Experimental La desmielinización y remielinización de la Médula Espinal murino por inyección Focal de lisolecitina

El objetivo general de este procedimiento es estudiar los aspectos de la desmielinización y la posterior remielinización en la médula espinal del ratón. Esto se logra inyectando primero el detergente lyin de un capilar de vidrio extraído en la sustancia blanca de la médula espinal ventral. Luego, la médula espinal se procesa en diferentes puntos de tiempo para estudiar aspectos de la reparación, incluida la clonación de células precursoras de oligodendrocitos, la diferenciación y la remielinización.

Este método es útil no solo para estudiar los eventos normales involucrados en la remielinización, sino también como una herramienta preclínica para el cribado de terapias que promueven la remielinización. Comience por retirar una alícuota de 75 microlitros de solución de detergente al 1% a menos 20 grados centígrados, almacene y descongele a temperatura ambiente en el banco si el detergente no está disuelto. Sonicar el tubo a 40 kilohercios durante unos 30 minutos para obtener una solución uniforme.

A continuación, desenrosque la tuerca de una jeringa inyectora de 10 microlitros y enrósquela en el extremo plano de un capilar de vidrio PrepU. Agregue dos variales y asegúrese de que su extremo esté ajustado alrededor del capilar. Ahora enjuague la jeringa con isopropanol y retire el émbolo.

Una vez seco, apriete con la mano el conjunto de la aguja en la jeringa inyectora. A continuación, coloque una aguja de cubo de metal en la jeringa de cebado. Perfora un disco de goma con la aguja y deslízalo hasta la base.

Ahora llene la jeringa de cebado con el detergente a temperatura ambiente. Presione suavemente el émbolo para eliminar el aire no deseado hasta que la solución sea visible en la punta de la aguja para cirugías de control. Cargue PBS.

Ahora inserte la aguja de cubo de metal de la jeringa de cebado en la jeringa de inyección, asegurándose de que haya un sello hermético con el disco de goma. A continuación, presione lentamente la jeringa de cebado hasta que el capilar se llene hasta la punta con la solución. Con el capilar lleno, extraiga con cuidado la jeringa de cebado mientras continúa llenando el cilindro de la jeringa de inyección.

Trate de evitar introducir burbujas de aire. Ahora inserte el émbolo en la jeringa de inyección y asegúrese de que la solución fluya desde la punta. Si hay burbujas de aire visibles en el capilar o en la jeringa de inyección, repita la preparación de la jeringa desde el principio.

El fluido continuo en el aparato de inyección es fundamental para garantizar volúmenes de inyección precisos. Para terminar, conecte la jeringa inyectora al brazo de un micromanipulador estereotáctico. Esta configuración puede inyectar de 15 a 20 animales antes de que se necesite un nuevo capilar.

En primer lugar, anestesiar al animal, en este caso una hembra adulta joven, C 57 ratón negro seis. Use ketamina y xilacina y planifique una hora de anestesia. Asegure una sedación adecuada basada en la falta de respuesta a un pellizco firme del pie.

Luego afeita un área cuadrada de dos a tres centímetros en el lado dorsal cerca de las orejas. Limpie la piel con etanol al 70% en una gasa, eliminando todo el vello. A continuación, desinfecte la zona con yodo.

Asegúrese de aplicar un ungüento de átomo y mantenga al animal en una cámara de recuperación calentada. Listo para comenzar el procedimiento. Mueva al animal a un marco estereotáctico, con el lado dorsal hacia arriba, elevado en la sección media con toallas de papel dobladas para exagerar la curvatura de la columna vertebral.

A continuación, asegure la cabeza con la pinza de dientes y sujete los brazos y la cola con cinta quirúrgica. No es necesario estabilizar las barras para los oídos. Ahora use un bisturí para hacer una incisión de tres centímetros en la línea media, comenzando justo debajo de las orejas y cortando en la dirección del abrazo.

