Name: Medición de la fuerza isométrica máxima generada por las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprende a medir la fuerza isométrica máxima en fibras musculares esqueléticas permeabilizadas mediante detergentes químicos y láser. Este método permite evaluar propiedades contractiles sin la complejidad del músculo completo.

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Las evaluaciones de las propiedades contráctiles de las fibras musculares esqueléticas individuales permeabilizadas se utilizan para investigar la función muscular en una amplia variedad de contextos. Los ejemplos incluyen los estudios que han evaluado los efectos del envejecimiento 12, ejercer 10,13,14, 15, vuelo espacial lesiones 2,3,16, tratamientos de drogas, enfermedad 17,18 19 y manipulación genética 20,21 en la estructura y función de la fibra. Debido a la capacidad de evaluar directamente el rendimiento contráctil de miofibrillas en su configuración nativa, esta técnica proporciona una plataforma atractiva desde el cual para formar una comprensión de la función miofibrilar ausente de los efectos de confusión potenciales que están presentes cuando la transmisión de la señal neuromuscular y la liberación de calcio inducida por excitación- están incluidos en el sistema bajo estudio. Además, las pruebas funcionales de las fibras individuales se puede utilizar para complementar los resultados de la identificación de proteínas contráctiles tales como lasobtenida a través de inmunohistoquímica o electroforesis en gel + western blot 22. Una de las funciones primarias de músculo esquelético es para generar la fuerza. En consecuencia o sF, una medida de la capacidad de generación de fuerza intrínseca de un sistema contráctil, es de gran interés para los fisiólogos musculares. Estimaciones fiables de sF o requieren medidas precisas de ambos CSA fibra y Fo. Puesto que las fibras son, en general, ni circular en sección transversal, ni uniformes en CSA largo de su longitud, el gran cuidado se deben tomar cuando se estima CSA. Para este fin, las mediciones se realizan en varios lugares a lo largo de la longitud de la fibra y, en cada lugar, desde dos perspectivas separadas por 90 °. Medidas fiables de Fo requieren atención a varios detalles que incluyen contabilidad de fuerza pasiva, ajustando la longitud del sarcómero para maximizar la superposición de filamentos gruesos y delgados, empleando una solución de activación con una concentración de calcio tresultados sombrero en la activación máxima, manteniendo la temperatura experimental deseada, y el mantenimiento de las condiciones óptimas de almacenamiento (temperatura y duración) de las fibras anteriores del día del experimento. Si bien los pasos descritos aquí describen el procedimiento para la evaluación de la fuerza isométrica máxima, con frecuencia es deseable evaluar otras cualidades funcionales importantes de las fibras musculares esqueléticas. Esto se puede lograr mediante la ampliación del protocolo experimental para incluir manipulaciones mecánicas adicionales de la fibra. Por ejemplo, la medición de la velocidad a la que la fibra se acorta en contra de una serie de diferentes cargas permite la determinación de la relación fuerza-velocidad, desde el que las relaciones de fuerza de potencia y la velocidad de potencia se pueden calcular 10,23,24. Además, la velocidad de acortamiento sin carga se puede determinar mediante el empleo de la &quot;prueba de holgura&quot; 25, que consisten en la aplicación de una serie de pasos de acortamiento de holgura inductor y measuring el tiempo requerido por la fibra para eliminar la holgura. Otro parámetro cinética que se reporta con frecuencia es k tr, la constante de velocidad para la fuerza de reurbanización tras una perturbación mecánica que separa temporalmente toda enlaces cruzados 26. Finalmente, la relación entre la concentración de calcio y la generación de fuerza activa (la &quot;relación fuerza-PCA&quot;) es a menudo de interés 18 y se puede determinar mediante la exposición de la fibra a una serie de soluciones con concentraciones de calcio que van desde por debajo del umbral para la activación del contráctil sistema para aquellos suficiente para provocar la activación máxima y por lo tanto la fuerza máxima (F o). Aunque gran parte de los equipos mencionados se necesita para evaluar la contractilidad sola fibra, otros equipos no es absolutamente necesario. El controlador longitud, por ejemplo, es esencial para cualquier protocolo experimental que requiere alargamiento o acortamiento rápida o precisa de la fibra,pero no es absolutamente necesario para la evaluación de la fuerza isométrica máxima (aunque un nivel de fuerza cero en el registro de la fuerza aún debe ser identificado por algunos medios). Los prismas que permiten la observación de la fibra desde el lado, si bien son útiles para la evaluación de área de sección transversal, no son absolutamente necesarios cuando el posicionamiento de la fibra dentro de la cámara experimental. Además, medios alternativos para la exposición de la fibra a las diversas soluciones