Name: Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprende a realizar ensayos de invasión tumoral 3D utilizando esferoides y matrices de membrana basal. Este método semi-automatizado permite estudiar la progresión del cáncer en un entorno fisiológicamente relevante para investigación oncológica.

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Este trabajo fue financiado por el Centro Nacional para el Reemplazo, Refinamiento y Reducción de Animales en Investigación (G1000121 ID no.94513) y el Oracle Cancer Trust. SE cuenta con el apoyo del Instituto de Investigación del Cáncer y la Investigación del Cáncer del Reino Unido (número de subvención C309/A8274). Reconocemos la financiación del NHS al Centro de Investigación Biomédica del NIHR.

1. Generación de forma reproducible esferoides tumorales Sized <ol><li> Lavar las monocapas de células tumorales con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 5 ml para un 25 cm 2 o 8 - 10 ml para un matraz de 75 cm 2), añadir enzima de disociación de células (1 ml de un 25 cm 2 o 2 ml de un 75 cm 2 frasco) e incubar las células a 37 ° C durante 2-5 min. </li><li> Compruebe el desprendimiento de células bajo un microscopio y neutralizar enzima de disociación de células con medio de crecimiento completo (5 ml para un 25 cm 2 o 8 ml para un matraz de 75 cm 2). </li><li> Suspensión de células Centrifugar a 500 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante, toque el tubo y volver a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio de cultivo completo usando una pipeta P1000. Esto debería producir una suspensión de células individuales sin grupos de células. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro y se diluye la suspensión celular para obtener 0,5-2 x 10 4 células / ml (densidad celular óptima debe determinarse para cada línea celular en order para obtener esferoides tumorales de 300 a 500 micras de diámetro 4 días después de la siembra de células 12,13). </li><li> Transferir la suspensión celular a un depósito estéril y, utilizando una pipeta multicanal, dispense 200 l / pocillo en ultra bajo apego (ULA) placas de 96 pocillos de fondo redondo 12. </li><li> Transferir las placas a una incubadora (37 ° C, 5% de CO 2, 95% de humedad). Cuatro días después, confirmar visualmente la formación de esferoides de tumor y proceder con el ensayo de invasión 3D. </li></ol> 2. Tumor 3D Ensayo esferoide Invasion <ol><li> Descongele BMM en hielo. </li><li> Mantenga un conjunto de puntas con filtro estériles para P10, P200 y P1000 pipetas y tubos estériles (1,5 ml de volumen o mayor dependiendo del volumen total requerido) a -20 ° C. </li><li> Colocar las placas de 96 pocillos que contienen 4-ULA días de edad esferoides en hielo. </li><li> Con una pipeta multicanal, retire suavemente 100 l / pocillo de medio de crecimiento de las placas esferoide. Para este ángulo paso la punta hacia la inside pared de los pocillos de fondo en U, evitando el contacto con el fondo del pozo y la ubicación de los esferoides; minimizar la perturbación de los esferoides. </li><li> Utilizando puntas heladas, transferir BMM a tubos heladas. Para invasión inducida por citoquinas o de los estudios de evaluación de drogas, agregue los reactivos (a 2x la concentración final) a la BMM utilizando puntas heladas. Por ejemplo, utilizar el factor de crecimiento epidérmico (EGF) para estimular la invasión de células de carcinoma escamoso CAL CAL S y R. Mezclar bien girando suavemente, evitando la formación de burbujas. </li><li> Dispensar suavemente 100 l de BMM en el pozo de fondo en U, con el objetivo de la punta hacia la pared interior del pozo. Este paso es el más crítico como, por análisis de imagen óptima, esferoides deben permanecer en el centro del pozo 12. </li><li> Repita el paso 2.6 para todos los pozos requeridos, permitiendo 5-6 repeticiones / condición. Si es necesario, cambie a una punta recién enfriada. NOTA: Cuando más experiencia, dosificarse BMM utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Usando una aguja estéril, eliminar las burbujas, si está presente. <ol><li> Usando un microscopio, comprobar visualmente que esferoides están en una posición central. Si no, centrifugar la placa a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. Esto asegurará que los esferoides se encuentran en el centro de cada pocillo. </li></ol></li><li> La transferencia de la placa a una incubadora a 37 ° C y permitir que el BMM se solidifique. </li><li> 1 hr más tarde, utilizando una pipeta multicanal, añadir suavemente 100 l / pocillo de medio de crecimiento completo. Para invasión o evaluación de drogas estudios inducida por citoquinas, incluyen citoquinas o inhibidores en el medio (1x concentración final). Alternativamente, si los reactivos no se han añadido a la BMM en el paso 2.5, añadirlos al medio en este punto (3 veces la concentración final deseada). </li></ol> 3. Automated Image Acquisition <ol><li> Placas de exploración en el citómetro (para ver las especificaciones de la tabla de Equipos y Materiales) a intervalos starting desde el tiempo cero (t0 = día de la invasión de ensayo establecido, inmediatamente después del paso 2,10 hasta 72 horas o 96 horas para que invaden las líneas celulares tumorales más