En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar la dinámica microglial en un modelo murino de glaucoma crónico mediante imágenes confocales in vivo de la retina. Esto se logra mediante oftalmoscopia confocal mensual no invasiva o CSLO para ver la microglía fluorescente en la retina y la cabeza del nervio óptico. El análisis de imágenes en vivo mediante la segmentación y morfo de SOMA celular basada en umbrales cuantifica los cambios en el número y la activación de células microgliales.

Los resultados muestran que las imágenes mensuales de CSLO en ratones vivos se pueden utilizar para monitorear la cinética de la distribución de la densidad celular microglial y la activación morfológica durante la progresión temprana de la neurodegeneración crónica. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la imagen confocal de dos fotones del cerebro de ratón de microglía GFP positiva, es que la imagen CSLO de la retina permite la observación directa y el seguimiento de las células microgliales a lo largo de la progresión de los trastornos neurodegenerativos del envejecimiento en el organismo intacto. Tuve la idea de este método por primera vez después de que demostramos exvivo, que la microglía mostraba una intensa activación y agrupamiento en la preparación central de jóvenes DBA a través de ratones J en edades que precedieron a la neurodegeneración detectable.

Con el fin de averiguar si estos cambios inmunitarios innatos tempranos que precedieron al glaucoma detectable causaban su neurodegeneración, necesitábamos establecer un enfoque in vivo para rastrear los cambios microgliales. Haciendo una demostración del procedimiento para la adquisición de imágenes en vivo estará César Romero, un técnico de mi laboratorio Para comenzar las operaciones, inicie el sistema CSLO e ingrese la información de la sesión. A continuación, prepárese para la obtención de imágenes de forma segura.

Coloque una lente de objetivo de campo amplio limpia de 55 grados. Coloque un ratón sobre la plataforma de imágenes dos minutos después de administrar el anestésico y dilate ambas pupilas con mis gotas táticas. Cinco minutos después, confirme que el ratón está anestesiado.

A continuación, con una presión mínima, cubra cada ojo con lentes de contacto. Oriente el ratón de modo que el ojo derecho se encuentre con la lente del objetivo y la órbita sea paralela a la lente. El animal no necesita ser sujetado, sino mantenido a una distancia constante de la lente del objetivo.

Con el ojo alineado con él durante los próximos 10 a 15 minutos, el mouse no se moverá ni parpadeará mientras el sistema de imágenes en vivo CSLO rastrea sus movimientos oculares. Comience la sesión de imágenes recogiendo una vista del fondo de ojo de la retina interna. Para ello.

Seleccione el modo infrarrojo, que corresponde a una longitud de onda de excitación de 820 nanómetros. A continuación, ajuste la potencia del láser al 100% y la sensibilidad a entre el 40 y el 60%A continuación, trabajando a alta velocidad, localice el ojo utilizando el joystick para orientar el oftalmoscopio y prepárese para recoger una vista del fondo de ojo del disco óptico y la vasculatura de la retina. Inspeccione la córnea y el cristalino en busca de lesiones u opacidad.

Excluir del estudio los ojos con defectos o lesiones que puedan afectar a la adquisición de la imagen. Ahora, acercando el objetivo al ojo, localiza el área del disco óptico, que es la superficie de la cabeza del nervio óptico o ONH. A continuación, centra la imagen en el ONH.

La colocación correcta de la ONH es clave para obtener un enfoque y una misión uniformes en toda la imagen. El siguiente paso es visualizar los planos internos de la retina, así como la ONH. Para un plano focal de referencia, utilice los vasos sanguíneos principales ubicados en la superficie vítrea de la retina, que corresponde a 59 y 60 dioptrías, o incluso más profundo a 55 dioptrías en áreas de disco óptico excavadas.

A continuación, ajuste la saturación de la imagen con la perilla del panel táctil hasta que un halo blanco de iluminación abarque la mayor parte del fondo de ojo alrededor del disco óptico. A continuación, seleccione la saturación más baja que represente un halo uniforme indicativo de un contraste óptimo para ese ojo. Puede ser necesario realinear la cámara si persisten las áreas oscuras.

Ahora, recopile una imagen de fondo de ojo de alta resolución de la retina central con un promedio de 30 fotogramas tomados en tiempo real para mejorar la relación señal-ruido. Esto corresponde a 4,7 fotogramas por segundo, normalizados inmediatamente y en la misma posición preparada para recoger una imagen de fluorescencia de las células GFP positivas. Cambie al modo de imagen de fluorescencia en el panel de pantalla táctil, que selecciona el láser azul con excitación láser de 488 nanómetros y un conjunto de filtros de barrera de 460 a 490 nanómetros y establece la adquisición en 100% de potencia láser y 100 a 125% de sensibilidad.

Ahora recopile una sola imagen de fluorescencia bidimensional de punto XY de la ONH con un promedio de 100 escaneos. A continuación, capture una imagen multipunto de la retina alrededor del compuesto seleccionado ONH en el panel de control y, a continuación, realice un paneo con el oftalmoscopio a través del eje temporal nasal. El software promedia automáticamente las áreas recién escaneadas y las cose en tiempo real.

Si la calidad de la imagen de las áreas de la retina es insuficiente para permitir el promedio, el círculo verde que identifica un área que se está escaneando se volverá rojo. La imagen compuesta resultante cubre un área de hasta 1,7 por cuatro milímetros. Se debe tener cuidado durante la adquisición de la imagen compuesta.

