Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un ensayo tridimensional en microplaca semiautomatizado y in vitro de la invasión de células tumorales. Esto se logra primero generando esteroides tumorales de tamaño reproducible en suspensión, en placas ultrabajas con fondo redondo de 96 pocillos, colocando un esteroide en cada pocillo. El segundo paso consiste en retirar partes del medio y añadir directamente a cada pocillo una matriz similar a la membrana basal o BMM, para proporcionar una matriz semisólida en la que las células tumorales puedan invadir desde el cuerpo del esteroide.

A continuación, se monitorea la invasión del esteroide tumoral a intervalos durante un período de 72 a 96 horas, durante el cual la adquisición de imágenes se realiza ya sea automáticamente en un citómetro o manualmente en un microscopio. El paso final consiste en analizar la invasión de las células tumorales mediante un citómetro automatizado o un software de análisis de imágenes. En última instancia, el ensayo de invasión del esteroide tumoral en 3D se utiliza para modelar la invasión del cáncer in vitro en un formato más fisiológicamente relevante y adecuado para estudios de validación de dianas y cribado de fármacos.

Consideramos que esta técnica es complementaria a los ensayos simples de proliferación celular en dos dimensiones que normalmente se utilizan para la validación de dianas y el cribado de fármacos en la investigación del cáncer, ya que también nos permite investigar la invasión, un aspecto clave de la progresión del cáncer en un formato tridimensional fisiológicamente relevante. Tuve la idea inicial de este método cuando optimicé el fenotipo tumoral en 3D, el crecimiento en microplaca. Pensé que sería conveniente utilizar la misma configuración y además observar la invasión, y el resultado fue sencillo: simplemente retirar una parte del medio de cada pocillo y reemplazarlo con una matriz similar a la membrana basal.

La demostración visual de este método es esencial, ya que mantener los esteroides en una posición central en cada pocillo tras la tradición de las BMM puede ser difícil al principio. Esto puede provocar un análisis de imagen subóptimo debido a que los esteroides se encuentran en diferentes planos focales. Con la experiencia.

Esto rara vez sucede, pero si es necesario, el proceso puede facilitarse mediante una centrifugación suave de la placa. Para comenzar, mantenga todos los BMM en hielo durante la noche, y tenga a mano un juego de puntas filtrantes estériles para pipetas P 10 E 200 y P 1000, así como tubos estériles a menos 20 grados Celsius. También coloque las placas de 96 pocillos con baja adherencia ultrabaja que contienen esteroides de cuatro días de antigüedad sobre hielo.

Utilizando una pipeta multicanal, retire suavemente 100 microlitros por pocillo del medio de crecimiento de las placas de gorrión. Para este paso, oriente la punta hacia la pared interna del fondo en U, evitando el contacto con el fondo del pocillo y la ubicación del esferoide.

Con el fin de minimizar la perturbación de los esteroides, utilice puntas heladas para transferir las MMB a tubos fríos. Para estudios de invasión inducida por citocinas o evaluación de fármacos, agregue los reactivos a las MMB utilizando puntas heladas. Por ejemplo, use factor de crecimiento epidérmico o EGF para estimular la invasión de células de carcinoma escamoso Cal S y cal r.

Luego, dispensar suavemente 100 microlitros del BMM en el ubo. Apuntar la punta hacia la pared interna del pozo. Este paso es el más crítico.

En cuanto al análisis de imágenes ópticas, los esteroides deben permanecer en el centro del, bueno. Repita este paso para todos los pocillos necesarios, permitiendo cinco a seis réplicas por condición. Si es necesario, cambie a una punta recién enfriada utilizando una aguja estéril.

Elimine las burbujas si están presentes. Utilice un microscopio para verificar visualmente si los esteroides están en posición central; si no lo están, centrifugue la placa a 300 veces G durante tres minutos a cuatro grados Celsius. Esto garantizará que los esteroides se encuentren ubicados centralmente en cada pocillo.

A continuación, transfiera la placa a un incubador a 37 grados Celsius y deje que la BMM se solidifique una hora después. Utilice una pipeta multicanal para agregar suavemente 100 microlitros por pozo de medio de crecimiento completo. Medio o estudios de invasión inducida por citocinas o evaluación de fármacos.

Incluya citoquinas o inhibidores en el medio para la adquisición automatizada de imágenes. Escanee las placas en el citómetro a intervalos. A partir del tiempo cero, seleccione la aplicación de confluencia.

Luego verifique que el esteroide esté en foco. Si es necesario, ajuste el enfoque manualmente y corrija el desplazamiento del enfoque. En la configuración de muestreo.

Seleccione un campo central de visión. Tras la adición de BMM, los esteroides tumorales deberían haber permanecido en una posición central. Por lo tanto, no es necesario escanear todo el pocillo en el software.

