><td>PumpSystems Inc</td><td>NE-300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 60 cc</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9203256</td><td></td></tr><tr><td>27 calibre</td><td>Kawasumi Laboratories, Inc</td><td>D3K1-25G 1</td><td></td></tr><tr><td>vial de centelleo de 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-367-126</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de acero inoxidable</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>Alto acrílico 1,0 mm cerebro de ratón, coronal</td><td>CellPoint Científico&nbsp;</td><td>Número de catálogo no disponible&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de acero inoxidable de 0,21 mm, 25 unidades</td><td>CellPoint Scientific&nbsp;</td><td>Número de catálogo no disponible&nbsp;</td><td>Las cuchillas de criostato reutilizables son una alternativa económica.</td></tr><tr><td>4% paraformaldehído Santa</td><td>Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HP Scanjet G4050</td><td>Múltiples vendedores&nbsp;</td><td>Número de catálogo no disponible&nbsp;</td><td>Otros escáneres comerciales son adecuados para este paso del protocolo.</td></tr><tr><td>ImagenJ&nbsp;</td><td>Número de catálogo del Instituto Nacional de Salud</td><td>no disponible&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>Mettler Toledo&nbsp;</td><td>Horno compacto de precisión XSE 205U</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>PR305225M</tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de 1,7 ml (Eppendorfs)</td><td>Denville Scientific&nbsp;</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-9</td><td></td></tr><tr><td>Epoch Microplate Spectrophotometer&nbsp;</td><td>BioTek&nbsp;</td><td>Número de catálogo no disponible&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de protección neurovascular siguiendo repetitivo hipóxico precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Modelos animales experimentales de ictus son herramientas muy valiosas para la comprensión de la patología de carrera y el desarrollo de estrategias de tratamiento más eficaces. Un protocolo de 2 semanas para precondicionamiento hipóxico repetitivo (RHP) induce una protección a largo plazo contra las lesiones del sistema nervioso central (SNC) en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico focal. RHP consta de 9 exposiciones estocásticos a la hipoxia que varían tanto en duración (2 o 4 hr) y la intensidad (8% y 11% O 2). RHP reduce los volúmenes de infarto, barrera hematoencefálica (BBB) ​​perturbación, y la respuesta inflamatoria posterior al accidente cerebrovascular durante semanas después de la última exposición a la hipoxia, lo que sugiere una inducción a largo plazo de un fenotipo SNC-protectora endógena. La metodología para la cuantificación de doble el volumen del infarto y disrupción de la BHE es eficaz en la evaluación de la protección neurovascular en ratones con RHP u otros neuroprotectores putativos. Adultos ratones macho Swiss Webster fueron acondicionados previamente por RHP o exposiciones de duración equivalente al 21% de O <sub&gt; 2 (es decir, aire ambiente). Una oclusión media transitoria 60 min arteria cerebral (tMCAo) fue inducida 2 semanas después de la última exposición hipóxica. Tanto la oclusión y reperfusión fueron confirmados por transcraneal flujometría Doppler láser. Veintidós horas después de la reperfusión, azul de Evans (EB) se administró por vía intravenosa a través de una inyección en la vena de la cola. 2 horas más tarde, los animales fueron sacrificados por sobredosis y secciones cerebrales isoflurano se tiñeron con cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio (TTC). Los volúmenes de infarto fueron luego cuantificados. A continuación, EB se extrajo a partir del tejido durante 48 hr para determinar disrupción de la BHE después de tMCAo. En resumen, RHP es un protocolo simple que puede ser replicado, con un costo mínimo, para inducir protección neurovascular endógeno a largo plazo de una lesión derrame cerebral en ratones, con el potencial de la traducción de otros estados de enfermedad pro-inflamatorias CNS-basados ​​y sistémicos.

Este estudio incluyó a 25 ratones macho Swiss Webster que eran las 10 semanas de edad en el inicio de la asignación al azar en RHP (n = 10) o 21% de O 2 (n = 15) grupos. Dos semanas después de la exposición final RHP, se realizaron procedimientos quirúrgicos, con grupos cegados y contrapeso entre los días. Siguiendo tMCAo, 1 ratón murió durante la recuperación postoperatoria y 1 ratón fue excluido del estudio, ya que no cumplía con el criterio CBF reperfusión. Ambos ratones fueron excluidos del grupo 21% de <...

