Name: Oxígeno-Glucosa Privación y Reoxigenación como In Vitro La isquemia-reperfusión modelo para el estudio de la disfunción barrera hematoencefálica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a usar el modelo de privación de oxígeno-glucosa y reoxigenación para estudiar la disfunción de la barrera hematoencefálica in vitro. Este método permite analizar cambios en la integridad de uniones estrechas y formación de fibras de estrés.

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Reconocemos Programa de Subvenciones del Hospital Blanca, Scott y de apoyo financiero y de Texas A &amp; M Health Science Center College de Medicina de Laboratorio Integrado de imagen para el uso del microscopio láser confocal. Reconocemos el Sr. Glen Cryer para obtener ayuda con la edición de manuscritos.

1. Siembra de las células endoteliales <ol><li> Obtener cultivos primarios de RBMEC de de ratas Sprague Dawley adultas (u obtener comercialmente). </li><li> Cultivar RBMECs en 100 cm fibronectina (50 mg / ml) placas de Petri recubiertas utilizando el medio de crecimiento de células endoteliales de cerebro de rata. Cambiar el medio cada dos días, hasta que se alcanza la confluencia. </li><li> Al llegar a 80-90% de confluencia, lavar suavemente las células en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por agitación. Las células se separaron entonces al exponerlos a 1 ml de solución caliente 0,25% tripsina ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), equilibrada a 37 ° C. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante 2-5 min hasta que las células se separan y se dispersan. NOTA: Toque en la placa de cultivo para separar las células. Ver las células bajo el microscopio para confirmar desprendimiento completo de células de la superficie del plato. </li><li> Añadir 5 ml de medios completa a la placa de Petri con el fin de neutralizar la tripsina.Pipetear el medio que contiene células desprendidas y recoger en un tubo de centrífuga de 15 ml. . </li><li> Centrifugar el medio que contiene las células endoteliales a 220 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y el sedimento que contiene preservar cells.Suspend el sedimento en 3-5 medio de crecimiento de células endoteliales de cerebro de rata fresco por ml de mezcla suavemente arriba y abajo con pipeta células serán entonces ser contado usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro. </li><li> Transferir la suspensión celular en la fibronectina (50 mg / ml) pre-revestido 8 sistema de diapositiva cámara de pocillo estéril, 0,7 cm 2 / pocillo con una densidad de siembra varía entre 10.000-15.000 células por pocillo. Cultivar las células a 37 ° C hasta que se logra la confluencia NOTA: Para la realización de transferencias Western u otros experimentos, las células se pueden cultivar en placas de 10 cm de cultivo de células o platos especiales como es requerido por el experimento. </li></ol> 2. El oxígeno y glucosa Privación-Reoxigenación In VitroModelo NOTA: El siguiente protocolo se ha adaptado de Zulueta et al. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9. <ol><li> Utilice el sistema de cultivo celular hipoxia para estudiar los efectos de de la OGD-R en RBMECs en (ver Figura 1). Configuración y calibrar el sistema de cultivo celular hipoxia antes de comenzar el experimento, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Retire los portaobjetos de cámara confluentes (paso 1.8) de la 37 ° C incubadora. Sustituir el medio completo en el portaobjetos de cámara con desoxigenada, no glucosa, Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) y se coloca en la cámara de hipoxia con 95%, N 2 y 5% de CO 2 durante 2 horas a 37 ° C, para representar condición OGD. </li><li> Mover las células de nuevo a la incubadora con 95% O 2, 5% de CO2 a 37 ° C y provisto de medio completo de células endoteliales de cerebro de rata fresco y se incuba durante otra 1 hora a 37 ° C. NOTA: Este paso representa una situación reoxigenación. </li><li> Utilice los portaobjetos de cámara para la localización de inmunofluorescencia y el etiquetado rodamina phalloidin (ver sección 3). </li></ol> 3. Inmunofluorescencia localización de ZO-1 y F-actina Etiquetado Usando Rodamina faloidina <ol><li> Exponer los portaobjetos de cámara que contienen monocapas RBMEC a 100 l de Opti-MEM / suero reducida medios de comunicación / pocillo durante 1 hr. Lavar los portaobjetos de cámara 3 veces en 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,0 a 7,2). </li><li> Fijar las células utilizando 100 l de paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,0-7,2) durante 15 min y se lavan los portaobjetos de cámara de 3 veces más en PBS (pH 7,0-7,2). </li><li> Permeabilizar las células usando 100 l de 0,5% de Triton X-100 en PBS, (pH 7,0-7,2) durante otros 15 min. Bloquear con 100 l de 2% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante una hora. Después de este paso, ya sea células mancha / etiqueta, ya sea para ZO-1 o f- actina. <ol><li> Para sta inmunofluorescenciacaniza incuban las células con un anticuerpo anti-conejo primaria contra ZO-1 en 1: 150, preparado en 2% BSA-PBS durante O / N a 4 ° C. Lavar las células 3 veces en PBS, (pH 7,0-7,2). Incubar con 100 l de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-etiquetados anti-conejo anticuerpo secundario durante 1 hr a RT. </li><li> Para el etiquetado rodamina faloidina, tras el bloqueo, exponer las células a 100 l de rodamina faloidina en dilución 1:50, preparado en 2% BSA-PBS, durante 20 min. </li><li> Lavar las células de la tinción de inmunofluorescencia y rodamina faloidina etiquetado en PBS, (pH 7,0-7,2). Montar las cámaras que utilizan medios de fijación que contienen reactivo anti-fade con DAPI. </li></ol></li><li> Visualizar las células usando una lente de inmersión en agua 60 X y las células se escanean en un solo plano óptico bajo un microscopio confocal. </li></ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycium+barbarum+polysaccharides+reduce+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injuries+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats.</a> Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).</li>
<li>Kaur, C., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+in+hypoxic-ischemic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions.</a> Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%2C+reperfusion+injury%2C+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke.</a> Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).</li>
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<li>Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+modulates+the+barrier+and+coagulant+function+of+cultured+bovineendothelium.+Increased+monolayer+permeability+and+induction+of+procoagulant+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties.</a> J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).</li>
<li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalin+reduces+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+during+hypoxia+in+vitro+by+increasing+the+expression+of+tight+junction+proteins+in+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells.</a> J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).</li>
<li>Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+mechanisms+generate+oxygen+free+radicals+in+neurons+and+contribute+to+cell+death+during+anoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation.</a> J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).</li>
<li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor%2C+generation+of+reactive+oxygen+species%2C+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li>
<li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li>
<li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li>
<li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