lentas. </li><li> Seleccione la aplicación &#39;Confluencia&#39;. </li><li> Compruebe que el esferoide es en el enfoque y, si es necesario, ajustar manualmente y fijar el &#39;enfoque puesto fuera de&#39;. </li><li> En &#39;Ajustes de muestreo&#39;, seleccione escanear un campo central de visión (FOV). Después de la adición BMM, esferoides tumorales deberían haber permanecido en una posición central, por lo que no hay necesidad de escanear todo el pozo. </li><li> En el software, definen los pozos para ser escaneados seleccionándolos en el mapa plato. Haga clic en &quot;Iniciar escaneo&quot;. NOTA: El escaneo se guarda automáticamente y se puede revisar más tarde fuera de línea. </li></ol> 4. Análisis automatizado Image <ol><li> Seleccione la aplicación &#39;Confluencia&#39;. </li><li> En la pestaña &quot;Análisis&quot;, ajuste aplicajustes ación (por ejemplo, &quot;precisión&quot;: bajo, alto normal; &quot;umbral de intensidad&quot;: 1 - 15) para producir una segmentación precisa alrededor del esferoide, incluidos los procesos celulares y invadopodios extienden en el BMM (ver Figura 1). Ajuste las configuraciones para cada línea de células tumorales y / o en varios puntos de tiempo. Medidas de aplicación El &#39;Confluence &quot;el% del área bien cubierta por las células invasoras, en el campo de visión seleccionado. </li><li> Compruebe que los ajustes de análisis son apropiadas (es decir, la segmentación es exacto) para otros esferoides en la placa haciendo clic en un par de pozos diferentes. Si la segmentación no describe con precisión un esferoide, ajustar los parámetros de la aplicación ulterior. </li><li> Haga clic en &quot;Iniciar análisis&quot;. </li><li> En la pestaña &quot;Resultados&quot;, compruebe múltiples pozos para verificar la calidad del análisis. Exportar &#39;Bien de datos de nivel&#39; a un programa de hoja de cálculo. </li><li> REPEAanálisis t para todos los puntos de tiempo. Calcule la media% de confluencia para pozos replicados y la invasión de parcela (% de confluencia) contra el tiempo en un gráfico de barras, utilizando gráficas científica y software estadístico de elección. </li></ol> 5. Imagen de Manual de Adquisición <ol><li> Grabar una imagen para cada esferoide tumor a intervalos a partir de t = 0 hasta 72 a 96 horas, dependiendo de la velocidad de la invasión de la línea celular en cuestión, usando un microscopio invertido (para una placa de 96 pocillos esto toma aproximadamente 20 - 30 min). Utilice un objetivo de 10X. Utilice un objetivo 4X cuando un área invadida es demasiado grande para ser capturado completamente dentro del campo de 10X de vista. </li><li> Guarde cada imagen individual adquirido. </li><li> Para la calibración, tomar imágenes de una etapa de la retícula (1 mm) utilizando ambos objetivos 10X y 4X (y guardar las imágenes). </li></ol> 6. Análisis de imagen Manual <ol><li> Abra las imágenes etapa retícula en el software de análisis de imágenes de elección. </li><li> Introduzca el gratmediciones icule, las unidades (micras), los objetivos utilizados (10X o 4X) y llevar a cabo la calibración. Este paso es necesario sólo una vez. Para el análisis de imagen posterior, simplemente volver a cargar los ajustes de calibración requeridas. </li><li> Abra las imágenes del ensayo de invasión y seleccione los ajustes de calibración en función del objetivo de microscopio (10X o 4X) utilizados para obtener las imágenes. <ol><li> Alternativamente, las imágenes de importación obtenidos en un citómetro de formación de imágenes (paso 3) y analizar manualmente, como se describe para imágenes obtenidas usando un microscopio invertido (ver resultados mostrados en la Figura 3 y la Figura 4). </li></ol></li><li> Mida el área cubierta por los esferoides. <ol><li> En el software utilizado aquí por los resultados representativos (para ver las especificaciones de la tabla de Equipos y Materiales), vaya a &quot;Measure&quot; y seleccione &quot;Contar / size &#39;. Elija &quot;Archivo&quot; y luego &quot;Cargar ajustes &#39;y seleccione predeterminado assaajustes y. A continuación, seleccione &#39;Contador&#39;. El esferoide debe entonces ser segmentado con precisión. </li><li> Alternativamente ir a &quot;Editar&quot; y luego &quot;Dibujar / Fusionar objetos &#39;para abrir la ventana&quot; Varita Mágica / Trace&#39;. Utilice el cursor varita para hacer clic en la imagen esferoide y obtener la segmentación. Seleccione &#39;Rastro&#39; (en la ventana &#39;varita mágica&#39;) para delinear manualmente el esferoide usando un ratón. </li></ol></li><li> Mediciones de exportación de diferentes parámetros (área, diámetro, perímetro etc.) a una hoja de cálculo. Grabar en la hoja de cálculo de la información de la imagen de referencia (por ejemplo, bueno número, punto de tiempo relativo). </li><li> Trazar el área media de esferoides replicadas (invasión) en función del tiempo utilizando gráficos científica y software estadístico. Alternativamente, calcular el cambio en el área esferoide en cada punto de tiempo, con relación al área en t = 0. Entonces invasión parcela (t0%) frente al tiempo como una gra linealph. </li></ol>

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</ol>

Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses en competencia.

