Name: HPLC Medición de la oxidación del ADN de biomarcadores, 8-oxo-7,8-dihidro-2 desoxiguanosina, en células cultivadas y tejidos animales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Aprende a medir el biomarcador 8-oxo-dGuo en células cultivadas y tejidos animales mediante HPLC con detección electroquímica. Este protocolo minimiza la oxidación del ADN durante la preparación de muestras.

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Esta investigación fue financiada por la Iniciativa de Salud de Canadá Genómica Investigación y Desarrollo (GRDI) y la Estrategia de Regulación Canadiense de Biotecnología (letras CRSB). Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

<ol><li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+oxidation+matters%3A+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li>
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<li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice%3A+A+model+for+studying+mutations+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li>
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<li>Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection%3A+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li>
<li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li>
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<li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAzol%3A+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li>
<li>Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li>
<li>Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+DNA%3A+formation%2C+measurement+and+biochemical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li>
<li>Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: <a target="_blank" href="http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf">http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

No se declara ningún conflicto de intereses o intereses financieros contrapuestos.

Aunque 8-oxo-dGuo ha sido reportado como un biomarcador útil de la oxidación del ADN, su cuantificación fiable puede suponer un reto. Aunque existen varios métodos publicados, hay una necesidad de una visión global, descriptivo de protocolo para permitir a los investigadores a implementar el método en sus laboratorios. Aquí presentamos un resumen detallado de un protocolo basado en HPLC que permita a los nuevos usuarios para establecer un método eficaz para la detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo. <p class="jove...

Especies reactivas del oxígeno (ROS), cuyos niveles de estado estacionario puede aumentar durante muchas condiciones patológicas y el metabolismo xenotoxic, contribuyen a una mayor frecuencia de daño oxidativo del ADN. Entre varios productos de oxidación posibles nucleobases, daño oxidativo del ADN fácilmente se puede medir usando el marcador estable 8-oxo-7,8-dihidro-2 &#39;desoxiguanosina (8-oxo-dGuo), que es una de las formas oxidadas de 2&#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo es el más abundante lesión del ADN 2 y, por lo tanto, ha sido estudiado para mayor detalle como un biomarcador oxidación del ADN a pesar de la existencia de productos de oxidación de ADN múltiple 3. En los seres humanos, este daño puede ser reparado a través de la reparación por escisión de base por 8-oxoguanina glicosilasa 1 (hOGG1) 4. Si se deja sin reparar, 8-oxo-dGuo puede contribuir a la formación de mutaciones de sustitución de pares de bases (es decir, G a T transversiones) 4. Es importante destacar que, 8-oxo-dGuo es un marcador establecido fodaño en el ADN r en relación con la iniciación y promoción de la carcinogénesis 2. Por lo tanto, la cuantificación precisa de 8-oxo-dGuo es un biomarcador útil y deseable de daño oxidativo del ADN 5. Hay una confusión generalizada en la literatura con respecto a los nombres correctos de las formas dañadas oxidativamente de 2-desoxiguanosina y, por otra parte, el nombre correcto del compuesto (s) mide rutinariamente como un biomarcador de daño oxidativo del ADN 6. Los 6,8-diceto-enol y 6, 8-ceto formas tautoméricas de 8-oxo-dGuo (mostrado en la Figura 1) son los dos tautómeros más prominentes discutidos en la literatura 5,7. La forma de 6,8-diceto es la forma más prominente a pH fisiológico de 7,4, y es el producto de oxidación de ADN más prominente 7. Por lo tanto, 8-oxo-dGuo, en lugar de 8-hidroxi-dGuo es el nombre más apropiado para este producto de oxidación 6. También es importante señalar que 2-desoxiguanosina (dGuo), en lugar de nucleobase guanina (Gua) o guanosina ribonucleósido (Guo), respectivamente, se detecta por la mayoría de los métodos de 6. Detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo exacta es difícil debido a: i) la variabilidad en la digestión de la muestra de ADN, ii) la oxidación adventicia de dGuo a 8-oxo-dGuo que puede ocurrir durante la preparación de la muestra, y iii) la necesidad para la validación efectiva del método HPLC-ED analítica 8. En este protocolo, que tuvo como objetivo a lograr i) proporcionando condiciones favorables para la digestión completa del ADN y ii) por la inclusión quelante de metal y soluciones quelantes tratados y un reactivo DNA-aislamiento especial, mientras iii) fue sólo parcialmente abordados por la inclusión de controles positivos y, por tanto proporcionando que el método es capaz de detectar 8-oxo-dGuo en muestras biológicas. Además de validación está más allá del alcance de este documento. Sin embargo, estamos seguros de que este protocolo ayudará a la prospectivalos usuarios a determinar el grado en que ellos necesitan para validar formalmente el protocolo, dependiendo de sus fines. Una lista de los pasos requeridos para la validación formal del método está provisto además. Durante el desarrollo e implementación de un método para la detección de 8-oxo-dGuo, métodos publicados fueron revisados ​​y consolidados. Por lo tanto, este método elimina la necesidad de reunir información de varias fuentes publicadas que a menudo carecen de importantes detalles experimentales mientras que también proporciona medios rápidos y directos de las pruebas si el método para la detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo ha sido adoptado con éxito. Este método adaptado fue empleado con éxito para analizar muestras de ADN de las células cultivadas y el tejido murino. Este artículo de vídeo ayudará a otros grupos en el establecimiento de un método eficaz para la detección fiable y cuantificación de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED.

