Medición de la fuerza isométrica máxima generada por las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas

El objetivo general de este procedimiento es medir la capacidad máxima de generación de fuerza isométrica de las fibras individuales a partir de muestras de músculos esqueléticos químicamente permanentes. Esto se logra exponiendo primero las membranas de las fibras musculares a un detergente químico, eliminando así la barrera entre los contenidos extracelulares e intracelulares. El segundo paso es extraer una fibra individual de un pequeño haz de fibras y unirla al aparato experimental.

A continuación, se utilizan patrones de interferencia láser para establecer la longitud óptima del sarcómero para la fibra individual. Finalmente, se administra calcio para provocar la máxima fuerza de contracción isométrica. En última instancia, la técnica de fibra única de perme proporciona una evaluación de las propiedades contráctiles del músculo esquelético sin las complejidades asociadas con la arquitectura del músculo completo.

La demostración visual de este método es útil, ya que los pasos clave para realizar el protocolo con éxito pueden ser difíciles de aprender. Comience por preparar las soluciones de disección, almacenamiento y prueba como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, utilice pinzas para preparar los bucles de sutura a partir de hebras de sutura de nailon USP 10 sin monofilamento.

Usando la técnica de doble nudo simple, prepare cuatro bucles para cada fibra que se va a probar. Una vez formado, coloque el nudo bajo un microscopio y reduzca su tamaño a aproximadamente 750 micrómetros de diámetro. Usando las marcas IPS GTI como guía.

A continuación, recorta el exceso de sutura, dejando sólo el bucle y las pequeñas colas de 500 micrómetros a cada lado. Transfiera una pequeña masa de tejido muscular obtenida mediante biopsia abierta o con aguja a un plato que contenga solución de disección fría y agregue más solución de disección para asegurarse de que el tejido permanezca sumergido. Inspeccione la muestra bajo el microscopio y manipule para alinear el eje longitudinal de las fibras hacia el hombro derecho del investigador.

A continuación, ancle la muestra a la placa sujetándola en las esquinas con las pinzas en la mano izquierda y las microtijeras de disección en la derecha. Comience a diseccionar suavemente un haz a lo largo de los márgenes longitudinales entre las fibras. Retire y deseche cualquier tejido que haya sido dañado por las pinzas o los clavos.

Como resultado del proceso de disección, transfiera los paquetes de la solución de disección a un vial de tres mililitros que contenga 2,5 mililitros de solución de disección fresca y refrigerada con un detergente no iónico agregado. Incubar la muestra en hielo durante 30 minutos con agitación suave ocasional y asegurarse de que los paquetes permanezcan sumergidos durante toda la incubación. A continuación, transfiera los paquetes a un vial que contenga una solución de disección fresca y agite suave y brevemente para eliminar cualquier resto de detergente.

Una vez enjuagados, transfiera los paquetes a un vial que contenga solución de almacenamiento refrigerada e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire el frasco del almacenamiento a cuatro grados centígrados y transfiera todos los paquetes a una taza de medicamento o plato de disección. En preparación para el almacenamiento, transfiera los paquetes a viales criogénicos etiquetados individualmente, llenos de 200 a 400 microlitros de solución de almacenamiento fresca, y asegúrese de que el paquete no esté pegado al costado del tubo o flotando en la superficie.

A continuación, tape el tubo y almacene la muestra a menos 80 grados centígrados. Establezca un aparato experimental como el que se muestra aquí y se atribuye en el protocolo de texto adjunto. Luego llene la primera cámara experimental con solución relajante, la segunda cámara con solución prerreactivadora y la tercera con solución activadora.

Ajuste la temperatura en la cámara hasta que esté estable a 15 grados centígrados con el aparato en la solución relajante. Enrosque dos de los bucles de sutura preparados en las superficies de fijación de acero inoxidable que se extienden desde el transductor de fuerza y el controlador de longitud. A continuación, descongele un haz de fibra de interés en hielo durante unos 15 minutos y luego transfiéralo a una placa de Petri chapada en elastómero de silicona llena de una solución relajante fresca y fría.