Este protocolo describe el precondicionamiento hipóxico repetitivo, o exposiciones breves a la hipoxia sistémica que reducen los volúmenes de infarto y la interrupción de la barrera hematoencefálica después de una oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. También detalla la cuantificación dual del volumen del infarto y la alteración de la barrera hematoencefálica después de un accidente cerebrovascular para evaluar la eficacia de la protección neurovascular.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar la neuroprotección tras el acondicionamiento hipóxico repetitivo o RHP, midiendo simultáneamente el volumen del infarto y la integridad de la barrera hematoencefálica. Esto se logra sometiendo a ratones a nueve exposiciones hipóxicas estocásticas que varían tanto en duración como en intensidad, para proporcionar protección neurovascular frente al accidente cerebrovascular. Luego se induce un accidente cerebrovascular en el ratón y se sigue con la inyección de azul de Evans.El azul de Evans se une selectivamente a la albúmina y permite cuantificar la alteración de la barrera hematoencefálica tras el sacrificio del animal después de la inyección. El cerebro se extrae y tiñe con TTC para cuantificar el volumen del infarto. Los resultados muestran beneficios neuroprotectores del acondicionamiento repetitivo por hipoxia en ratones tras un accidente cerebrovascular isquémico.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el acondicionamiento hipóxico con exposición única es que el RHP produce neuroprotección durante al menos ocho semanas en ratones. Este método de cuantificación dual puede responder preguntas clave en la investigación del accidente cerebrovascular, como cómo medir simultáneamente los volúmenes de infarto en la alteración de la barrera hematoencefálica, aunque este método pueda utilizarse para obtener información sobre el accidente cerebrovascular isquémico, el RHP también puede aplicarse a otros estados de enfermedad proinflamatorios sistémicos y basados en el SNC. Para comenzar, divida los ratones en dos grupos.El grupo RHP, que recibe exposiciones de 8 % y 11 % de oxígeno, y el grupo control, que recibe exposiciones de 21 % de oxígeno simultáneamente, retiran la tapa superior del filtro de cada jaula y colocan la jaula, con las botellas de alimento y agua intactas, dentro de las cámaras conectadas a sus respectivos tanques de oxígeno. Cierre y asegure la tapa de la cámara. Abra la válvula principal de gas de los tanques y ajuste el flujo inicial para cada cámara de inducción a dos litros por minuto o LPM.Después de cinco minutos de exposición, reduzca el caudal a un LPM para el resto de la exposición. Al final de la exposición, reduzca el caudal a cero LPM y cierre la válvula de gas. Para los tanques.Abra las tapas de las cámaras y sustituya la tapa superior con filtro en cada jaula. Coloque las jaulas en condiciones de alojamiento estándar hasta la siguiente exposición hipóxica. Rocíe cada cámara de inducción con un desinfectante y desodorizante después de cada uso.Exponga tanto a los ratones RHP como a los controles a la misma hora del día durante el transcurso de las dos semanas del protocolo. Luego, realice una oclusión transitoria de la arteria cerebral media o A-T-M-C-A-O, como se describe en el texto. La inyección de EB debe realizarse 22 horas después de la reperfusión y debe circular por el torrente sanguíneo durante dos horas antes de la sacrificio para la tinción NTTC.Prepare la cantidad de EB necesaria para la inyección. Luego aspire la cantidad deseada de temperatura ambiente en una jeringa de insulina de 0,3 cc. Con una aguja de calibre 29, sujete al ratón utilizando un sujetador de fondo plano.Sujete la cola de modo que la vena lateral quede en la parte superior. Las venas laterales se encuentran a ambos lados de la línea central de la cola. Sujete la punta de la cola para mantener al ratón estable durante la inyección.Introduzca la aguja en la vena aproximadamente de tres a cinco milímetros. Teniendo cuidado de no perforar la vena, inyecte todo el colorante durante el transcurso de un minuto. Si la solución está entrando en la vena, debería haber una resistencia mínima al aplicar presión sobre la jeringa.Confirme la administración sistémica exitosa de EB mediante un cambio inmediato de color en las extremidades caudales y los ojos del ratón. Retire la aguja de la cola y aplique suavemente presión con gasa limpia para detener la hemorragia. Comience a contar el tiempo.Cuando la piel del ratón se vuelva azul, permita que el EB circule durante dos horas para que penetre la barrera hematoencefálica debilitada. La perfusión y la tinción con TTC deben realizarse 24 horas después de la reperfusión, es decir, 24 horas después de la T-M-C-A-O y dos horas después de la administración de EB; sacrifique al animal con una sobredosis de isoflurano en una pequeña cámara de inducción. La perfusión debe comenzar inmediatamente después del sacrificio para minimizar la autólisis, que comienza en ausencia de oxígeno tras la muerte.Sujete rápidamente al animal sobre una plataforma de espuma de poliestireno con los