experimentales podría ser empleado, incluyendo la elaboración de un sistema de accionamiento manual de cámaras o una cámara única que permite el llenado rápido y el vaciado de las soluciones. Finalmente, mientras que las temperaturas experimentales sub-fisiológicos tales como 15 ° C se utilizan comúnmente para mejorar la reproducibilidad de las mediciones mecánicas 1,2,3,5,8,12,17,27, es posible generar datos válidos a otras temperaturas 23 28, siempre y cuando los efectos de la temperatura sobre las propiedades de la solución (concentración de calcio, pH, etc.) se toman en consideración. </p&gt; Las composiciones de las soluciones de pruebas son algunos de los aspectos más críticos de las técnicas de fibra permeabilizadas descritos aquí. Consideraciones con respecto a composición de la solución son complejos y más allá del alcance de este artículo. Las soluciones descritas en el paso 5 de la sección de protocolo están diseñados con un énfasis en la rápida activación de la fibra permeabilizada sobre su transferencia desde la pre-activación para activar soluciones mientras se mantiene una fuerza constante iónica, composición catiónica, y la osmolaridad 6,29. Otros enfoques de la composición de la solución se han empleado con éxito notable por otros grupos de investigación y por lo general hacer uso de las constantes de unión publicados y herramientas computacionales 27,30,31. Las concentraciones de iones de calcio en las diversas soluciones de activación es particularmente importante en los estudios que implican la activación submáxima tales como evaluaciones de fuerza-PCA. Para los experimentos en los que las fibras están totalmente activadas, tales como las describird aquí, la concentración de calcio en la solución de activación normalmente supera por un margen cómodo que requiere para lograr la máxima fuerza, por lo que su conocimiento preciso menos crítica. La adición de fosfato de creatina es importante para amortiguar las fluctuaciones intramyofibrillar ATP y ADP que de otro modo estarían asociados con la actividad contráctil. Se requiere creatina quinasa para catalizar la transferencia de fosfato a partir de fosfato de creatina al ADP. Bajo condiciones experimentales que dan lugar a altas tasas de rotación de ATP, incluyendo el trabajo a altas temperaturas o medir acortamiento de alta velocidad en las fibras rápidas 32, la creatina quinasa debe ser añadido a la solución para complementar la creatina quinasa endógena que permanece unido a la fibra. Para las condiciones experimentales menos exigentes, el sistema de regeneración de ATP es menos crítico 27. Limitaciones de la técnica de una sola fibra permeabilized incluyen los siguientes. Los datos generados por estas pruebas definen elpropiedades contráctiles de la unidad miofibrilar específico que se une al aparato experimental. En consecuencia, esta captura sólo una pequeña fracción de toda la fibra multinucleadas del que se obtuvo el segmento que, a su vez, representa una pequeña fracción del número total de fibras dentro del músculo. Por tanto, los investigadores deben considerar cuidadosamente el muestreo necesario para apoyar las conclusiones extraídas de los experimentos. Además, la evaluación del impacto de una intervención práctica de ejercicio en función de la fibra presume que las fibras evaluadas fueron efectivamente reclutados durante el entrenamiento. Aunque el protocolo intenta imitar el medio intracelular natural de la fibra, el proceso de permeabilización sarcolema no es específica y necesariamente permite constituyentes intracelulares solubles para difundir libremente en las soluciones de baño. Una consecuencia adicional de la permeabilidad de la membrana es un cambio en el equilibrio osmótico se evidencia por una hinchazón en volumen de fibras 33. Loshinchazón de la fibra aumenta la distancia entre los filamentos de actina y miosina que resulta en reducción de la sensibilidad de calcio del sistema myofilament 34,35, pero puede ser revertida por la introducción de compuestos grandes, osmóticamente activos 34. Una limitación final a considerar es la consecuencia de la técnica utilizada para fijar las fibras al aparato experimental. Esto requiere invariablemente que distorsionan la relación espacial dentro del sistema de filamento en y cerca de los puntos de fijación, con la asistencia a los déficits funcionales. Específicamente, las regiones de la fibra en y adyacente a los puntos de fijación están funcionalmente comprometidas y por lo tanto contribuyen elasticidad serie de artefactos para el sistema de medición. En resumen, hemos descrito un medio por el cual para evaluar la capacidad de generación de fuerza de las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas químicamente in vitro. Aunque el foco de este artículo ha sido sobre la evaluación de la fuerza isométrica máxima generatincapacidad g de fibras de músculo esquelético humano, el enfoque experimental puede ser modificado y ampliado para determinar una variedad de parámetros cinéticos y las relaciones a través de una gama de especies de mamíferos, o de otra manera.