Asegure el paquete en su lugar con clavos en cada extremo y asegúrese de que esté sumergido con las pinzas. Agarre una fibra por un extremo y comience a extraerla suavemente a lo largo de su eje longitudinal. Se debe tener cuidado al extraer las fibras del haz, ya que las adherencias entre las fibras y la matriz extracelular pueden resultar en una tensión excesiva y, en última instancia, provocar daños inducidos por el estiramiento.

Una vez extraído, introducir la fibra en una punta de pipeta modificada junto con una pequeña cantidad de solución relajante y transferirla a la cámara experimental que contiene la solución relajante guiando suavemente con las pinzas. Retire la fibra de la punta de la pipeta y fíjela al controlador de longitud. Usando el primer bucle de sutura, manipule el otro extremo de la fibra hacia el transductor de fuerza y asegure la fibra usando el mismo procedimiento.

Retire el exceso de sutura con las tijeras de microdisección. A continuación, pase el segundo bucle sobre el primero y ancle la fibra en un punto a menos de 0,2 milímetros del extremo de la superficie de fijación del controlador de longitud. Repita con el segundo bucle en el extremo del transductor de fuerza de la fibra.

Ajuste la posición del controlador de longitud en la dirección del eje Y para alinear la fibra paralela a las paredes laterales de la cámara experimental. A continuación, inspeccione la fibra utilizando la vista lateral del prisma y ajuste la posición del controlador de longitud en la dirección del eje Z hasta que la fibra quede paralela al suelo de la cámara. Si la fibra está dañada de alguna manera, la fibra debe desecharse y se debe adjuntar una nueva fibra.

Encienda el láser y ajuste la posición de la etapa de modo que el láser pase por el centro de la fibra. A continuación, ajuste la longitud del sarcómero aumentando o disminuyendo la tensión en la fibra utilizando el controlador de micrómetro del eje X del controlador de longitud hasta que se observe el espaciado deseado de la luz difractada en la pantalla de destino. Una vez que se haya establecido la longitud óptima del sarcómero, mida la distancia entre las dos suturas más internas.

Coloque la cámara de manera que la cruz vertical del ocular quede alineada en el borde más interno de una sutura interior y cero. La lectura digital en la unidad del micrómetro traslada la platina a lo largo del eje x en relación con el microscopio hasta que la cruz vertical del ocular se alinea con la sutura más interna. La pantalla digital indicará la longitud de la fibra, mantendrá la fibra en la longitud medida y utilizará la cámara montada en el microscopio para capturar una imagen de gran aumento de la parte central de la fibra desde la vista superior y lateral.

Utilice estas imágenes para calcular el área de la sección transversal de la fibra. Utilice el software de control de la cámara para mover la fibra a la cámara que contiene la solución de preactivación e incubar allí durante tres minutos. Mientras la fibra es una solución inactivadora, mida su tensión pasiva, luego mueva la fibra a la cámara que contiene la solución activadora y permita que se desarrolle la fuerza isométrica máxima, como lo demuestra una meseta en la fuerza que está precedida por un rápido aumento.

A continuación, utilice el controlador de longitud para aplicar una gran reducción rápida y breve en la distancia entre los puntos de conexión de la fibra, seguida de un retorno rápido a la longitud original para identificar la salida del transductor de fuerza que corresponde a cero. La fuerza que se muestra aquí son las vistas superior y lateral de una fibra de forma elíptica de estas vistas. El área de la sección transversal se determinó midiendo los diámetros en cinco puntos a lo largo de la longitud de la fibra y luego calculando el promedio de las cinco áreas resultantes.

Los trazos de fuerza de las fibras musculares humanas, lentas y rápidas, ilustran que las fibras rápidas generan fuerza a un ritmo mayor que las fibras lentas utilizando la técnica que se muestra en este video. Se midieron las características típicas de las fibras musculares humanas de ratón y rata, que se presentan aquí. El rango que se muestra indica los cuartiles 25 a 75 y el N es el número de fibras probadas.

Nótese la amplia variación en la fuerza específica entre las diferentes especies. Los procedimientos descritos aquí dan como resultado la evaluación de la capacidad máxima de generación de fuerza intrínseca de una sola fibra muscular esquelética mediante la adición de intervenciones adicionales, aspectos importantes de la fisiología del músculo esquelético, que incluyen, entre otros, la fuerza de longitud, la fuerza, la velocidad y la fuerza. Las relaciones con el calcio pueden ser reveladas.