OGD-R como un modelo in vitro para la lesión por isquemia-reperfusión ha sido bien establecido para el estudio de las neuronas 10,11. También hay estudios que muestran el efecto de la OGD en las células endoteliales cerebrales y alteraciones en la permeabilidad y TJ integridad 9. Sin embargo, nuestro estudio muestra el efecto de OGD, así como la reoxigenación, que es una representación más cercana de la lesión por reperfusión isquémica en condiciones in vivo que se producen despué...

-Isquemia-reperfusión (IR) lesión se encuentra que es la causa frecuente de diversas complicaciones debilitantes y muertes asociadas con el accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, trauma, enfermedad vascular periférica y lesión cerebral traumática 1,2. IR lesión en los vasos cerebrales es una lesión secundaria temprana conduce a la inflamación y el edema 3. Una de las complicaciones graves que se produce como resultado de estrés oxidativo y metabólica después de la inflamación es la pérdida de equilibrio homeostático conduce a la formación de radicales libres, alteraciones en la barrera hematoencefálica (BBB) ​​uniones estrechas (TJs) y la permeabilidad microvascular 4,5. Actualmente, en modelos in vivo utilizados para estudiar los efectos de la lesión por IR en la BBB incluir oclusión de la arteria cerebral media (MCAO), microembolismo, y transgénicos o knockout animales. Sin embargo, cada uno tiene sus inconvenientes y limitaciones como se comenta por Hossmann 6. Modelo MCAO se utiliza para estudiar la effects de estrés redox, cambios en las comunicaciones de unión de la acreditación y las interacciones entre el cerebro y las células inmunes. Sin embargo, presentan varios desafíos técnicos, como la necesidad de procedimientos de microcirugía precisas y las dificultades en el mismo. Microembolismo instantáneamente rompe la acreditación mientras que el uso de transgénicos o knockout animales para estudiar la isquemia cerebral puede tener retos como influencias de genes dependientes moleculares sobre la formación del infarto, los cambios en la anatomía vascular y diferentes pesos corporales 6. Por lo tanto, los modelos in vitro de isquemia han encontrado un interés creciente en los últimos tiempos debido principalmente a su aplicabilidad en la realización de estudios mecanísticos de drogas. Sin embargo, los resultados de los estudios in vitro no pueden representar plenamente un estudio in vivo y deben ser interpretados con cautela 6. Efecto contraproducente de bajas concentraciones de oxígeno en monocapas de células endoteliales y la permeabilidad microvascular haber sidoestudiado por Ogawa 7. Células endoteliales microvasculares de cerebro de rata (RBMECs) se utilizaron para desarrollar in vitro BBB. La técnica de la privación y la reoxigenación con oxígeno glucosa (OGD-R) se presenta en este protocolo ha sido adaptado de estudios de Zulueta y otros y Zhu et al 8,9. Se expuso células endoteliales cerebrales a OGD-R colocándolos en una cámara de hipoxia / anoxia que contiene 0% de O 2, 5% de CO 2 y 95% N 2. Las células fueron posteriormente evaluados por alteraciones en la formación de fibras integridad y el estrés TJ utilizando la localización de inmunofluorescencia y el etiquetado rodamina phalloidin respectivamente. La tinción de inmunofluorescencia para occludens-1 zonula (ZO-1) se realiza para determinar la integridad de TJ, como ZO-1 es una membrana andamios importante obligado proteínas TJ. Etiquetado rodamina faloidina determina la actina filamentosa (F-actina) en el citoesqueleto celular y es una clara indicación de la formación de fibras de estrés de actina en las células endoteliales. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; El objetivo de este método es para proporcionar una visión en el desarrollo de OGD-R como un modelo in vitro para el estudio de IR BBB células endoteliales integridad TJ y la formación de fibras de estrés de actina-f. Los resultados proporcionarán información sobre la suerte de proteínas TJ, ZO-1 y la formación de fibras de estrés después de la OGD-R. La comprensión de estas relaciones será una oportunidad para determinar los mecanismos moleculares subyacentes que se activan siguiendo OGD-R y desarrollar posibles estrategias terapéuticas para mejorar la interrupción acreditación después del tratamiento OGD-R.

<table><tbody><tr><td>Proox modelo 110</td><td>Biospherix</td><td>modelo 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, sin glucosa</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Anticuerpo policlonal de conejo</td><td>Life technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&nbsp; bien estéril, de vidrio&nbsp; diapositivas&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo secundario anti-conejo marcado con FITC&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Se puede utilizar cualquier otro PBS disponible</td></tr></tbody></table>

oxígeno-glucosa privación y reoxigenación como<em&gt; in vitro</em&gt; la isquemia-reperfusión modelo para el estudio de la disfunción barrera hematoencefálica

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

La isquemia-reperfusión (IR) lesión se sabe que contribuyen significativamente a la morbilidad y la mortalidad asociadas con accidentes cerebrovasculares isquémicos. Accidentes cerebrovasculares isquémicos representan el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares. Una causa común de lesión IR es el rápido flujo de entrada de fluidos después de una oclusión crónica / aguda de sangre, nutrientes, oxígeno al tejido desencadenar la formación de radicales libres. El ictus isquémico es seguido por la barrera hematoencefálica (BBB) ​​y la disfunción edema cerebral vasogénico. Estructuralmente, las uniones estrechas (TJS) entre las células endoteliales juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB). IR lesión es una lesión secundaria temprana que conduce a una respuesta no específica, inflamatoria. Oxidativo y estrés metabólico después de la inflamación desencadena el daño cerebral secundario que incluye la acreditación de la permeabilidad y la interrupción de uniones estrechas (TJ) integridad. Nuestro protocolo presenta in vitro &lt;/ Em&gt; ejemplo de la privación de oxígeno y glucosa reoxigenación (OGD-R) en las células endoteliales de cerebro de rata integridad TJ y la formación de fibras de estrés. Actualmente, varios experimental en modelos in vivo se utilizan para estudiar los efectos de la lesión IR; sin embargo, tienen varias limitaciones, como los desafíos técnicos en la realización de cirugías, gen influencias moleculares dependientes y dificultad en el estudio de las relaciones mecanicistas. Sin embargo, los modelos in vitro puede ayudar a superar muchas de esas limitaciones. El protocolo presentado puede ser usado para estudiar los diversos mecanismos moleculares y relaciones mecanicistas para proporcionar estrategias terapéuticas potenciales. Sin embargo, los resultados de los estudios in vitro pueden diferir de serie en estudios in vivo y deben ser interpretados con cautela.