La función primaria del músculo esquelético es para generar la fuerza. La fuerza muscular se provoca in vivo a través de una compleja secuencia de eventos que incluye los potenciales de acción del nervio motor, la transmisión neuromuscular, los potenciales de acción de la fibra muscular, liberación de calcio intracelular, y la activación del sistema de proteínas reguladoras y contráctiles. Debido a la generación de fuerza es el resultado final de esta secuencia, un déficit en la fuerza podría ser causada por el fallo de uno o más de los pasos individuales. Un atributo clave de la preparación de la fibra permeabilizadas es que elimina la mayor parte de los pasos necesarios para la generación de la fuerza in vivo, con sólo las funciones de regulación y contráctiles asociados con el aparato miofibrilar restante. El investigador asume el control de la entrega de la activación de calcio y energía (ATP), y es recompensado con un sistema simplificado que permite la evaluación de las estructuras de regulación y contráctiles aislados en su co nativanfiguration. Las mediciones de la fuerza utilizando fibras musculares esqueléticas permeabilizadas son por lo tanto valioso al evaluar las alteraciones en la función muscular observada in vivo. Por ejemplo, hemos utilizado esta técnica para caracterizar la capacidad de generación de fuerza de fibras a partir de ratones deficientes en miostatina 1 y para evaluar la causa de la debilidad muscular persistente exhibido siguiente rotadores crónica del manguito de lágrimas 2,3. Metodología de fibra permeabilizada moderna se remonta a principios de los estudios influyentes 4,5 y está actualmente en uso por un número de grupos de investigación. Aunque las técnicas se han descrito en la literatura, que aún no se han presentado en formato de vídeo. El objetivo de este artículo es ilustrar una versión actualizada, técnica válida y fiable para medir la capacidad máxima fuerza generadora de fibras individuales de las muestras de músculo esquelético permeabilizadas químicamente. Para lograr esto, un segmento de fibra individual (denominado en este documento como un ̶0; fibra &quot;) se extrae de un paquete pre-permeabilizadas de fibras y se colocan en una cámara experimental que contiene una solución relajante, la característica que define que es una concentración de calcio que es &lt;10 nM. La fibra se adjunta a continuación, en un extremo a un transductor de fuerza y ​​en el otro extremo a un controlador longitud. Con la fibra celebrada en una longitud óptima del sarcómero, se transfiere a una solución de activación que tiene una concentración de calcio suficiente para provocar la activación máxima y así la máxima fuerza de contracción isométrica. Los datos de fuerza son adquiridos, almacenados y analizados utilizando una computadora personal.

<table><tbody><tr><td>Tubo de ensayo de cultivo de poliestireno con tapón</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-956-3D</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga con tapón de rosca de 0,5 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-334</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de microcentrífuga de 0,5 ml con junta tórica</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-358</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga criobox</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>5055-5005</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Mettler-Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Sutura no estéril 10-0 monofilamento</td><td>Ashaway Line Twine</td><td>S30002</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems</td><td>El micrómetro MZ8</td><td></td></tr><tr><td>acciona el</td> termómetro <td>Parker Hannifin</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Circulador de baño de agua&nbsp;</td><td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Aplha Omega Instruments</td><td>Serie 800</td><td></td></tr><tr><td>Software LabVIEW</td><td>National</td> <td>Instruments-Computer</td><td></td></tr><tr><td></td> Sistema <td>de</td><td></td> cámara <td>variada</td></tr> <tr><td></td><td>Aurora Scientific</td><td>802D</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de longitud</td><td>Aurora Scientific</td><td>312C</td><td></td></tr><tr><td>Transductor de fuerza</td><td>Aurora Scientific</td><td>403A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reactivos</td></tr><tr><td>K-proprionato</td><td>TCI America</td><td>P0510</td><td></td></tr><tr><td>Imadizol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Brij 58</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (ácido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2ATP&bull; 0.56H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (ácido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>MgO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529699</td><td></td></tr><tr><td>HDTA (ácido)</td><td>TCI America</td><td>D2019</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>KOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>35113</td><td></td></tr><tr><td>HCL (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949</td><td></td></tr><tr><td>Na2CrP&bull; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 estándar</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB115</td><td></td></tr><tr><td>pH 7 estándar</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB107</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de la fuerza isométrica máxima generada por las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