Las imágenes a alta resolución se pueden perder si se mueve el objetivo demasiado rápido antes de completar el promedio de escaneo y la unión de imágenes. Cuando el efecto de la anestesia comienza a desaparecer, la sesión de imágenes debe terminar porque el ratón comienza a respirar pesadamente y las imágenes se vuelven impracticables. Comience por alinear secuencialmente las imágenes del fondo de ojo para una serie temporal utilizando la vasculatura y el disco óptico como puntos de referencia.

Con el uso de un software de edición de imágenes convencional, alinee todas las imágenes hasta que sus O hs se superpongan. La imagen superior será semitransparente mientras se arrastra. A continuación, gire cada imagen en la secuencia hasta que sus vasos sanguíneos principales se superpongan con la vasculatura de la imagen anterior y guarde la disposición para futuras referencias.

Registre el ángulo corregido para cada imagen y aplíquelo a la imagen de fluorescencia de punto XY única correspondiente. Ahora es posible identificar células microgliales individuales GFP positivas localizadas en la retina central abriendo los archivos TIFF alineados en Fluor render. Para visualizar todas las celdas, llene la pantalla con la imagen y defina la vista de renderizado compuesta ortogonal e interpolada.

A continuación, defina las propiedades: 0,58 gamma, 255 punto de saturación, 255 luminancia, 195 alfa a 1,00 de sombreado. Finalice las selecciones eligiendo los dos canales RG como visibles. Oculte el canal B haciendo doble clic en él en el marco del espacio de trabajo para segmentar celdas individuales.

Seleccione y establezca el umbral del canal rojo aumentando el umbral inferior hasta que la mayoría de las celdas se enmascaren con una superposición mínima y excluyendo los procesos de celda mientras se mantiene constante el umbral alto. Finalmente, guarde el archivo con celdas enmascaradas usando el comando de captura. Abra la imagen con celdas enmascaradas en el editor de gráficos rasterizados allí.

Invierta la escala de grises para la observación directa y ajuste la resolución a 300 DPI o más. La imagen RGB se guarda como un archivo TIF. El siguiente paso del análisis de imágenes en vivo es de la microglía, es decir, la segmentación y la morfo para identificar SATA para la cuantificación del área.

Utilice software capaz de realizar mediciones de intensidad y recuento de objetos en función del umbral. Abra el archivo TIFF con celdas segmentadas y seleccione el reescalado de spline para obtener la máxima resolución y el canal rojo en blanco y negro para una mejor visualización. A continuación, calibre la imagen definiendo su diámetro horizontal de 1,4 a 1,7 milímetros dependiendo de la edad para segmentar las células individuales.

Así que MA, aplique el umbral de intensidad en el canal rojo. Abra la función de intensidad de umbral en el comando de recuento de objetos y actualización de cuenta. Utilice esta función para realizar un seguimiento de los parámetros bidimensionales para cada umbral de región de interés que representa a un individuo.

A continuación, defina el umbral de intensidad en el histograma de intensidad. Seleccione el 50 a 60% más bajo de los 255 niveles y refine el valor umbral final de las celdas individuales. Evalúe visualmente la superposición entre la máscara de color del umbral en azul y el perímetro del soma de la celda en gris mediante los controles de la barra de herramientas binaria o el catálogo de objetos.

Identifique manualmente las regiones somales de interés con varias celdas. Separe estos elementos separando las regiones de interés. Mientras hace esto, use el conmutador para visualizar directamente las celdas ahora mediante la restricción de área.

Clasificar las células microgliales como activadas. Si sus áreas de somata son mayores de 50 a 60 micras cuadradas. Clasificar la microglía como desactivada si tienen somata más pequeño.

Finalmente, verifique el proceso y verifique la complejidad de la ramificación en cada célula microglial activada mediante la superposición de la máscara somal y la imagen de punto XY único con el contraste aumentado en un 50%El protocolo descrito se utilizó para visualizar células microgliales en una gran área de la retina central. En ratones jóvenes DBA dos J heterocigotos que expresan CX, tres C y un GFP, la alta resolución celular combinada con imágenes en vivo, umbrales y análisis morfométricos permitió la segmentación automática de células individuales GFP positivas, por lo que las células se discriminan en función del área DBA, dos ratones J modelan glaucoma crónico y se les tomaron imágenes mensualmente para monitorear el desarrollo de microgliosis local y la activación de la microglía a edades que preceden a una neurodegeneración detectable consistente con la variable Progresión de la neurodegeneración en ojos individuales. Este análisis reveló cambios en la activación de la microglía de la retina y la microgliosis con el tiempo.

El análisis también detectó cambios dinámicos en la densidad de la microglía total y activada dentro de las retinas individuales. La densidad poblacional de la microglía no se acopló a cambios en la densidad celular que expresa GFP consistentes con otros hallazgos. Por lo tanto, el análisis CSLO podría utilizarse como un indicador de la progresión temprana de la enfermedad.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe optimizar cuidadosamente los niveles de saturación de la imagen fluorescente de GFP más microglía, la retina interna localizada, la reproducibilidad de las imágenes CSLO de la retina central, así como el detalle celular consistente detectado en la retina central depende críticamente de este paso después de su desarrollo. Este protocolo de imagen en vivo se está aplicando en nuestro laboratorio, lo que realmente seda el vínculo potencial entre los cambios tempranos en la retina y la microglía de la cabeza de la neura óptica, y la progresión posterior del glaucoma en DBA a JM y en otros modelos de degeneración crónica de la retina. Esta estrategia de imagen en vivo también puede permitir la detección temprana de otras patologías crónicas que también se dirigen a la retina y al nervio óptico para la degeneración, como la esclerosis múltiple, el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.