Las células cultivadas en portaobjetos prerrevestidas fibronectina cámara Nunc II fueron sometidos a OGD-R mediante la colocación en un modelo de cámara de 110 Biospherix ProOx. Después de someter las células a OGD-R, que se procesaron para ZO-1 tinción de unión utilizando la técnica de inmunofluorescencia como se muestra en la Figura 2 y el conjunto de citoesqueleto que indica la formación de fibras de estrés de actina F usando etiqueta mancha faloidina rodamina como se muestra en la Figura 3.<...

La lesión por isquemia-reperfusión (IR) se asocia con una alta tasa de morbilidad y mortalidad. El objetivo del modelo in vitro de privación y reoxigenación de oxígeno-glucosa (OGD-R) descrito aquí es evaluar los efectos de la lesión por isquemia-reperfusión en una variedad de células, particularmente en las células endoteliales de la barrera hematoencefálica (BBB).

Oxígeno-Glucosa Privación y Reoxigenación como<em&gt; In Vitro</em&gt; La isquemia-reperfusión modelo para el estudio de la disfunción barrera hematoencefálica

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el papel de la privación de oxígeno y glucosa como un modelo in vitro de lesión por isquemia-reperfusión para estudiar la disfunción de la barrera hematoencefálica. Esto se logra exponiendo células endoteliales cerebrales cultivadas en cámaras portaobjeto a una privación de oxígeno y glucosa, reemplazando el medio por un medio desoxigenado sin glucosa y colocándolas en una cámara de hipoxia durante dos horas; luego, las células se devuelven a condiciones normales durante una hora para lograr la reoxigenación. Tras el procesamiento, se realiza tinción inmunofluorescente para ZO-1, ocludina y marcado con Rodamina Fálica para identificar la actina filamentosa.Las células se imaginan entonces utilizando un objetivo de inmersión en agua de 60 x en un microscopio confocal para obtener cortes ópticos individuales para su análisis. Quien demostrará el procedimiento será Hem Nega, un estudiante de posgrado en mi laboratorio. Para comenzar el procedimiento, tenga a mano cultivos primarios de RBM eecs obtenidos de ratas adultas Spra Dolly. También son aceptables líneas disponibles comercialmente.Cultive las R BM EECS en placas de 100 centímetros recubiertas con fibronectina; cultívelas en medio de crecimiento para células endoteliales cerebrales de rata y cambie el medio cada dos días. Incube las células hasta que alcancen una confluencia del 80 al 90 %. Luego, lave suavemente las células con cinco mililitros de PBS.A continuación, separe las células de la placa añadiendo primero un mililitro de solución tibia de tripsina-EDTA al 0,25 % y agitando suavemente la placa. Incube entonces las células durante dos a cinco minutos. Golpee suavemente el lateral del recipiente para facilitar la disociación celular y observe las células al microscopio para confirmar su desprendimiento.Para finalizar la tripsinización, agregue cinco mililitros de medio completo, luego aspire el medio con las células desprendidas y recójalos en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue el medio con las células a 220 G durante cinco minutos, aspire y deseche el sobrenadante. A continuación, re suspenda el botón celular en tres a cinco mililitros de medio fresco haciendo fluir suavemente las células a través de una pipeta de cinco mililitros.Ahora cuente las células y transfiera de 20 a 30.000 a cada pocillo de un portaobjetos con cámara de ocho pocillos recubierto con fibrina y actina. Por supuesto, también podrían cultivarse de forma diferente para otras aplicaciones. A continuación, incube el portaobjetos con cámara hasta que las células alcancen confluencia como preparación.Configure y calibre el sistema de cultivo celular en hipoxia. Según las instrucciones del fabricante, el ambiente de la cámara debe ser 95% nitrógeno, 5% dióxido de carbono y 37 grados Celsius. Ahora desoxigene el DMEM libre de glucosa colocándolo en la cámara de hipoxia durante cuatro a seis horas.Comience a someter las células a estrés reemplazando su medio con DMEM libre de glucosa y desoxigenado, y luego coloque