<table><tbody><tr><td>8-oxo-dGuo estándar</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>89320</td><td>Referido inapropiadamente como "8-hidroxi-2'-desoxi guanosina"; ver <fuerte>Fig. 1</fuerte> y texto para más detalles.</td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5931</td><td>De E. coli</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>Quelatos de metales pesados</td></tr><tr><td>Mesilato de desferoxamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>dGuo estándar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7145</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato sódico dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>Sal de sodio</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>TipoII, de páncreas bovino</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Invitrogen</td><td>10503-27</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético sal disódica disódica dihidratada (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>El compuesto no se disolvería completamente hasta que el pH de la solución se ajustara a 8.0 (p. ej. con NaOH)</td></tr><tr><td>F12-K</td><td>medios ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Columna de protección</td><td>Especialidades cromatográficas</td><td>YBA 99S03 0204GC</td><td>Protege el colum de la contaminación; también puede provocar acumulación de presión</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato</td> <td>sódico monobásicoSigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>15190-250</td><td></td></tr><tr><td>Enzima fosfodiesterasa I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3243</td><td>Tipo II de veneno de Crotalus adamaneus</td></tr><tr><td>Homogeneizador de teflón</td><td>Thomas Scientific</td><td>7724T-1 o 7724T-5 para 1 o 5 mL, respectivamente</td><td>El volumen (capacidad de retención) depende de la cantidad de muestra a procesar.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Invitrogen</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>Columna YMC-BASIC con sílice esférica adherida</td><td>Especialidades cromatográficas</td><td>YBA 99S03 1546WT</td><td></td></tr></tbody></table>

hplc medición de la oxidación del adn de biomarcadores, 8-oxo-7,8-dihidro-2 &#39;desoxiguanosina, en células cultivadas y tejidos animales

