Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un ensayo in vitro, semiautomatizado y tridimensional en microplacas de la invasión de células tumorales. Esto se logra generando primero esteroides tumorales de tamaño reproducible en suspensión en adhesión ultrabaja de fondo redondo 96, placas de pocillos a la vez esteroides en cada pocillo. El segundo paso es eliminar partes del medio y agregar una membrana basal como matriz o BMM directamente a cada pocillo para proporcionar una matriz semisólida en la que las células tumorales invaden desde el cuerpo esteroide.

A continuación, se monitoriza la invasión tumoral de esteroides a intervalos durante un período de 72 a 96 horas, durante el cual la adquisición de imágenes se realiza automáticamente en un citómetro o manualmente en un microscopio. El paso final es analizar la invasión de células tumorales a través de un citómetro automatizado o un software de imágenes. En última instancia, el ensayo de invasión de esteroides tumorales en 3D se utiliza para modelar la invasión del cáncer in vitro en un formato que es más relevante fisiológicamente y susceptible de estudios de validación de objetivos y detección de fármacos.

Creemos que esta técnica es complementaria a los ensayos simples de proliferación celular bidimensional que normalmente se utilizan para la validación de objetivos y el cribado de fármacos en la investigación del cáncer, ya que también nos permite investigar la invasión, que es un aspecto clave de la progresión del cáncer en un formato tridimensional fisiológicamente relevante. La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando optimicé el tumor en 3D, el crecimiento en la microplaca. Pensé que sería bueno usar la misma configuración y la mirada también a la invasión, y el resultado fue fácil simplemente quitar una parte del medio de cada pozo y reemplazarlo con la matriz similar a la membrana basal.

La demostración visual de este método es esencial, ya que mantener los esteroides en una posición central de cada pozo después de la tradición del BMM puede ser difícil al principio. Esto puede resultar en un análisis de imagen subóptimo debido a que los esteroides se encuentran en diferentes planos focales. Con experiencia.

Esto rara vez sucede, pero si es necesario, el proceso puede facilitarse mediante una centrifugación suave de la placa. Para comenzar todo el BMM en ICE durante la noche, mantenga un juego de puntas de filtro estériles para pipetas P 10, E 200 y P 1000 y los tubos estériles estén a menos 20 grados centígrados. Coloque también las placas de 96 pocillos de fijación ultra baja que contienen esteroides de cuatro días de antigüedad en hielo.

Con una pipeta multicanal, retire suavemente 100 microlitros por pocillo de medio de crecimiento de las placas de gorrión. Para este escalón, incline la punta hacia la pared interior de la parte inferior en U. Pozo evitando el contacto con el fondo del pozo y la ubicación de la esfé.

Para minimizar la perturbación de los esteroides utilizando puntas heladas, transfiera el BMM a tubos helados. Para la invasión inducida por citocinas o para estudios de evaluación de fármacos, agregue reactivos al BMM usando puntas heladas. Por ejemplo, use el factor de crecimiento epidérmico o EGF para estimular la invasión de las células de carcinoma escamoso Cal S y cal r.

A continuación, dispense suavemente 100 microlitros del BMM en el ubo. Bien apuntando la punta hacia la pared interior del pozo. Este paso es el más crítico.

En cuanto al análisis óptico de imágenes, los esteroides deben permanecer en el centro del pozo. Repita este paso para todos los pozos requeridos, permitiendo de cinco a seis réplicas por condición. Si es necesario, cambie a una punta recién enfriada con una aguja estéril.

Retire las burbujas si las hay. Use un microscopio para verificar visualmente que los esteroides están en una posición central, si no lo están, centrifugar la placa a 300 veces G durante tres minutos de cuatro grados centígrados. Esto asegurará que los esteroides estén ubicados en el centro de cada pocillo.

A continuación, transfiera la placa a una incubadora a 37 grados centígrados y deje que el BMM se solidifique una hora después. Utilice una pipeta multicanal para añadir suavemente 100 microlitros por pocillo de crecimiento completo. Estudios de invasión inducida por medio o citocinas o evaluación de fármacos.

Incluya citocinas o inhibidores en el medio para la adquisición automatizada de imágenes. Escanee las placas del citómetro a intervalos. A partir del tiempo cero, seleccione la aplicación de confluencia.

A continuación, compruebe que el esteroide esté en foco. Si es necesario, ajuste el enfoque manualmente y corrija el desplazamiento del enfoque. En la configuración de muestreo.

El selector explora un campo de visión central. Después de la adición de BMM, los esteroides tumorales deberían haber permanecido en una posición central. Por lo tanto, no es necesario escanear todo el pozo en el software.