El análisis de las propiedades contráctiles de las fibras musculares esqueléticas químicamente despellejadas, o permeabilizadas, ofrece un poderoso medio para evaluar la función muscular a nivel de la célula muscular individual. Los estudios de fibras musculares individuales son útiles tanto en la ciencia básica como en los estudios clínicos. Para estudios básicos, las mediciones de la contractilidad de una sola fibra muscular permiten investigar los mecanismos fundamentales de la producción de fuerza y analizar la función muscular en el contexto de las manipulaciones genéticas. Clínicamente, los estudios de fibras musculares individuales proporcionan información útil sobre el impacto de las lesiones y enfermedades en la función muscular, y pueden utilizarse para guiar la comprensión de las patologías musculares. En este artículo de video describimos los pasos necesarios para preparar y aislar un segmento individual de fibra muscular esquelética, conectarlo a un aparato de medición de fuerza, activarlo para producir la fuerza isométrica máxima y estimar su área de sección transversal con el fin de normalizar la fuerza producida.

Fibras individuales Saludables, permeabilizadas químicamente deben aparecer uniforme en forma y tener un espaciado entre estrías coherente cuando se observa bajo una gran ampliación. Las fibras que son inflexibles cuando se manipula con las pinzas o tienen daños estructurales evidentes deben ser desechados. Imágenes digitales de alta magnificación tomadas durante el paso 15 se analizan para 5 mediciones de diámetro a lo largo de pares de la sección media de la fibra. Fibra CSA se estima suponiendo una sección transversal elíptica y un promedio de 5 mediciones individuales CSA como se representa en la figura 7A. La Figura 7B también sirve para ilustrar cómo dimensiones de las fibras en una sola vista puede ser significativamente diferente en comparación con las dimensiones pareadas en la otra vista (es decir, transversal secciones no son, en general, redonda). Rastros de fuerza representativos de fibras lentas y rápidas humanos se muestran en las Figuras 8A y 8B, respectivamente. Voltagsalida e de la fuerza-transductor se adquiere durante una prueba y se convierte en la fuerza (mN) usando adquisición de datos y el software de análisis (LabVIEW). La Figura 9 ilustra el enfoque utilizado para evaluar la fuerza activa máxima (F o), que se calcula restando la fuerza requerida para mantener la fibra en longitud óptima del sarcómero mientras que en un estado relajado (fuerza pasiva, F P), de la mayor fuerza isométrica desarrollado durante la activación de fibra máxima (fuerza total, F T). Desde la salida de la fuerza-transductor que corresponde a fuerza cero es, en general, diferente para cada una de las diferentes cámaras de baño, que aflojamos brevemente la fibra, tanto en la pre-activación y la activación de soluciones para capturar el nivel de fuerza cero en el registro experimental. La normalización de la fuerza activa máxima por la fibra CSA se utiliza para generar el valor más informativo de la fuerza específica (SF o). Debido a que toma en consideración el CSA de la fibra, SF o </sub&gt; proporciona una medida de la capacidad de generación de la fuerza intrínseca del aparato contráctil de la fibra, lo que permite comparaciones funcionales entre las fibras de tamaños dispares. Debe, sin embargo, cabe señalar que las mediciones de CSA no son capaces de distinguir la proporción de la fibra ocupada por filamentos contráctiles frente a la proporción ocupada por otras estructuras subcelulares. Las características típicas de salud, fibras adultos de Claflin et al. 2011 10 para el consumo humano, Mendias et al. 2011 1 de ratón y Gumucio et al. 2012 2 de rata se detallan en la Tabla 3. Todos los datos que se presentan en la Tabla 3 fueron generados utilizando el técnicas descritas en este artículo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Humano (Vasto externo) </strong&gt; </td><td> Ratón (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> Rata (Infraespinoso) </td></tr><tr><td colspan="2"> Masculino </td><td colspan="2"> Femenino </td><td> Masculino </td><td> Masculino </td></tr><tr><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> (No escrito) </td><td> (No escrito) </td></tr><tr><td> CSA (m 2) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> Fo (mN) </td><td> 0,79-1,17 </td><td> 1,02-1,54 </td><td> 0,64 a 0,97 </td><td> 0,71-1,07 </td><td> 0,14 hasta 0,25 </td><td> 0,55 hasta 0,97 </td></tr><tr><td> sF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Características típicas de fibras adultos sanos de vasto lateralis humana 10, extensor largo de los dedos del ratón y la rata infraespinoso 1 2 músculos. Longitudes óptimas sarcómero se fijó en 2,7 micras para las fibras humanas 7,8 y 2,5 micras, tanto para ratón (36, 37) y fibras de rata (38). Rangos Experimental L F (25 º y 75 º cuartiles) fueron 1,39 a 1,73 mm, 1,17 a 1,53 mm y 1,32 a 1,59 mm para humanos, ratones y ratas, respectivamente. Los rangos mostrados indican los 25 º y 75 º cuartiles y n es el número de fibras probadas. Los problemas más comunes experimentados durante las pruebas incluyen una hoja de lazo de sutura, lo cual resulta en una fuerza response con una &quot;captura&quot; tal como el ilustrado en la Figura 10A, y una lágrima de espesor parcial o total de la fibra, lo que resulta en una respuesta de fuerza que vuelve bruscamente hacia o para (rotura) de cero mientras que la fibra está todavía inmerso en la activación de solución (Figura 10B). Si un resbalón, desgarro o ruptura se produce durante un experimento, la fibra debe ser desechada y los datos excluidos, aunque se mantiene un registro de los fallos en fibra también puede ser informativo 11. Otro resultado negativo que se puede encontrar es la activación prematura de la fibra, mientras que en la solución (Figura 10C) pre-activación. Activación parcial en la solución de pre-activación sugiere la contaminación cruzada así significativo (es decir, un aumento no intencional en la concentración de calcio en la pre-activación de bien). En este caso, todos los baños deben ser aspiradas y se enjuagan bien con agua desionizada. El secado de las superficies divisorias entre las cámaras también es recomended como la humedad o condensación en estas áreas puede conducir a la mecha de la solución entre baños. La decisión de incluir o excluir datos en última instancia, dependerá del enfoque experimental y por lo tanto deben ser considerados en el diseño del estudio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Figura 1: bucle de sutura (10-0 sutura con monofilamento de nylon). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Figura 2:. Disección Bundle fórceps están en la mano izquierda, tijeras de microdisección están en la mano derecha. La línea roja indica la orientación favorable de la muñeca y tijeras con los ejes longitudinales de las fibras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; (A) un aparato de pruebas con componentes etiquetados. (A) cámaras experimentales con fondos transparentes. (B) Longitud-controlador. (C) Fuerza-transductor. (D) Fuente de luz. (E) Longitud-controlador de la unidad micrómetro xyz con pantalla digital. (F) Unidad Etapa micrómetro con pantalla digital. (G) Fuerza-transductor unidad micrómetro xyz. (H) Plataforma de calibrado pantalla de destino láser de difracción. Mesa de aislamiento (i) de la vibración. (B) Vista de primer plano de las cámaras experimentales. Superficie (j) de fijación de acero inoxidable que se extiende desde el controlador de longitud. Superficie (k) de fijación de acero inoxidable se extiende desde el transductor de fuerza. (L) Vista lateral del prisma. (M) de Vivienda para los módulos de refrigeración termoeléctricos. (N) Termopar para reportar te cámaramperatura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Figura 4: Modificado 100 punta de la pipeta l utilizado para transferir la fibra de plato de la disección de cámara experimental. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Figura 5:. Montaje sola fibra en aparato experimental (A) bucles de sutura preparados rosca sobre superficies de fijación de acero inoxidable. (B) Fibra transferido a la cámara experimental. (C) de la fibra anclado a las superficies de fijación de acero inoxidable por primera par de bucles de sutura con el exceso de sutura eliminado. (D) Segundo par de bucles de sutura roscados sobre la parte superior de la primera bucles de sutura y atados en su lugar. <img alt="Figura 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6: la longitud del sarcómero se evalúa mediante la proyección de un patrón de interferencia de láser sobre una pantalla de destino calibrado (a) fuente láser.. (B) Espejo. (C) la pantalla de destino. Patrón de interferencia (d) láser. <img alt="Figura 7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="Figura 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Figura 7: (A) Determinación de la zona de la fibra de la sección transversal a la longitud óptima del sarcómero (humanos = 2,7 micras). Suponiendo una sección transversal elíptica, CSA se calcula para cada uno de los cinco lugares a lo largo de la sección media de la fibra y la media de las cinco mediciones individuales se informa como fibra CSA. 2a representa la parte superior de diámetro y es vista<html> uno de los ejes de la elipse, 2b representa la vista lateral de diámetro y es el otro eje de la elipse. (B) Las imágenes de fibra representativos que ilustran cada una de las cinco medidas del diámetro correspondientes tomadas tanto en la vista superior y lateral. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Figura 8: rastros de fuerza representativas de vasto humano sano lateralis fibras musculares (A) Tipo 1 fibra (CSA: 5.710 m 2, H o: 0,89 mN y SF o: 156 kPa).. (B) Tipo de fibra 2a (CSA: 9.510 m 2, Fo: 1,66 mN y SF o: 174 kPa). Miosina de fibra Tipo de cadena pesada se determinó mediante el uso de técnicas de separación electroforética y tinción con plata 22. oad / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9: Cálculo de la fuerza activa máxima (F o) (a) Vista ampliada de la respuesta de la fuerza de la fibra durante el movimiento holgura inductores de longitud controlador iniciado en solución pre-activación.. F P es la fuerza requerida para mantener una longitud del sarcómero de 2,7 micras con la fibra en reposo. (B) Vista Ampliada de longitud-controlador de movimiento holgura inductores. Tenga en cuenta que F o = F T - F P. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Figura 10: deslizamiento (A) de bucle de sutura, lo demuestra un &quot;retén&quot; en vigor rastro durante el aumento de la fuerza. Revise para asegurarse de que los bucles son seguras antes de activar la fibra. (B) ruptura de la fibra durante la activación. Puede ser debido a una mala integridad de la fibra o el tratamiento de fibra agresivo durante cabo lazo de suturación. (C) la activación de fibra parcial prematura debido a la contaminación de la cámara de pre-activación con Ca 2+.