Defina los pocillos que se escanearán resaltándolos en el mapa de la placa. Luego haga clic en iniciar escaneo. Para el análisis automatizado de imágenes, seleccione la aplicación de confluencia.

En la pestaña de análisis, ajuste la configuración de la aplicación para obtener una segmentación precisa alrededor del esteroide, incluyendo los procesos celulares y los podios invasores que se extienden hacia la BMM. Ajuste la configuración para cada línea celular tumoral y/o en diferentes puntos temporales. Verifique que la configuración de análisis sea adecuada para otros esteroides en la placa haciendo clic en algunos pocillos diferentes.

Si la segmentación no delinea con precisión un esteroide, ajuste aún más la configuración de la aplicación. Haga clic en iniciar análisis en la pestaña de resultados. Revise múltiples pocillos para verificar la calidad del análisis antes de exportar los datos por pocillo a un programa de hojas de cálculo.

Repita el análisis para todos los puntos de tiempo, luego calcule el porcentaje medio de confluencia para los pocillos replicados y represente la invasión frente al tiempo en un gráfico de barras. Para la adquisición manual de imágenes, utilizando el software científico de graficación y estadístico de su elección, use un microscopio invertido equipado con el objetivo de 10 x para registrar una imagen para cada esteroide tumoral a intervalos. Comenzando desde T igual a cero hasta T igual entre 72 y 96 horas.

Según la velocidad de invasión del revestimiento celular en cuestión, utilice un objetivo Forex cuando un área invadida sea demasiado grande para ser capturada completamente dentro del campo de visión de 10 x. Guarde cada imagen individual obtenida para el análisis manual de imágenes. Abra las imágenes del grafo del estadio en el análisis de imágenes.

El software de elección para la calibración utiliza imágenes de una escala tomadas en el portaobjetos. Utilice tanto los objetivos de 10 x como los de 4 x. Ingrese las mediciones gráficas, las unidades y los objetivos utilizados, y realice la calibración.

Este paso solo es necesario una vez para el análisis posterior de imágenes. Simplemente vuelva a cargar los ajustes de calibración requeridos. A continuación, abra las imágenes del ensayo de invasión y seleccione los ajustes de calibración según el objetivo del microscopio utilizado para obtener las imágenes.

Mida el área cubierta por los esteroides en el software utilizado aquí. Vaya a medir y seleccione contar tamaño. Elija mientras y luego cargue configuraciones y seleccione las configuraciones predeterminadas del ensayo.

Luego, seleccione contar. A continuación, el esteroide debe segmentarse con precisión. Exporte las mediciones, que son diferentes parámetros, a una hoja de cálculo y registre la información relevante de la imagen en la hoja de cálculo.

Finalmente, represente gráficamente el área media de los esteroides o la invasión replicados frente al tiempo utilizando software científico de graficación y estadístico. Aquí se muestra como ejemplo la invasión de células cancerosas observada en la línea celular de glioblastoma U 87 MG, que puede utilizarse para ejemplificar la invasión de tumores cerebrales. Una vez embebidas en la matriz de BMM, las células se diseminan con un patrón de invasión típico en forma de estallido estelar, proceso que se sigue durante un período de 72 horas.

Análisis de imágenes completamente automatizado. El uso de un citómetro de imágenes genera una segmentación alrededor de las protrusiones celulares y permite una cuantificación precisa de la invasión de las células tumorales. Tenga en cuenta que, para esta línea celular, el cuerpo esteroide se excluye de la medición del área invadida.

El análisis de imágenes completamente automatizado se realiza fácilmente y proporciona la cuantificación de la invasión de células tumorales a lo largo del tiempo. Un patrón diferente de invasión celular es mostrado por líneas celulares isogénicas de cáncer de cabeza y cuello escamoso humano. Las líneas celulares de cáncer Cal S son sensibles, y CAL R son resistentes a los inhibidores de tirosina quinasa de EGFR.

En ausencia de EGF, ninguna de las líneas celulares invadió la MMB en presencia de protrusiones en forma de dedo de EGF, extruidas desde el cuerpo principal de los Cal ars esteroides. Aunque las células Cal s fueron menos invasivas tras 72 horas, en este caso las imágenes se adquirieron rápidamente utilizando un citómetro de imágenes y, para ejemplificar un método alternativo, el grado de invasión se cuantificó manualmente mediante software independiente de análisis de imágenes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada línea celular debe optimizarse en cuanto a su capacidad para formar esteroides, la densidad de siembra celular, la composición de la matriz y los ajustes de imagen y análisis, tras seguir este procedimiento. El mismo método también podría adaptarse para evaluar la invasión en tejidos tridimensionales utilizando, por ejemplo, tumores en cultivo conjunto con cuerpos embrionarios para simular un tejido complejo u otros organoides como astrocitos para glioma o cultivos de criptas para cánceres gastrointestinales, o hígado para carcinoma hepatocelular y metástasis del cáncer de colon.