las células en la cámara de hipoxia durante dos horas. Después de dos horas, devuelva las células al medio completo para células endoteliales cerebrales de rata. A continuación, reoxigene las células devolviéndolas a condiciones normales durante una hora.Comience exponiendo cada pocillo de monocapas de R-B-M-E-C a 100-200 microlitros de medio óptimo con suero reducido y continúe la incubación durante una hora. Luego, lave las cámaras tres veces utilizando entre 100 y 200 microlitros de PBS por pocillo en cada lavado. Fije las células con paraformaldehído al 4 % en PBS e incube las láminas durante 15 minutos a temperatura ambiente, y lave las células tres veces con PBS como antes.Ahora, permeabilice las células aplicando de 100 a 200 microlitros de Triton X-100 al 0,5% en PBS a cada pocillo y deje que la placa incube otros 15 minutos a temperatura ambiente. Después de que las células hayan sido permeabilizadas, aplique la solución bloqueadora y deje que actúe sobre las células durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, realice inmunofluorescencia para la proteína ZO-1 o marque el F-actina.Para realizar la inmunofluorescencia de las células para ZO uno, incubarlas con el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, lavar las células tres veces en PBS, como al eliminar el fijador. A continuación, incubar las células en 100 a 200 microlitros de anticuerpo secundario anti conejo marcado con fitzina durante una hora a temperatura ambiente para etiquetar las células con r Domine Phin.Después de aplicar la solución bloqueadora durante una hora, exponga las células a 100-200 microlitros de R domine Phin en una dilución de 1:50 con 2 % B-S-A-P-B-S durante 20 minutos. Después de la incubación con el anticuerpo secundario o con R domine Phin, lave las células con PB S tres veces nuevamente como antes. A continuación, retire las cámaras despegando el material elástico.Proceda con el montaje de las laminillas utilizando medio que contenga agente antidesvanecimiento e imagen DPI. Las células con microscopía confocal en un solo plano con un objetivo de 60 x. Células cultivadas en cámara recubierta con fibronectina.Las láminas se sometieron a RODG al colocarlas en una cámara de hipoxia, como se describió. Luego, las células se procesaron para la unión de ZO-1.Las células de control teñidas mostraron una integridad de uniones continua, mientras que las células privadas de oxígeno y glucosa presentaron uniones discontinuas. Además, se observaron cambios en el citoesqueleto mediante el uso de aero domine foid con marcaje para mostrar el estrés de actina F. Las células de control mostraron ausencia o formación mínima de fibras de estrés de actina F, mientras que las células sometidas a RDGO mostraron un aumento en la formación de fibras de estrés.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la privación de oxígeno y glucosa y la reoxigenación. Este procedimiento puede utilizarse como un modelo de lesión por isquemia y reperfusión para estudiar la barrera hematoencefálica, la integridad de las uniones estrechas y el estrés. Formación de fibras.

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Fuente: Alluri, H., et.al. Privación y reoxigenación de oxígeno-glucosa como modelo de lesión in vitro por isquemia-reperfusión para el estudio de la disfunción de la barrera hematoencefálica. J. Vis. Exp. (2015).El video demuestra el impacto de la privación de oxígeno-glucosa y la posterior reoxigenación en las células endoteliales microvasculares del cerebro de rata (RBMEC) mediante la simulación de condiciones hipóxicas y de privación de nutrientes. Estas condiciones dan lugar a la depleción...

Impacto de la privación y reoxigenación de oxígeno-glucosa en las interacciones célula-célula

Oclusión de la carótida bilateral junto con hipotensión sistémica produce isquemia cerebral global en la rata, lo que resulta en daños en el hipocampo con la gravedad reproducibles. Temas de animales se deterioran con patrones predecibles de daño cerebral, que se recuperan convenientemente, y las tasas de mortalidad son relativamente bajos.