Los dos modelos de tumores descritos aquí (glioblastoma y CECC) fueron seleccionados específicamente para ejemplificar nuestro ensayo en 3D, ya que son clínicamente cánceres invasivos localmente relevantes con una necesidad insatisfecha de terapias efectivas 12. Después del tratamiento de drogas, la evaluación in vitro de cambios farmacodinámica (PD) de biomarcadores se pueden realizar fácilmente por Western blot o inmunoensayos de lisados ​​tras el uso de reactivos disponibles en el mercado específicas para permitir la recuperación de células de BMM y / o análisis de inmunofluorescencia de invadir esferoides tumorales por toda tinción de montaje. Este ensayo de invasión es una técnica útil para la evaluación rápida y reproducible de invasión de células tumorales en un medio semisólido y por lo tanto particularmente apropiado para el futuro en la detección de drogas vitro. Las células cancerosas invaden la matriz de una manera 3D medida que se extienden hacia fuera de un &quot;micro-tumor&quot;, representada por el esferoide tumor, y se extienden en una extracellulentorno de matriz ar. La verdadera tridimensionalidad del ensayo es evidente en la morfología celular, que es diferente de la, morfología adherente plana células suponen cuando se mueve sobre un sustrato sólido. El grado de invasión se cuantifica fácilmente usando un citómetro de formación de imágenes, lo que permite una lectura de automatizado, o mediante el uso de un microscopio estándar en combinación con software de imágenes. Además, este método es adecuado para la formación de imágenes fluorescentes 13 (por ejemplo con líneas celulares que expresan proteínas fluorescentes o pre-marcada con colorantes fluorescentes). El método es fácil de realizar con el único paso crítico representado por la adición de la BMM, cuando hay un riesgo de perturbar la posición central de la esferoide en la forma de U también. Esto puede resultar en análisis de imagen subóptima, con esferoides en diferentes planos focales. Por tanto, es crítico para añadir el BMM con cuidado y lentamente a cada pocillo. Después de la adición BMM es recomendable comprobar la placabajo un microscopio y si la localización se considera inaceptable, esto se puede remediar por centrifugación suave. Con la experiencia, esto es raramente necesario. Si bien este método es robusto y muy reproducible, la variación inter-experimental podría ocurrir con diferentes lotes de BMM. Para evitar esto, es recomendable adquirir suficiente BMM de un solo lote para completar una serie de estudios. Una limitación del método (como por cualquiera de estos ensayos) es la dificultad de distinguir entre la invasión y proliferación, que las células tumorales se someten probable durante el marco de tiempo de ensayo. Aunque el tiempo de duplicación de las células puede ser tomado en cuenta, o inhibidores del ciclo celular tales como citocalasina D introdujo, no es fácil de controlar o claramente distinguir entre estos dos aspectos diferentes de la progresión del tumor, especialmente para las células tumorales de crecimiento rápido y para aquellos que tener un patrón de invasión más &quot;expansiva&quot;, en lugar de infiltrante. Por esta razónse sugiere que un ensayo de crecimiento 3D paralelo se lleva a cabo para evaluar los efectos concretos de los agentes inhibidores o estimulantes. Si se realizan estudios de respuesta de dosis cuidadoso, puede ser posible seleccionar concentraciones que minimicen efectos sobre la proliferación. Por ejemplo, hemos demostrado que el inhibidor de HSP90 17-AAG inhibe U-87 MG 3D invasión esferoide tumor ya a las 24 horas y a concentraciones por debajo de la concentración que inhibe el crecimiento 3D en un 50% (GI 50) 12. Por otra parte, la importancia de este ensayo en comparación con otros ensayos de invasión estándar (por ejemplo, filtro basado en ensayos o invasión de células individuales en matrices 3D 1), es que las células tumorales invaden la matriz circundante desde el esferoide, que se asemeja a una &quot; micro-tumor &quot;o un&quot; micro-metástasis &quot;, y por lo tanto tiene en cuenta los aspectos importantes de la patofisiología de una masa tumoral. El método que presentamos proporciona información sobre lacomportamiento colectivo de las células tumorales, al salir inicialmente los esferoides, y también individualmente, cuando las células individuales llegan a regiones más distantes en el BMM. Además, las células dentro de esferoides tumorales pueden experimentar hipoxia y nutrientes privación que, a través de cambios en la expresión génica, puede promover la migración y la invasión; tales características están ausentes en los ensayos de 2D. Además, todo esto está disponible en un formato de alto rendimiento mediante el uso de placas de 96 pocillos específicos y la última tecnología de imagen, lo que permite un ensayo de 3D más complejo para ser utilizado fácilmente en la validación de dianas y el descubrimiento de fármacos. El método que presentamos tiene capacidad para otras aplicaciones para abordar aspectos adicionales de la invasión de las células tumorales. En particular, la complejidad adicional puede preverse por la adición de células huésped, tales como los fibroblastos y / o células endoteliales, en el esferoide en sí o la matriz circundante. Esto también puede ser modificado, no sólo en términos de rigidez (por el uso de diferentes concentrations de BMM), sino también en términos de composición (por la adición de otros componentes que dependen del tejido / órgano específico del modelo adoptado tumor: por ejemplo, tenascina para los cánceres cerebrales 16 y colágeno para el carcinoma de mama 17). Una similares set-up (generación de esferoides y de formación de imágenes) también se pueden adaptar para evaluar la invasión de tejidos en 3D, donde esferoides tumorales son co-cultivadas con cuerpos embrioides se asemejan a un tejido complejo 12 o con otros organoides de células específicas (por ejemplo, astrocitos para culturas glioma 18 o criptas para los cánceres gastrointestinales), pero más trabajo se requiere para permitir el análisis de imágenes automatizado.