A continuación, localice la división entre las dos grandes estructuras adiposas y utilice pinzas finas en cada mano. Para separarlos, extienda los retractores para abrir el campo quirúrgico bajo un microscopio quirúrgico, localice la excrecencia ósea prominente de la vértebra T dos característica de la cepa de ratón C 57 black six. Para ver la vértebra, haga una disección roma de la musculatura superpuesta con unas tijeras de resorte cerradas.

A continuación, palpa las superficies duras de T tres y T cuatro para confirmar la ubicación anatómica adecuada. Ahora haga cortes laterales poco profundos en el tejido conectivo entre T tres y T cuatro. Tenga en cuenta que un corte demasiado profundo perforará y dañará el cordón.

Es común que haya algo de sangrado y se puede eliminar con una esponja. La médula espinal está cubierta con una capa gruesa de duramadre y será visible si esta capa meníngea aún no se ha cortado. Si la duramadre permanece intacta, retírela con cuidado con suaves raspados laterales con una aguja metálica de calibre 32.

Evite perforar las meninges subyacentes restantes, que no son tan gruesas y son más difíciles de ver. Si hay fugas de líquido cefalorraquídeo de la aracnoides, elimínelo con la esponja. Comience la inyección moviendo el capilar a su posición sobre la médula espinal.

El vaso sanguíneo prominente coddle rostral no debe usarse como un punto de referencia en la línea media. En su lugar, usa los límites de la materia blanca gris que flanquean la columna dorsal para estimar la línea media. Ahora baje lentamente el capilar hasta que la punta apenas toque la médula espinal inmediatamente lateral de cada lado de la línea media.

Bloquee el brazo en su lugar en esta posición. A continuación, tome nota de la posición de referencia en las mediciones graduadas de la dirección Z en el brazo estereotáctico. De esta lectura, reste 1,3 milímetros y use un movimiento rápido y poco profundo hacia abajo para perforar el tejido bajando cuidadosamente el capilar a la profundidad deseada.

Ahora, usando el micro manipulador, haga una rotación completa cada cinco segundos durante dos minutos para inyectar un volumen total de 0,5 microlitros. A continuación, deje el capilar en su lugar durante dos minutos. Después de dos minutos, retraiga con cuidado el capilar del tejido.

Esto permite que la solución se filtre. De lo contrario, podría refluir, alejar el aparato de inyección del animal y eliminar los retractores. Cierre el animal atando una sola sutura en el tejido adiposo muscular, superponiendo la columna vertebral.

Luego, use una sutura ininterrumpida para cerrar la piel y aplique más yodo en el sitio de la incisión. Termine colocando al animal en una cámara de recuperación climatizada hasta que se recupere, luego devuélvalo a su jaula. Los cuidados y análisis postoperatorios se describen en el protocolo de texto: inyección focal de lyína en la sustancia blanca ventral.

Produjo una lesión desmielinizante discreta que abarcó aproximadamente tres milímetros. Se realizó tinción inmunohistoquímica del núcleo de la lesión, marcando mielina con MVP y marcaje de axones con SM I tres 12. Los axones fueron despojados de mielina a los siete días y a los 14 días, los anillos positivos de MVP rodearon muchos axones, lo que sugería que se estaba produciendo una remielinización.

Las células teñidas del linaje de oligodendrocitos con PDG FFR alfa LIC dos y CC uno mostraron un aumento significativo tanto en el número total de células a los 14 días en comparación con siete días, como una mayor distribución de oligodendrocitos maduros en comparación con las OPC. De acuerdo con este hallazgo, las secciones semidelgadas teñidas con toluidina, el azul reveló la presencia de láminas delgadas de mielina a los 14 días que rara vez se detectaron a los siete días. Indica la presencia de remielinizado inter ganglios Con competencia.

La operación se puede realizar en 10 a 15 minutos por animal, especialmente con la ayuda de una segunda persona que ata las suturas.