Análisis de las propiedades contráctiles de las fibras musculares, esqueléticas químicamente piel o permeabilizadas ofrece un poderoso medio de la cual evaluar la función muscular a nivel de la célula muscular individual. En este artículo describimos una técnica válida y fiable para preparar y probar permeabilized fibras musculares esqueléticas in vitro.

Medición de la fuerza isométrica máxima generada por las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la capacidad máxima de generación de fuerza isométrica de fibras individuales procedentes de muestras de músculo esquelético permeabilizadas químicamente. Esto se logra primero exponiendo las membranas de las fibras musculares a un detergente químico, eliminando así la barrera entre los contenidos extracelulares e intracelulares. El segundo paso consiste en extraer una fibra individual de un pequeño haz de fibras y fijarla al aparato experimental.A continuación, se utilizan patrones de interferencia láser para ajustar la longitud óptima del sarcómero en la fibra individual. Finalmente, se administra calcio para provocar la fuerza máxima de contracción isométrica. En definitiva, la técnica de fibra única permeabilizada permite evaluar las propiedades contráctiles del músculo esquelético sin las complejidades asociadas con la arquitectura del músculo completo.La demostración visual de este método es útil, ya que los pasos clave para realizar correctamente el protocolo pueden ser difíciles de aprender. Comience preparando las soluciones de disección, almacenamiento y prueba según se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, use pinzas para preparar lazos de sutura a partir de hebras de sutura de nailon monofilamento USP 10 cero.Utilizando la técnica del nudo doble de ballestrinque, prepare cuatro lazos para cada fibra que se vaya a probar. Una vez formado, coloque el nudo bajo un microscopio y reduzca su tamaño hasta un diámetro aproximado de 750 micrómetros, utilizando las marcas del IPS GTI como guía.Luego, corte cualquier exceso de sutura, dejando solo el lazo y pequeñas colas de 500 micrómetros a cada lado. Transfiera una pequeña masa de tejido muscular obtenida mediante biopsia abierta o con aguja a un recipiente que contenga solución de disección fría y agregue más solución de disección para asegurar que el tejido permanezca sumergido. Inspeccione la muestra bajo el microscopio y manipúlela para alinear el eje longitudinal de las fibras hacia el hombro derecho del investigador.Luego sujete la muestra al recipiente sujetándola en las esquinas con la pinza en la mano izquierda y las tijeras de disección microscópica en la derecha. Comience a diseccionar suavemente un haz a lo largo de los márgenes longitudinales entre las fibras. Retire y deseche cualquier tejido dañado por la pinza o las agujas.Como resultado del proceso de disección, transfiera los fragmentos desde la solución de disección a un vial de tres mililitros que contenga 2,5 mililitros de solución de disección fresca y fría, a la cual se le ha añadido un detergente no iónico. Incube la muestra en hielo durante 30 minutos con agitación suave ocasional, asegurándose de que los fragmentos permanezcan sumergidos durante toda la incubación. A continuación, transfiera los fragmentos a un vial que contenga solución de disección fresca y agite suavemente y brevemente para eliminar cualquier resto de detergente.Una vez enjuagados, transfiera los haces a un vial que contenga solución de almacenamiento fría e incube durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, retire el vial del almacenamiento a cuatro grados Celsius y transfiera todos los haces a una copa de medicina o a una fuente de disección. Como preparación para el almacenamiento, transfiera los haces a viales criogénicos etiquetados individualmente, llenos con 200 a 400 microlitros de solución de almacenamiento fresca, y asegúrese de que el haz no esté adherido al costado del tubo ni flotando en la superficie.Luego tape el tubo y almacene la muestra a menos 80 grados Celsius. Configure un aparato experimental como el que se muestra aquí y se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, llene la primera cámara experimental con solución relajante, la segunda cámara con solución preactivadora y la tercera con solución activadora.Ajuste la temperatura en la cámara hasta que se estabilice a 15 grados Celsius con el aparato en la solución relajante. Pase dos de los lazos de sutura preparados por las superficies de sujeción de acero inoxidable que sobresalen tanto del transductor de fuerza como del controlador de longitud. A continuación, descongele un haz de fibras de interés sobre hielo durante aproximadamente 15 minutos y luego transfiéralo a una placa de Petri recubierta de elastómero de silicona llena con solución relajante fresca y fría.Sujete