El desarrollo de fármacos contra el cáncer clásica es en gran medida centrado en el uso de ensayos in vitro basados ​​en células en a la pantalla para los agentes citotóxicos que inhiben la proliferación de células tumorales y / o promover la muerte celular programada (apoptosis). Más recientemente, los esfuerzos se han movido hacia terapias dirigidas con el desarrollo de inhibidores de las causas moleculares subyacentes de la proliferación de células malignas. A pesar de algunos resultados espectaculares, tales agentes están a menudo asociados con el rápido desarrollo de la resistencia a los medicamentos. Dado que es el potencial invasor y metastásico de las células tumorales que es responsable de la mayoría de las muertes por cáncer, y que a menudo recaída de la enfermedad presenta un fenotipo más agresivo, es lógico también considerar complementaria en modelos experimentales in vitro 1,2 a identificar nuevos agentes que inhiben estos adicionales &quot;señas de identidad&quot; clave de cáncer. Durante la progresión maligna, las células tumorales adquierenla capacidad de invadir el tejido circundante y / o extenderse a órganos distantes (metástasis). Las células cancerosas penetran en la membrana basal por la formación de invadopodios 3,4. Estas estructuras están enriquecidos con filamentos de actina, proteínas de adhesión específicas y proteinasas y son colectivamente responsables de la motilidad de las células tumorales y la degradación de la matriz extracelular (ECM) 5. Invadopodios se extienden en el ECM y se cree que son importantes para la invasión de células tumorales y también extravasación en canales vasculares, facilitando hematógena (o linfática) la difusión y la metástasis. Métodos estándar actuales para evaluar la invasión de células tumorales in vitro incluyen lo siguiente. Transwell o basado en ensayos de cámara de Boyden 2,6 donde suspensiones de células individuales se siembran en la parte superior de un filtro recubierto con una capa gruesa de proteínas ECM-derivado. Las células entonces invaden y se mueven en la cámara inferior en respuesta a una quimio-atrayente. Comúnmente usado ECMproteínas son colágeno de tipo I, o una matriz de tipo membrana basal (BMM, por ejemplo, Matrigel, derivado del tumor EHS 7) que imita la composición natural de las membranas basales. Como una alternativa a los ensayos de tipo de cámara de Boyden basados ​​en filtros 8, las células pueden sembrarse en la parte superior de un gel de ECM (a la que se pueden añadir fibroblastos) donde forman una monocapa y luego individualmente o colectivamente invadir en el gel. Invasion se puede medir en términos de número de células y / o distancia invasores viajado desde la superficie del gel 9. Las células tumorales también pueden ser completamente embebidas en una matriz, ya sea como una única suspensión celular o como esferoides - por lo general colocados entre dos capas de ECM de gel permitiendo que las células invaden fuera de la masa tumoral en la matriz circundante 2,6,10,11. El (3D) ensayo de invasión tumoral esferoide tridimensional descrito aquí proporciona un sistema de rápida invasión, automatizable mediante un highly método reproducible, estandarizada 12 en un formato de placa de 96 pocillos con un esferoide por pocillo. BMM se añade directamente a cada pocillo para proporcionar una matriz semi-sólido en el cual las células tumorales invaden desde el cuerpo esferoide. La extensión de la invasión de células tumorales se controla a intervalos durante un período de 72 a 96 hr. Este método proporciona las siguientes ventajas sobre los ensayos actuales in vitro de invasión mencionados anteriormente: el tumor células se organizan en una estructura 3D imitando un micro-región del tumor o una micro-metástasis; los esferoides tumorales son altamente reproducibles en tamaño; el ensayo de invasión se realiza in situ en la misma placa como el desarrollo esferoide tumor, sin la necesidad de moverlos a placas secundarias; el método, combinado con las últimas tecnologías de análisis de imágenes automatizado, permite tanto alto contenido y análisis de alto rendimiento de la invasión de las células tumorales. El análisis de imágenes se realizó utilizando un citómetro de formación de imágenes, que escanea un 96 pocillosplaca dentro de 10 minutos. Mediante el uso de la aplicación de confluencia, el grado y velocidad de invasión lograrse ya sea por las células individuales o por grupos de células se extienden hacia fuera de los esferoides tumorales e invadiendo en la matriz se puede medir de una manera dinámica. Para un rendimiento inferior, se presenta un método alternativo para el análisis de imagen, basado en el uso de un microscopio invertido y software de imagen estándar.