Defina los pozos que se van a escanear resaltándolos en el mapa de placas. A continuación, haga clic en iniciar escaneo. Para el análisis automatizado de imágenes, seleccione la aplicación confluence.

En la pestaña de análisis, ajuste la configuración de la aplicación para producir una segmentación precisa alrededor del esteroide, incluidos los procesos celulares y los podios invasores que se extienden hacia el BMM. Ajuste la configuración para cada línea celular tumoral y/o en varios puntos temporales. Verifique que los ajustes de análisis sean apropiados para otros esteroides en la placa haciendo clic en algunos pocillos diferentes.

Si la segmentación no describe con precisión un esteroide, ajuste aún más la configuración de la aplicación. Haga clic en iniciar análisis en la pestaña de resultados. Compruebe varios pozos para verificar la calidad del análisis antes de exportar los datos de nivel de pozo a un programa de hoja de cálculo.

Repita el análisis para todos los puntos de tiempo y, a continuación, calcule el porcentaje medio de confluencia para los pozos replicados y la invasión más contra el tiempo en un gráfico de barras. Utilizando gráficos científicos y software estadístico de elección para la adquisición manual de imágenes, utilice un microscopio invertido equipado con el objetivo 10 x para registrar una imagen de cada esteroide tumoral a intervalos. A partir de T es igual a cero y después de T igual a entre 72 y 96 horas.

Dependiendo de la velocidad de invasión del revestimiento de la celda en cuestión, use un objetivo de Forex cuando un área invadida sea demasiado grande para ser capturada completamente dentro del campo de visión de 10x. Guarde cada imagen individual adquirida para el análisis manual de la imagen. Abra las imágenes del gráfico de la etapa en el análisis de imágenes.

El software de elección para la calibración son las imágenes de la toma de gráficos de una etapa. Usando objetivos de 10 x y cuatro x. Introduzca las medidas gráficas, las unidades y los objetivos utilizados y realice la calibración.

Este paso solo es necesario una vez para el análisis posterior de la imagen. Simplemente recargue los ajustes de calibración requeridos. A continuación, abra las imágenes del ensayo de invasión y seleccione los ajustes de calibración en función del objetivo del microscopio utilizado para obtener las imágenes.

Mida el área cubierta por los esteroides en el software utilizado aquí. Vaya a medir y seleccione el tamaño de la cuenta. Elija mientras, luego cargue la configuración y seleccione la configuración de ensayo predeterminada.

A continuación, elija count. A continuación, el esteroide debe segmentarse con precisión. Las mediciones de exportación son parámetros diferentes a una hoja de cálculo y registran la información relevante de la imagen en la hoja de cálculo.

Por último, represente el área media de la replicación de esteroides o de la invasión en función del tiempo utilizando gráficos científicos y software estadístico. Se muestra aquí como un ejemplo de invasión de células cancerosas observada en la línea celular de glioblastoma U 87 MG, que se puede usar para ejemplificar la invasión de tumores cerebrales. Una vez incrustado en las células BMM esparcidas con un patrón típico de invasión de estallidos estelares, el proceso se sigue durante un período de 72 horas.

Análisis de imágenes totalmente automatizado. El uso de un citómetro de imagen produce una segmentación alrededor de las protuberancias celulares y permite una cuantificación precisa de la invasión de células tumorales. Tenga en cuenta que para esta línea celular, el cuerpo esteroide se excluye de la medición del área invadida.

El análisis de imágenes totalmente automatizado se realiza fácilmente y proporciona una cuantificación de la invasión de células tumorales a lo largo del tiempo. Un patrón diferente de invasión celular es mostrado por la escama humana, la cabeza y el cuello isogénicos. Las líneas celulares cancerosas Cal S son sensibles a los inhibidores de la tirosina cinasa EG FFR y CAL R son resistentes.

En ausencia de EGF, ninguna de las líneas celulares invadió el BMM en presencia de protuberancias en forma de dedos de EGF, extruidas del cuerpo principal de los esteroides Cal ars. Si bien las células de Cal fueron menos invasivas después de 72 horas, las imágenes en este caso se adquirieron rápidamente utilizando un citómetro de imagen y, para ejemplificar un método alternativo, el grado de invasión se cuantificó manualmente utilizando un software de análisis de imágenes independiente. la densidad de siembra de celdas, la composición de la matriz y la configuración de la imagen y el análisis Siguiendo este procedimiento. El mismo método que también podría adaptarse para evaluar una invasión de tejido en 3D utilizando, por ejemplo, los tumores en cocultivo con cuerpos embrionarios para parecerse a un tejido complejo u otros organoides como astrocitos para el glioma o cultivos de criptas para cánceres gastrointestinales, o hígado para el carcinoma hepatocelular y la metástasis del cáncer de colon.