el haz en su lugar con alfileres en cada extremo y asegúrese de que esté sumergido utilizando la pinza. Sujete una fibra en un extremo y comience a extraerla suavemente a lo largo de su eje longitudinal. Se debe tener cuidado al extraer las fibras del haz, ya que las adherencias entre las fibras y la matriz extracelular pueden generar tensión excesiva, lo que finalmente podría provocar daños inducidos por estiramiento.Una vez extraída, introduzca la fibra en una punta de pipeta modificada junto con una pequeña cantidad de solución relajante y transfiérala a la cámara experimental que contiene la solución relajante, guiándola suavemente con la pinza. Retire la fibra de la punta de pipeta y ánclela al controlador de longitud. Utilizando el primer lazo de sutura, manipule el otro extremo de la fibra hacia el transductor de fuerza y asegure la fibra utilizando el mismo procedimiento.Retire cualquier exceso de sutura utilizando las tijeras de disección microquirúrgicas. A continuación, pase el segundo lazo sobre el primero y ancle la fibra en un punto situado a menos de 0,2 milímetros del extremo de la superficie de fijación del controlador de longitud. Repita el procedimiento con el segundo lazo en el extremo de la fibra conectado al transductor de fuerza.Ajuste la posición del controlador de longitud en la dirección del eje Y para alinear la fibra paralela a las paredes laterales de la cámara experimental. Luego, examine la fibra utilizando la vista lateral del prisma y ajuste la posición del controlador de longitud en la dirección del eje Z hasta que la fibra esté paralela al fondo de la cámara. Si la fibra está dañada de alguna manera, debe descartarse y colocarse una fibra nueva.Encienda el láser y ajuste la posición del portaobjetos de manera que el láser pase por el centro de la fibra. Luego, establezca la longitud del sarcómero aumentando o disminuyendo la tensión sobre la fibra mediante el micrómetro del controlador de longitud en el eje X, hasta que se observe en la pantalla objetivo el espaciado deseado de la luz difractada. Una vez establecida la longitud óptima del sarcómero, mida la distancia entre las dos suturas más internas.Coloque la cámara de manera que el hilo de referencia vertical del ocular se alinee con el borde más interno de una sutura interna y se posicione en cero. La lectura digital del micrómetro accionará el desplazamiento del portaobjetos a lo largo del eje x con respecto al microscopio hasta que el hilo de referencia vertical del ocular se alinee con la sutura más interna. La pantalla digital indicará la longitud de la fibra, mantenga la fibra a la longitud medida y utilice la cámara montada en el microscopio para capturar una imagen de alta magnificación de la porción central de la fibra, tanto desde la vista superior como desde la vista lateral.Utilice estas imágenes para calcular el área de la sección transversal de la fibra. Utilice el software de control de la cámara para mover la fibra a la cámara que contiene la solución preactivadora e incubarla durante tres minutos. Mientras la fibra está en la solución inactivadora, mida su tensión pasiva, luego mueva la fibra a la cámara que contiene la solución activadora y permita que se desarrolle la fuerza isométrica máxima, evidenciada por una meseta en la fuerza que sigue a un aumento rápido.A continuación, utilice el controlador de longitud para aplicar una reducción rápida y breve de la distancia entre los puntos de fijación de la fibra, seguida de un retorno rápido a la longitud original, con el fin de identificar la salida del transductor de fuerza que corresponde a cero. Las fuerzas mostradas aquí corresponden a las vistas superior y lateral de una fibra con forma elíptica a partir de estas vistas. El área de la sección transversal se determinó midiendo los diámetros en cinco puntos a lo largo de la longitud de la fibra y luego calculando el promedio de las cinco áreas resultantes.Los trazos de fuerza de fibras musculares humanas, lentas y rápidas ilustran que las fibras rápidas generan fuerza a una tasa mayor que las fibras lentas, utilizando la técnica mostrada en este video. Se midieron y presentan aquí las características típicas de las fibras musculares de humanos, ratones y ratas. El rango mostrado indica los cuartiles 25 al 75 y la N es el número de fibras analizadas.Observe la amplia variación en la fuerza específica entre las diferentes especies. Los procedimientos descritos aquí permiten evaluar la capacidad máxima intrínseca de generación de fuerza de una fibra muscular esquelética individual, mediante la adición de intervenciones adicionales, aspectos importantes de la fisiología del músculo esquelético, incluyendo, entre otros, la relación longitud-fuerza, la relación fuerza-velocidad y las relaciones fuerza-calcio, que pueden revelarse.