<table><tbody><tr><td>Matriz de membrana basal Corning Matrigel</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>354234</td><td>Mantener a 4 &amp;deg;C para evitar la solidificación y dispensar utilizando puntas de pipeta enfriadas</td></tr><tr><td>Extracto de membrana basal Cultrex, PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>Mantener a 4 &amp;deg;C para evitar la solidificación y dispensar utilizando puntas de pipeta enfriadas</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos con adherencia ultra baja</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>Añadir 100 &amp;mu;l de BSA al 1% (p/v) en agua a 100 &amp;mu;g de EGF. A 25 &amp;mu;l de esta solución, añadir 4.975 &amp;mu;l de medio RHB-A para obtener un stock de trabajo de 5 &amp;mu;g/ml. Aliquotar y almacenar a -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Medio RHB-A</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>Para diluir EGF</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>Calentar en baño de agua a 37 &amp;deg;C antes de usar</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>Calentar a 56 &amp;deg;C para inactivar el complemento antes de usar</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>Solución de disociación celular</td></tr><tr><td>Citómetro Celigo</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nexcelom Bioscience</a></td><td>n/a</td><td>Equipo especializado para captura y análisis de imágenes. La captura manual de imágenes mediante microscopía y software independiente de análisis de imágenes es una alternativa</td></tr><tr><td>Microscopio invertido IX70</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Olympus</a></td><td>n/a</td><td>Utilizado con cámara para la captura manual de imágenes</td></tr><tr><td>Cámara digital Retiga Exi Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Qimaging</a></td><td>n/a</td><td>Conectada al microscopio para la captura manual de imágenes</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Software utilizado para controlar la cámara y el microscopio durante la captura manual de imágenes</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Software independiente de análisis de imágenes para la medición manual del tamaño de esferoides</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td>n/a</td><td>Software científico para gráficos y análisis estadísticos</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad</a></td><td>n/a</td><td>Software científico para gráficos y análisis estadísticos</td></tr></tbody></table>

tumor ensayo tridimensional (3d) esferoide invasion

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

La invasión de los tejidos normales circundantes se considera generalmente que es un sello distintivo clave de maligno (en contraposición a los tumores benignos). Para algunos tipos de cáncer, en particular (por ejemplo, tumores cerebrales tales como glioblastoma multiforme y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello -. SCCHN) es una causa de morbilidad severa y puede ser peligrosa para la vida, incluso en ausencia de metástasis a distancia. Además, los cánceres que han recaído después del tratamiento por desgracia a menudo presente con un fenotipo más agresivo. Por lo tanto, hay una oportunidad para dirigir el proceso de invasión de proporcionar nuevas terapias que podrían ser complementaria a los agentes anti-proliferativos estándar. Hasta ahora, esta estrategia se ha visto obstaculizada por la falta de, ensayos reproducibles sólidas adecuadas para un análisis detallado de la invasión y para la detección de drogas. Aquí se proporciona un método de micro-placa sencilla (basado en uniforme, auto-montaje esferoides tumorales 3D), que tiene un gran potencial para tal stumuere. Ejemplificamos la plataforma de ensayo utilizando una línea celular de glioblastoma humano y también un modelo CECC donde el desarrollo de la resistencia contra los inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) dirigida está asociada con una mayor posibilidad de matriz invasiva. También ofrecemos dos métodos alternativos de cuantificación semiautomática: uno utilizando un citómetro de imagen y una segunda, que simplemente requiere microscopía y de imagen estándar de captura con análisis digital de imágenes.