antebrazos fijados a través de las patas. Realice una incisión lateral a través de la pared abdominal desde la línea media, justo debajo de la caja torácica. Corte cuidadosamente el diafragma para exponer el corazón.Inicie la bomba de perfusión a un flujo de cinco mililitros por minuto con una jeringa de 60 cc llena con solución salina tamponada con fosfato 0,01 molar fría con hielo o PBS conectada a una aguja de infusión alada de calibre 27. Coloque la punta de la aguja aproximadamente 0,5 centímetros dentro del ventrículo izquierdo del corazón y corte el atrio derecho. Durante la perfusión, debe fluir progresivamente sangre venosa diluida desde el atrio hasta que aparezca sangre venosa. Perfunda 30 mililitros de PBS 0,01 molar incolora a través del corazón.A continuación, agregue cinco mililitros de solución de TTC en 20 frascos transparentes para centelleo. Inmediatamente después de la perfusión, seccione la cabeza de los animales y extraiga los cerebros utilizando tijeras pequeñas y, si es necesario, una espátula. Verifique que el hemisferio contralateral a la arteria cerebral media ocluida aparezca pálido, sin filtración evidente de EB ni edema.A continuación, vierta PBS en una matriz cerebral de acrílico diseñada para obtener secciones coronales de 1,0 milímetro de grosor de un cerebro de ratón. Coloque el cerebro con la cara dorsal hacia arriba en la matriz e inmediatamente vierta PBS sobre el cerebro. Mantenga el cerebro húmedo.Retire los bulbos olfativos insertando una cuchilla de acero inoxidable de 0,21 milímetros de grosor en la segunda ranura desde el lado rostral de la matriz. Luego, retire el cerebelo insertando una cuchilla en la cuarta ranura desde el lado caudal de la matriz. Inserte una cuchilla en la ranura central de las ranuras restantes en la matriz.Luego, inserte las cuchillas restantes dividiendo uniformemente el tejido restante para asegurar la distribución más homogénea posible del tejido durante el corte. Una vez que se hayan insertado todas las cuchillas, agregue una o dos gotas de PBS al cerebro para humedecerlo. A continuación, retire las cuchillas una por una de la matriz, comenzando por la región rostral.Guarde las siete primeras rebanadas para el análisis con TTC. Después de T-M-C-A-O, use una espátula pequeña para transferir cuidadosamente las rebanadas desde la cuchilla al vial lleno de TTC. Una vez que todas las secciones estén en el vial, tápelo y colóquelo en un baño de agua tibia hasta que las secciones se vuelvan rosadas.Gire suavemente el frasco en el baño, si es necesario, para evitar la superposición de secciones, lo que podría provocar una tinción desigual. Luego deseche el TTC y vierta una solución de paraformaldehído al 4% en el frasco para cubrir las secciones cerebrales. Esto detiene la reacción química del TTC.Organice inmediatamente las secciones sobre un portaobjetos de vidrio limpio de una por tres pulgadas y oriente las secciones de rostral a caudal cuando estén colocadas sobre el portaobjetos. Escanee el portaobjetos. Utilizando un escáner estándar, configure la resolución a un mínimo de 600 DPI para el análisis de imágenes.Asegúrese de incluir el nombre del animal y una regla métrica en la imagen escaneada. Finalmente, dé la vuelta al portaobjetos y escanee el reverso para garantizar que se recopilen todos los datos. RHP reduce los volúmenes de infarto en un 46 % en comparación con los ratones de control, pero no tiene efecto sobre la hinchazón hemisférica derivada de los datos de TTC en los mismos animales.La RHP reduce la alteración de la barrera hematoencefálica definida por la fuga de Azul de Evans normalizada al hemisferio contralateral, con tinciones representativas de TTC tanto de los tratados con RHP como de los controles expuestos al 21% de oxígeno. Se muestran ratones con los volúmenes de infarto correspondientes y la fuga de Azul de Evans indicados debajo de cada muestra. El lado ipsilateral corresponde al hemisferio cerebral isquémico y el contralateral al lado no afectado del cerebro.Al realizar este procedimiento, es importante recordar inyectar el azul de Evans 22 horas después de la fusión y permitir que circule durante dos horas antes del sacrificio del animal tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación preclínica del accidente cerebrovascular exploraran los mecanismos de protección endógena frente al accidente cerebrovascular en ratones. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo medir el efecto neuroprotector del RHP mediante la cuantificación dual de la integridad de la barrera hematoencefálica y los volúmenes de infarto.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Hay evidencia acumulada, que el precondicionamiento isquémico (PC) - un reto isquémico no perjudicial para el cerebro - confiere una protección transitoria a una posterior lesión isquémica perjudicial. Hemos establecido oclusión de la arteria carótida común bilateral (BCCAO) como un estímulo para inducir la tolerancia de preacondicionamiento isquémico temprano (IT) de la isquemia cerebral focal transitoria (inducida por la oclusión de la arteria cerebral media, OACM) en ratones C57BL6 / J.