2 vasos Oclusión / Hipotensión: un modelo de rata de isquemia cerebral global

In vitro se están desarrollando modelos de lesiones cerebrales traumáticas para reproducir una deformación del cerebro vivo. Lesiones inducidas por el estiramiento se ha empleado para astrocitos, neuronas, células gliales, la aorta, y células endoteliales cerebrales. Sin embargo, nuestro sistema utiliza una barrera hematoencefálica (BBB) ​​modelo que posee propiedades que constituyen un modelo legítimo de la acreditación para establecer un modelo in vitro de lesión cerebral traumática.

Estirar en Brain células endoteliales microvasculares (CEND) como<em&gt; In Vitro</em&gt; Lesión cerebral traumática Modelo de la barrera hematoencefálica

Se presenta un protocolo para cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales, que permite reproducir muchos aspectos de la lesión cerebral isquémica. Al estudiar los cambios en la neurovasculatura además de los cambios en las neuronas, este protocolo es una herramienta versátil para estudiar los cambios plásticos en el tejido neural después de una lesión.

El análisis de la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales

Este protocolo describe el precondicionamiento hipóxico repetitivo, o exposiciones breves a la hipoxia sistémica que reducen los volúmenes de infarto y la interrupción de la barrera hematoencefálica después de una oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. También detalla la cuantificación dual del volumen del infarto y la alteración de la barrera hematoencefálica después de un accidente cerebrovascular para evaluar la eficacia de la protección neurovascular.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

Accidente cerebrovascular isquémico es un evento complejo en el que la contribución específica de los astrocitos de la región del cerebro afectada expuesta a privación de glucosa oxígeno (OGD) es difícil de estudiar. Este artículo presenta una metodología para obtener aislados astrocitos y estudiar su reactividad y la proliferación en condiciones OGD.

Control de reactividad astrositos y proliferación in Vitro bajo condiciones isquémicas

El objetivo del protocolo es presentar un procedimiento optimizado para el establecimiento de un modelo de barrera blood - brain (BBB) en vitro basado en las células endoteliales de cerebro porcino primario (pBECs). El modelo muestra alta reproducibilidad, alta tensión y es adecuado para estudios de transporte y tráfico intracelular en el descubrimiento de medicamentos.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una técnica muy reproducible para evaluación en vivo de la interrupción de la barrera blood - brain en modelos de rata de accidente cerebrovascular isquémico.

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

Aquí, presentamos un enfoque simple utilizando medios de cultivo específicos que permiten el establecimiento de culturas enriquecidas con neuronas y astrocitos, o cultivos de neurona-glia de la corteza embrionaria, con alto rendimiento y reproducibilidad.

Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

Aquí, describimos el método para establecer un modelo de cultivo celular triple de la barrera hematoencefálica basado en células endoteliales microvasculares primarias del cerebro humano, astrocitos y pericitos. Este modelo multicelular es adecuado para estudios de disfunción de unidades neurovasculares durante el ictus isquémico in vitro o para el cribado de candidatos a fármacos.

Un modelo triple de cultivo celular primario de la barrera hematoencefálica humana para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico in vitro

La barrera hematoencefálica (BHE) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de un entorno cerebral estable y saludable. La disfunción de la barrera hematoencefálica se asocia con muchas enfermedades neurológicas. Hemos desarrollado un modelo 3D derivado de células madre de la BHE para investigar la patología cerebrovascular, la integridad de la BHE y cómo la BHE se ve alterada por la genética y la enfermedad.

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

Aprende a usar el modelo de privación de oxígeno-glucosa y reoxigenación para estudiar la disfunción de la barrera hematoencefálica in vitro. Este método permite analizar cambios en la integridad de uniones estrechas y formación de fibras de estrés.

Oxígeno-Glucosa Privación y Reoxigenación como In Vitro La isquemia-reperfusión modelo para el estudio de la disfunción barrera hematoencefálica (Video) | JoVE Journal

Oxígeno-Glucosa Privación y Reoxigenación como

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