Invasión esferoide tumor 3D se evaluó utilizando un método simple, reproducible y automatizada se ilustra esquemáticamente en la Figura 1: esferoides tumorales reproducible de tamaño se obtienen mediante siembra de células en ULA placas de 96 pocillos de fondo redondo. 4 días después de la iniciación esferoides se incrustan en BMM. Esto proporciona una estructura semi-sólido en el cual las células tumorales invaden y se extienden hacia fuera del esferoide. Esferoides están ubicados en la base de cada pocillo y la invasión en el BMM se controla fácilmente a intervalos a partir de t = 0 hasta 72 a 96 horas utilizando un citómetro de imágenes. Esto puede proporcionar análisis de imágenes totalmente automatizado. Ejemplos de diferentes tipos de invasión de células de cáncer se ilustran en las Figuras 2 -. 4 El glioblastoma multiforme altamente maligno humano (GBM) línea celular U-87 MG, se forma una estructura esférica 3D apretado y se utiliza aquí para ejemplificar los tumores cerebrales en los que locales invasión es mortal una clavecaracterística. Una vez incrustado en BMM, las células de esferoides U-87 MG untadas con un típico &quot;starburst&quot; patrón de invasión 12. Las células tumorales se extienden radialmente en la matriz en la que éstas mantienen una forma 3-dimensional. El proceso es seguido durante un período de 72 horas como se muestra en la Figura 2 para U-87 MG esferoides, cuando la extensión de la invasión de células tumorales, con los detalles de los procesos celulares y invadopodios que se extienden en la BMM es claramente evidente. Totalmente automatizado de análisis de imágenes usando un citómetro de imagen permite la cuantificación exacta de la invasión de células tumorales en el tiempo. Se obtiene la cuantificación en la Figura 2 como se ilustra en la Figura 1, donde el análisis automatizado produce la segmentación alrededor de los salientes de células que se extienden en la BMM de la U-87 MG cuerpo esferoide. Tenga en cuenta que para esta línea celular, el cuerpo esferoide tumor está excluida de la medición de la zona invadida. Un patrón diferente de INVASiones se muestra por las líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello escamosas humanos. CAL CAL S y R son isogénicas pero CAL S es sensible a, y CAL R resistentes a los inhibidores de la tirosina quinasa EGFR 14. En ausencia de EGF, ni línea celular invadió en el BMM (Figura 3) Sin embargo, a medida que aumentaba la concentración de EGF (a 2,5 ng / ml), los esferoides parecen &#39;brote&#39;. A las concentraciones más elevadas de EGF (40 y 80 ng / ml) el grado de invasión se redujo. Esto es coherente con la respuesta a la dosis clásica en forma de campana a EGF en términos de invasión que se ha informado anteriormente 15. En 20 ng / ml EGF, los salientes en forma de dedos extruidos desde el cuerpo principal de esferoides CAL R mientras que las células CAL S eran menos invasiva después de 72 hr (Figura 3). Esta invasión diferencial fue evidente después de 48 hr esferoides fueron colocados en BMM (que contiene 20 ng / ml de EGF para la distinción máxima entre las líneas celulares) Y mayor a las 72 horas (Figura 4). Estas imágenes fueron adquiridas rápidamente usando un citómetro de imágenes, como por U-87 MG. Sin embargo, en este caso, para ejemplificar un método alternativo, el grado de invasión se cuantificó manualmente utilizando el software de análisis de imagen independiente y se presenta gráficamente (figuras 3 y 4). Estos resultados ilustran una diferencia fenotípica entre células sensibles a fármacos y resistentes que podrían ser utilizados para la detección de compuestos que antagonizan específicamente el fenotipo resistente al fármaco, invasivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> Figura 1. Visión general esquemática de ensayo de invasión tumoral esferoide 3D. El flujo de trabajo muestra los pasos del método involucra incluyendo imágenes representativas de esferoides U-87 MG glioblastoma justo después de la incorporación en BMM (panel superior; t = 0) y después de la invasión<html> en BMM (panel inferior; t = 72 hr) con y sin la segmentación que mide el área cubierta por las células invasoras. Bar = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Figura 2. Tiempo-curso de la invasión U-87 MG glioblastoma esferoide en BMM. U-87 MG esferoide invasión 3D en BMM se controló y se cuantifica hasta 72 horas utilizando un citómetro de imágenes. (A) Imágenes representativas y (B) la cuantificación de se muestran invasión de células tumorales. Bar = 500 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> re 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. CAL R (resistente) y CAL S (sensible) esferoide invasión tumoral. (A) Imágenes representativas y (B) la cuantificación Manual de EGF dependiente de la dosis CAL R y S CAL invasión tumoral esferoide se muestran. Bar = 500 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> Figura 4. Las células de CAL R esferoides (resistentes) son más invasivas que CAL S (sensibles) esferoides tumorales cuando se coloca en BMM. Al FEAG estimulación CAL R esferoides tumorales muestran una invasión más pronunciada que CAL S. (A) Imágenes representativas y (B) la cuantificación manual de la invasión se muestran. Bar = 500 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un ensayo tridimensional en microplaca semiautomatizado y in vitro de la invasión de células tumorales. Esto se logra primero generando esteroides tumorales de tamaño reproducible en suspensión, en placas ultrabajas con fondo redondo de 96 pocillos, colocando un esteroide en cada pocillo. El segundo paso consiste en retirar partes del medio y añadir directamente a cada pocillo una matriz similar a la membrana basal o BMM, para proporcionar una matriz semisólida en la que las células tumorales puedan invadir desde el cuerpo del esteroide.A continuación, se monitorea la invasión del esteroide tumoral a intervalos durante un período de 72 a 96 horas, durante el cual la adquisición de imágenes se realiza ya sea automáticamente en un citómetro o manualmente en un microscopio. El paso final consiste en analizar la invasión de las células tumorales mediante un citómetro automatizado o un software de análisis de imágenes. En última instancia, el ensayo de invasión del esteroide tumoral en 3D se utiliza para modelar la invasión del cáncer in vitro en un formato más fisiológicamente relevante y adecuado para estudios de validación de dianas y cribado de fármacos.Consideramos que esta técnica es complementaria a los ensayos simples de proliferación celular en dos dimensiones que normalmente se utilizan para la validación de dianas y el cribado de fármacos en la investigación del cáncer, ya que también nos permite investigar la invasión, un aspecto clave de la progresión del cáncer en un formato tridimensional fisiológicamente relevante. Tuve la idea inicial de este método cuando optimicé el fenotipo tumoral en 3D, el crecimiento en microplaca. Pensé que sería conveniente utilizar la misma configuración y además observar la invasión, y el resultado fue sencillo: simplemente retirar una parte del medio de cada pocillo y reemplazarlo con una matriz similar a la membrana basal.La demostración visual de este método es esencial, ya que mantener los esteroides en una posición central en cada pocillo tras la tradición de las BMM puede ser difícil al principio. Esto puede provocar un análisis de imagen subóptimo debido a que los esteroides se encuentran en diferentes planos focales. Con la experiencia.Esto rara vez sucede, pero si es necesario, el proceso puede facilitarse mediante una centrifugación suave de la placa. Para comenzar, mantenga todos los BMM en hielo durante la noche, y tenga a mano un juego de puntas filtrantes estériles