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

El estrés oxidativo está asociado con muchos procesos fisiológicos y patológicos, así como el metabolismo de xenobióticos, que conduce a la oxidación de biomacromoléculas, incluyendo ADN. Por lo tanto, la detección eficiente de la oxidación del ADN es importante para una variedad de disciplinas de investigación, incluyendo la medicina y toxicología. Un biomarcador común de ADN oxidativamente dañado es 8-oxo-7,8-dihidro-2 &#39;desoxiguanosina (8-oxo-dGuo; a menudo denominado erróneamente como 8-hidroxi-2&#39; desoxiguanosina (8-OH-dGuo o 8 oxo-DG)). Se han descrito varios protocolos para la medición de 8-oxo-dGuo por cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica (HPLC-ED). Sin embargo, éstos se aplicaron principalmente a ADN purificado tratado con pro-oxidantes. Además, debido a las diferencias metodológicas entre los laboratorios, debido principalmente a las diferencias en equipo analítico, la adopción de métodos publicados para la detección de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED requiere la optimización cuidadosa de cada laboratorio. LAprotocolo integral, que describe un procedimiento de este tipo de optimización, es insuficiente. Aquí, un protocolo detallado se describe para la detección de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED, en el ADN de células cultivadas o tejidos animales. Se ilustra cómo la preparación de muestras de ADN se puede optimizar fácilmente y rápidamente para minimizar la oxidación indeseable de ADN que puede ocurrir durante la preparación de la muestra. Este protocolo muestra cómo detectar 8-oxo-dGuo en células cultivadas humanos adenocarcinoma alveolar (es decir, células A549) tratados con el agente oxidante KBrO 3, y del bazo de ratones expuestos a la dibenzo hidrocarburo aromático policíclico (def, p) criseno (DBC, antes conocido como dibenzo (a, l) pireno, DALP). En general, este trabajo ilustra cómo una metodología HPLC-ED se puede optimizar fácilmente para la detección de 8-oxo-dGuo en muestras biológicas.

dGuo fue observado para tener un tiempo de retención de 4,7 min mientras que 8-oxo-dGuo tenía un tiempo de retención de aproximadamente 6,4 min (Figura 2A y B). Hay una diferencia sobre 1.000 veces en las alturas de los picos entre los dos analitos, como se ve en la Figura 2C. Voltamogramas para 8-oxo-dGuo y dGuo se obtuvieron por las normas de funcionamiento a un potencial de trabajo en el intervalo de 0,2 a 1,1 V. El potencial de trabajo óptimo para 8-oxo-dGuo se dete...

El objetivo de este protocolo es la detección del marcador de la oxidación del ADN, 8-oxo-7,8-dihidro-2 &#39;desoxiguanosina (8-oxo-dGuo) por HPLC-ED, en el ADN de células cultivadas o tejidos animales.

HPLC Medición de la oxidación del ADN de biomarcadores, 8-oxo-7,8-dihidro-2 &#39;desoxiguanosina, en células cultivadas y tejidos animales

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar y cuantificar el producto de oxidación del ADN, ocho OXO DG, en muestras biológicas mediante cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica o H-P-L-C-E-D. Esto se logra mediante el aislamiento de una muestra de ADN a partir de muestras biológicas, seguido de la digestión completa del ADN de una manera que minimice la oxidación indeseable del ADN que puede ocurrir durante la preparación de la muestra, mediante la inclusión de un quelante metálico y un reactivo especial para el aislamiento de ADN. A continuación, se optimizan las condiciones de corrida de H-P-L-C-E-D y se construyen curvas estándar para ocho OXO DG y dos primed dioxazine.El paso final consiste en correr el ADN digestivo en serie con ocho OD DG y dos desoxiguaninas primas en el HPLC, con el fin de determinar las relaciones entre ocho OD DG y dos desoxiguaninas primas en las muestras de ADN digerido bajo estudio. En última instancia, la detección y cuantificación de ocho OD DG mediante H-P-L-C-E-D se utiliza para cuantificar el grado de oxidación del ADN en muestras biológicas. Sí, la principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existen

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

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Investigación

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Química

Radical basado en la química biomimética ha sido aplicada a bibliotecas de hasta edificio-necesarias para el desarrollo de biomarcadores.