Bilateral Común oclusión de la arteria carótida como un estímulo de preacondicionamiento adecuado para inducir la tolerancia isquémica precoz de isquemia cerebral focal

Fuente: Zheng, Y., et al. Modelos experimentales para estudiar la neuroprotección del postcondicionamiento ácido contra la isquemia cerebral. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la aplicación del postacondicionamiento ácido (APC) para evaluar sus efectos neuroprotectores contra la lesión isquémica en un modelo de ratón de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). Describe los pasos involucrados en la reperfusión en el modelo MCAO y la aplicación de APC durante la reperfusión para...

 Evaluación de los efectos neuroprotectores del postacondicionamiento ácido en un modelo de ratón de isquemia cerebral

Fuente: Poinsatte, K., et al., Cuantificación de la protección neurovascular después del preacondicionamiento hipóxico repetitivo y la oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el método de preacondicionamiento hipóxico repetitivo (RHP) al exponer a un ratón a ciclos de hipoxia controlados antes de inducir un accidente cerebrovascular isquémico. El experimento evalúa sus efectos sobre la estabilidad de la barrera hematoencefálica, la...

Adaptación neuronal al preacondicionamiento hipóxico repetitivo en ratones

Fuente: Lee, S. E., et al. Evaluación de los efectos neuroprotectores del extracto de Glycyrrhizae radix et rhizoma utilizando un modelo de ratón de oclusión transitoria de la arteria cerebral media. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra el procedimiento para evaluar el efecto neuroprotector de un compuesto de prueba en un modelo de ratón de oclusión de la arteria cerebral media. El compuesto ingresa al cerebro, previene la muerte neuronal y reduce el volumen del infarto, lo que confirma su...

Evaluación de los efectos neuroprotectores de un compuesto de prueba en un modelo de ratón de oclusión de la arteria cerebral media

Con el fin de entender la fisiopatología del accidente cerebrovascular, es importante utilizar modelos fiables. En este trabajo se va a describir uno de los modelos de accidente cerebrovascular de uso más frecuente en los ratones, llamado el medio modelo de oclusión de la arteria cerebral (MCAO) (también llamado el filamento de sutura intraluminal o modelo) con reperfusión.

Técnica quirúrgica para la oclusión de la arteria cerebral media y la reperfusión del movimiento inducidos en ratones

oclusión quirúrgica de una rama distal de la arteria cerebral media (MCAO) es un modelo frecuentemente usado en investigación del accidente cerebrovascular experimental. Este manuscrito describe la técnica básica de la MCAO permanente, combinado con la inserción de una ventana craneal lateral, que ofrece la oportunidad para microscopía intravital longitudinal en ratones.

Ventana lateral crónica craneal Preparación Activa En Vivo Observación Siguiendo distal de la arteria cerebral media oclusión en ratones

Describimos un modelo de ratón de accidente cerebrovascular inducido por la oclusión de la arteria cerebral media utilizando una sutura recubierta de silicona. El protocolo se puede aplicar para inducir una oclusión permanente o una isquemia temporal, seguida de reperfusión.

La inducción de ictus isquémico y la isquemia-reperfusión en ratones con la técnica de oclusión de la arteria Medio y Visualización de un infarto Área

El postcondicionamiento ácido protege contra la isquemia cerebral. Aquí presentamos dos modelos para ejecutar APC. Se consiguen respectivamente transfiriendo rebanadas corticostriatales a un tampón ácido después de la privación de oxígeno-glucosa in vitro e inhalando 20% de CO 2 después de la oclusión de la arteria cerebral media in vivo .

Modelos Experimentales para Estudiar la Neuroprotección del Acondicionamiento Acido Contra la Isquemia Cerebral

Un modelo murino de isquemia-reperfusión cerebral es establecido para investigar la patofisiología del accidente cerebrovascular. Distal, ligar la arteria cerebral media derecha y la arteria carótida común derecha y restablecer el flujo sanguíneo después de 10 o 40 min de isquemia.

Oclusión de los vasos dos ratón modelo de isquemia-reperfusión Cerebral

Este protocolo describe el modelo de isquemia cerebral focal transitoria en ratones a través de la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media. Además, se muestran ejemplos de evaluación de resultados mediante resonancia magnética y pruebas de comportamiento.

Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media de accidente cerebrovascular

En este trabajo, presentamos un protocolo para establecer un modelo de oclusión distal de la arteria cerebral media (dMCAO) mediante electrocoagulación transcraneal en ratones C57BL/6J y evaluamos el comportamiento neurológico y las características histopatológicas posteriores.

Inducción de ictus isquémico agudo en ratones mediante la técnica de oclusión de la arteria media distal

Aprende a cuantificar la neuroprotección mediante precondicionamiento hipóxico repetitivo en ratones. Este método mide simultáneamente el volumen del infarto y la integridad de la barrera hematoencefálica tras oclusión de la arteria cerebral media.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones (Video) | JoVE Journal

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

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