para pipetas P 10 E 200 y P 1000, así como tubos estériles a menos 20 grados Celsius. También coloque las placas de 96 pocillos con baja adherencia ultrabaja que contienen esteroides de cuatro días de antigüedad sobre hielo.Utilizando una pipeta multicanal, retire suavemente 100 microlitros por pocillo del medio de crecimiento de las placas de gorrión. Para este paso, oriente la punta hacia la pared interna del fondo en U, evitando el contacto con el fondo del pocillo y la ubicación del esferoide.Con el fin de minimizar la perturbación de los esteroides, utilice puntas heladas para transferir las MMB a tubos fríos. Para estudios de invasión inducida por citocinas o evaluación de fármacos, agregue los reactivos a las MMB utilizando puntas heladas. Por ejemplo, use factor de crecimiento epidérmico o EGF para estimular la invasión de células de carcinoma escamoso Cal S y cal r.Luego, dispensar suavemente 100 microlitros del BMM en el ubo. Apuntar la punta hacia la pared interna del pozo. Este paso es el más crítico.En cuanto al análisis de imágenes ópticas, los esteroides deben permanecer en el centro del, bueno. Repita este paso para todos los pocillos necesarios, permitiendo cinco a seis réplicas por condición. Si es necesario, cambie a una punta recién enfriada utilizando una aguja estéril.Elimine las burbujas si están presentes. Utilice un microscopio para verificar visualmente si los esteroides están en posición central; si no lo están, centrifugue la placa a 300 veces G durante tres minutos a cuatro grados Celsius. Esto garantizará que los esteroides se encuentren ubicados centralmente en cada pocillo.A continuación, transfiera la placa a un incubador a 37 grados Celsius y deje que la BMM se solidifique una hora después. Utilice una pipeta multicanal para agregar suavemente 100 microlitros por pozo de medio de crecimiento completo. Medio o estudios de invasión inducida por citocinas o evaluación de fármacos.Incluya citoquinas o inhibidores en el medio para la adquisición automatizada de imágenes. Escanee las placas en el citómetro a intervalos. A partir del tiempo cero, seleccione la aplicación de confluencia.Luego verifique que el esteroide esté en foco. Si es necesario, ajuste el enfoque manualmente y corrija el desplazamiento del enfoque. En la configuración de muestreo.Seleccione un campo central de visión. Tras la adición de BMM, los esteroides tumorales deberían haber permanecido en una posición central. Por lo tanto, no es necesario escanear todo el pocillo en el software.Defina los pocillos que se escanearán resaltándolos en el mapa de la placa. Luego haga clic en iniciar escaneo. Para el análisis automatizado de imágenes, seleccione la aplicación de confluencia.En la pestaña de análisis, ajuste la configuración de la aplicación para obtener una segmentación precisa alrededor del esteroide, incluyendo los procesos celulares y los podios invasores que se extienden hacia la BMM. Ajuste la configuración para cada línea celular tumoral y/o en diferentes puntos temporales. Verifique que la configuración de análisis sea adecuada para otros esteroides en la placa haciendo clic en algunos pocillos diferentes.Si la segmentación no delinea con precisión un esteroide, ajuste aún más la configuración de la aplicación. Haga clic en iniciar análisis en la pestaña de resultados. Revise múltiples pocillos para verificar la calidad del análisis antes de exportar los datos por pocillo a un programa de hojas de cálculo.Repita el análisis para todos los puntos de tiempo, luego calcule el porcentaje medio de confluencia para los pocillos replicados y represente la invasión frente al tiempo en un gráfico de barras. Para la adquisición manual de imágenes, utilizando el software científico de graficación y estadístico de su elección, use un microscopio invertido equipado con el objetivo de 10 x para registrar una imagen para cada esteroide tumoral a intervalos. Comenzando desde T igual a cero hasta T igual entre 72 y 96 horas.Según la velocidad de invasión del revestimiento celular en cuestión, utilice un objetivo Forex cuando un área invadida sea demasiado grande para ser capturada completamente dentro del campo de visión de 10 x. Guarde cada imagen individual obtenida para el análisis manual de imágenes. Abra las imágenes del grafo del estadio en el análisis de imágenes.El software de elección para la calibración utiliza imágenes de una escala tomadas en el portaobjetos. Utilice tanto los objetivos de 10 x como los de 4 x. Ingrese las mediciones gráficas, las unidades y los objetivos utilizados, y realice la calibración.Este paso solo es necesario una vez para el análisis posterior de imágenes. Simplemente vuelva a cargar los ajustes de calibración requeridos. A continuación, abra las imágenes del ensayo de invasión y seleccione los ajustes de calibración según el objetivo del microscopio utilizado para obtener las imágenes.Mida el área cubierta por los esteroides en el software utilizado aquí. Vaya a medir y seleccione contar tamaño. Elija mientras y luego cargue configuraciones y seleccione las configuraciones predeterminadas del ensayo.Luego, seleccione contar. A continuación, el esteroide debe segmentarse con precisión. Exporte las mediciones, que son diferentes parámetros, a una hoja de cálculo y registre la información relevante de la imagen en la hoja de cálculo.Finalmente, represente gráficamente el área media de los esteroides o la invasión replicados frente al tiempo utilizando software científico de graficación y estadístico. Aquí se muestra como ejemplo la invasión de células cancerosas observada en la línea celular de glioblastoma U 87 MG, que puede utilizarse para ejemplificar la invasión de tumores cerebrales. Una vez embebidas en la matriz de BMM, las células se diseminan con un patrón de invasión típico en forma de estallido estelar, proceso que se sigue durante un período de 72 horas.Análisis de imágenes completamente automatizado. El uso de un citómetro de imágenes genera una segmentación alrededor de las protrusiones celulares y permite una cuantificación precisa de la invasión de las células tumorales. Tenga en cuenta que, para esta línea celular, el cuerpo esteroide se excluye de la medición del área invadida.El análisis de imágenes completamente automatizado se realiza fácilmente y proporciona la cuantificación de la invasión de células tumorales a lo largo del tiempo. Un patrón diferente de invasión celular es mostrado por líneas celulares isogénicas de cáncer de cabeza y cuello escamoso humano. Las líneas celulares de cáncer Cal S son sensibles, y CAL R son resistentes a los inhibidores de tirosina quinasa de EGFR.En ausencia de EGF, ninguna de las líneas celulares invadió la MMB en presencia de protrusiones en forma de dedo de EGF, extruidas desde el cuerpo principal de los Cal ars esteroides. Aunque las células Cal s fueron menos invasivas tras 72 horas, en este caso las imágenes se adquirieron rápidamente utilizando un citómetro de imágenes y, para ejemplificar un método alternativo, el grado de invasión se cuantificó manualmente mediante software independiente de análisis de imágenes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada línea celular debe optimizarse en cuanto a su capacidad para formar esteroides, la densidad de siembra celular, la composición de la matriz y los ajustes de imagen y análisis, tras seguir este procedimiento. El mismo método también podría adaptarse para evaluar la invasión en tejidos tridimensionales utilizando, por ejemplo, tumores en cultivo conjunto con cuerpos embrionarios para simular un tejido complejo u otros organoides como astrocitos para glioma o cultivos de criptas para cánceres gastrointestinales, o hígado para carcinoma hepatocelular y metástasis del cáncer de colon.