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

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Presentamos un protocolo para evaluar los cambios en la función neuromuscular. La estimulación nerviosa eléctrica percutánea es un método no invasivo que evoca respuestas musculares. Las propiedades electrofisiológicas y mecánicas de estas respuestas permiten evaluar la función neuromuscular desde el cerebro hasta el músculo (niveles supraespinal, espinal y periférico).

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Describimos un protocolo in vivo para medir la dorsiflexión del pie tras la estimulación del nervio peroneo y la contracción del compartimento crural anterior de la extremidad posterior de la rata. Estas mediciones son una herramienta traslacional indispensable para evaluar la patología del músculo esquelético y los enfoques de ingeniería de tejidos para la reparación y regeneración muscular.

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Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

Aquí se presenta un protocolo para evaluar las propiedades contráctiles de los miofibriles musculares estriados con resolución nano-Newton. El protocolo emplea una configuración con una sonda de fuerza óptica basada en interferometría. Esta configuración genera datos con una alta relación señal-ruido y permite la evaluación de la cinética contráctil de myofibrils.

Aislamiento de myofibrils de biopsias de músculo esquelético y determinación de la función contráctil con un transductor de fuerza de resolución Nano-Newton

La evaluación de la recuperación del motor sigue siendo la medida del resultado de la referencia en estudios periféricos experimentales del nervio. La medida isométrica de la fuerza tetánica del músculo anterior de tibialis en la rata es una herramienta inestimable para evaluar resultados funcionales después de la reconstrucción de los defectos del nervio ciático. Los métodos y matices se detallan en este artículo.

Medición De La Fuerza Teánica Isométrica Máxima Del Músculo Tibial Anterior En La Rata

El presente protocolo describe detalles experimentales concisos sobre la evaluación e interpretación de los datos de par in vivo obtenidos a través de la estimulación eléctrica del nervio peroneo común en cerdos anestesiados.

In vivo Medición del par isométrico del dorsiflexor de las extremidades posteriores de Pig

Aprende a medir la fuerza isométrica máxima en fibras musculares esqueléticas permeabilizadas mediante detergentes químicos y láser. Este método permite evaluar propiedades contractiles sin la complejidad del músculo completo.

Medición de la fuerza isométrica máxima generada por las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas

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