Radicales Libres en Biología Química: del comportamiento químico al desarrollo de biomarcadores

Describimos aquí métodos para la cuantificación sensible y precisa de las lesiones 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-dado) y 1,n2- etheno-2'-desoxyguanosine (1,N2-DGUO) en el ADN. Los métodos se aplicaron a la evaluación de los efectos de las partículas finas ambientales (PM2,5) en los tejidos (pulmón, hígado y riñón) de ratones expuestos A/J.

Cuantificación de tres lesiones de ADN por espectrometría de masas y evaluación de sus niveles en los tejidos de los ratones expuestos a la materia particulada fina ambiental

Este protocolo describe un método eficiente para detectar cuantitativamente el daño oxidativo del ADN en células MCF-7 mediante la tecnología ELISA.

Cuantificación del nivel de 8-oxo-dG mediante el ensayo ELISA para evaluar el daño oxidativo del ADN en células MCF-7

Tiempo de cursos para la actividad glicosilasa de 8-oxoguanina ADN glicosilasa son bifásicos exhibiendo una explosión de la formación de producto y una fase de estado estacionario lineal. La utilización de técnicas de flujo de enfriamiento rápido, la ráfaga y las tasas de estado estable se pueden medir, que corresponden a la escisión de 8-oxoguanina y la liberación de la glicosilasa a partir del ADN del producto, respectivamente.

Medición cinética de estado estable, Pre-estado de equilibrio, y un solo volumen de negocios de ADN glicosilasa Actividad

origami de ADN es un poderoso método para fabricar objetos precisos a nanoescala mediante la programación del autoensamblaje de moléculas de ADN. Aquí describimos un protocolo para el plegamiento de un robot bio-sensible a partir de origami de ADN, su purificación y tinción negativa para la transmisión de imágenes microscópicas electrónicas (TEM).

Plegable y caracterización de un Robot Bio-sensible de ADN Origami

El protocolo descrito aquí representa un método fácil y reproducible que emplea cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) para medir el metabolismo de las purinas en células de leucemia linfocítica crónica (LLC) cultivadas en diferentes condiciones.

Ensayo basado en HPLC para supervisar extracelular de nucleótidos / nucleósidos de metabolismo en las células de la leucemia crónica humana linfocítica

Se presenta un protocolo para evitar la oxidación de sustratos metálicos durante la transferencia de muestras de una solución ácida inhibida a un espectrómetro de fotoelectrones de rayos X.

La determinación de la composición química del inhibidor de corrosión / Metal Interfaces con XPS: Reducción al mínimo del anuncio Inmersión Oxidación

Describimos el proceso de fabricación y pruebas de termómetros fotónicos.

Fabricación y pruebas de termómetros fotónicos

El presente método sirve para identificar inhibidores de la isoforma específica de histona deacetilasas (HDAC) en células HeLa por el análisis UHPLC-MS de múltiples sustratos. Este es un método libre de anticuerpos desarrollado para reflejar actividad HDAC1 y HDAC6 en la vida del ambiente celular, en contraste con solo isoform análisis sin células.

Medición simultánea de HDAC1 y HDAC6 actividad en HeLa células usando UHPLC-MS

Este protocolo describe la síntesis de partículas magnéticas y evaluación de sus propiedades de unión al ADN mediante dispersión de luz dinámica y electroforética. Este método se centra en monitorear los cambios en el tamaño de las partículas, su polidispersidad y potencial zeta de superficie de la partícula que juegan importante papel en el atascamiento de materiales como el ADN.

Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética

Aprende a medir el biomarcador 8-oxo-dGuo en células cultivadas y tejidos animales mediante HPLC con detección electroquímica. Este protocolo minimiza la oxidación del ADN durante la preparación de muestras.

HPLC Medición de la oxidación del ADN de biomarcadores, 8-oxo-7,8-dihidro-2 desoxiguanosina, en células cultivadas y tejidos animales (Video) | JoVE Journal

HPLC Medición de la oxidación del ADN de biomarcadores, 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina, en células cultivadas y tejidos animales

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