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

Este video muestra un método para establecer un cocultivo tridimensional de esferoide tumoral y células T. Se prepara un molde de agarosa con micropocillos que contienen esferoides tumorales, seguido de la adición de células T. Después de la incubación, esta configuración permite estudiar la interacción de las células T con los esferoides tumorales en un entorno tridimensional controlado.

Un modelo de cocultivo tridimensional de células T infiltrantes en esferoides tumorales

Fuente: Guyon, J., et al. Un modelo esferoide 3D para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)El video muestra la generación de un modelo esferoide tridimensional de la invasión de células tumorales. Los esferoides se forman a partir de células tumorales cerebrales humanas y se incrustan en una matriz de colágeno. Las células tumorales en la periferia esferoide adoptan un fenotipo invasivo, secretando proteasas para degradar el colágeno y avanzando para invadir la matriz circundante.

Generación de un modelo esferoide tridimensional de invasión de células tumorales

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

Los procesos de invasión del cáncer de vejiga representan oportunidades para el desarrollo terapéutica y biomarcadores. Aquí presentamos un modelo de invasión de cáncer de vejiga que incorpora 3D cultura de esferoides tumorales, proyección de imagen de Time-lapse y microscopía confocal. Esta técnica es útil para definir las características del proceso invasivo y para la detección de agentes terapéuticos.

Sistema del cultivo celular 3-d para invasión de estudiar y evaluar la terapéutica en el cáncer de vejiga

El microambiente tumoral es una parte esencial del crecimiento del cáncer y la invasión. Para imitar la progresión del carcinoma, se necesita una matriz humana biológicamente relevante. Este Protocolo introduce una mejora para el ensayo de invasión de esferoide tridimensional in vitro aplicando una matriz basada en Leiomioma humana. El protocolo también introduce un análisis de invasión celular basado en computadora.

Matriz basada en tumores completamente humana en ensayo de invasión de esferoide tridimensional

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides. Este dispositivo permite imágenes dinámicas o longitudinales de fluorescencia de esferoides de células cancerosas. El protocolo también ofrece un procedimiento simple de procesamiento de imágenes para el análisis de la invasión de células cancerosas.

Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

La invasión es un fenómeno biológico importante en el desarrollo y la progresión del cáncer. Este proceso está influenciado por las células no neoplásicas y los componentes del microambiente tumoral. El propósito de este estudio es describir un método alternativo para analizar la invasión de células tumorales in vitro utilizando cultivos tridimensionales (3D).

Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

Aprende a realizar ensayos de invasión tumoral 3D utilizando esferoides y matrices de membrana basal. Este método semi-automatizado permite estudiar la progresión del cáncer en un entorno fisiológicamente relevante para investigación oncológica.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

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