En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar la dinámica de las microglías en un modelo murino de glaucoma crónico mediante imágenes confocales in vivo de la retina. Esto se logra mediante oftalmoscopia confocal mensual no invasiva o CSLO para observar las microglías fluorescentes en la retina y en la cabeza del nervio óptico. El análisis de imágenes en tiempo real mediante segmentación umbral del SOMA celular y morfocuantificación determina los cambios en el número de células microgliales y su activación.

Los resultados muestran que la imagenología mensual mediante CSLO en ratones vivos puede utilizarse para monitorear la cinética de la distribución de la densidad celular de microglía y la activación morfológica durante la progresión temprana de la neurodegeneración crónica. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la imagenología confocal de dos fotones del cerebro de ratones con microglía positiva para GFP, es que la imagenología CSLO de la retina permite la observación y monitorización directas de las células microgliales a lo largo de la progresión de trastornos neurodegenerativos asociados al envejecimiento en un organismo intacto. Tuve por primera vez la idea de este método tras demostrar *ex vivo* que la microglía mostraba una activación intensa y agrupamiento en la región central de ratones DBA/2J jóvenes en edades previas a la neurodegeneración detectable.

Con el fin de determinar si estos cambios inmunitarios innatos tempranos que precedieron al glaucoma detectable causaron su neurodegeneración, necesitábamos establecer un enfoque in vivo para rastrear los cambios en las microglías. El procedimiento para la adquisición de imágenes en vivo será demostrado por Caesar Romero, un técnico de mi laboratorio. Para comenzar las operaciones, encienda el sistema CSLO e ingrese la información de la sesión. A continuación, prepárese de forma segura para la obtención de imágenes.

Coloque una lente objetiva limpia de campo amplio de 55 grados. Coloque un ratón sobre la plataforma de imagen dos minutos después de administrar el anestésico y dilate ambas pupilas utilizando gotas midriáticas. Cinco minutos después, confirme que el ratón está anestesiado.

A continuación, usando presión mínima, cubra cada ojo con lentes de contacto. Oriente al ratón de manera que el ojo derecho coincida con la lente objetivo y la órbita esté paralela a la lente. No es necesario restringir al animal, pero debe mantenerse a una distancia constante de la lente objetivo.

Mientras el ojo está alineado durante los siguientes 10 a 15 minutos, el ratón no se moverá ni parpadeará mientras sus movimientos oculares son rastreados por el sistema de imagenología en vivo CSLO. Inicie la sesión de imagenología obteniendo una vista de fondo del interior de la retina. Para esto.

Seleccione el modo infrarrojo, que corresponde a una longitud de onda de excitación de 820 nanómetros. Luego, ajuste la potencia del láser al 100 % y la sensibilidad entre el 40 y el 60 %. A continuación, trabajando a alta velocidad, localice el ojo utilizando el joystick para orientar el oftalmoscopio y prepárese para obtener una imagen del fondo del ojo del disco óptico y de la vasculatura retiniana. Inspeccione la córnea y el cristalino en busca de lesiones u opacidades.

Excluya del estudio ojos con defectos o lesiones que puedan afectar la adquisición de imágenes. A continuación, acercando el objetivo al ojo, localice el área del disco óptico, que es la superficie de la cabeza del nervio óptico o ONH. Luego centre la imagen en la ONH.

Colocar correctamente el ONH es fundamental para obtener un enfoque uniforme y una emisión constante a lo largo de la imagen. El siguiente paso consiste en visualizar los planos internos de la retina, así como el ONH. Como plano focal de referencia, utilice los vasos sanguíneos principales ubicados en la superficie vítrea de la retina, lo que corresponde a 59 y 60 dioptrías, o incluso más profundo a 55 dioptrías en áreas del disco óptico excavadas.

A continuación, ajuste la saturación de la imagen utilizando el botón en el panel táctil hasta que un halo blanco de iluminación abarque la mayor parte del fondo de ojo alrededor del disco óptico. Luego, seleccione la saturación más baja que produzca un halo uniforme, indicativo de un contraste óptimo para ese ojo. Puede ser necesario volver a alinear la cámara si persisten áreas oscuras.

Ahora, obtenga una imagen de alta resolución del fondo del ojo de la retina central promediando 30 cuadros tomados en tiempo real para mejorar la relación señal-ruido. Esto corresponde a 4,7 cuadros por segundo, normalizados inmediatamente y en la misma posición preparada para obtener una imagen de fluorescencia de las células positivas para GFP. Cambie al modo de imagen de fluorescencia en el panel táctil, que selecciona el láser azul con excitación láser de 488 nanómetros y un conjunto de filtro de barrera de 460 a 490 nanómetros, y configure la adquisición a una potencia láser del 100 % y una sensibilidad del 100 al 125 %.

Ahora, recolecte una única imagen de fluorescencia bidimensional en un punto XY del nervio óptico, promediando 100 x escaneos. A continuación, capture una imagen multipunto de la retina alrededor del nervio óptico: seleccione compuesto en el panel de control y luego desplace el oftalmoscopio a lo largo del eje nasal temporal. El software promedia automáticamente las áreas recién escaneadas y las une en tiempo real.

Si la calidad de la imagen de áreas de la retina es insuficiente para permitir el promediado, el círculo verde que identifica un área que se está escaneando se volverá rojo. La imagen compuesta resultante cubre un área de hasta 1,7 por cuatro milímetros. Se debe tener cuidado durante la adquisición de la imagen compuesta.

Las imágenes de alta resolución pueden perderse si se mueve el objetivo demasiado rápido antes de completar el promediado de escaneo y la unión de imágenes. Cuando la anestesia comienza a desvanecerse, la sesión de imagen debe finalizar porque el ratón empieza a respirar con dificultad y la obtención de imágenes se vuelve inviable. Comience alineando secuencialmente las imágenes del fondo para una serie temporal, utilizando la vasculatura y el disco óptico como puntos de referencia.

Utilice un software convencional de edición de imágenes para alinear todas las imágenes hasta que sus O hs coincidan. La imagen superior será semitransparente mientras se arrastra. Luego, gire cada imagen de la secuencia hasta que sus vasos sanguíneos principales coincidan con la vasculatura de la imagen anterior y guarde la disposición para referencia futura.

Registre el ángulo corregido para cada imagen y aplíquelo a la imagen de fluorescencia correspondiente del punto XY individual. Ahora es posible identificar células individuales de microglía positivas para GFP localizadas en la retina central abriendo los archivos TIFF alineados en Fluor render. Para visualizar todas las células, llene la pantalla con la imagen y defina la vista de renderizado como compuesta ortogonal e interpolada.

Luego defina las propiedades: punto de saturación gamma 0,58, 255, luminancia 195, alfa en 1,00 de sombreado. Finalice las selecciones eligiendo ambos canales RG como visibles. Oculte el canal B haciendo doble clic sobre él en el marco del área de trabajo para segmentar células individuales.

Seleccione y umbralice el canal rojo aumentando el umbral inferior hasta que la mayoría de las células estén enmascaradas con una superposición mínima y excluyendo los procesos celulares, mientras mantiene constante el umbral superior. Finalmente, guarde el archivo con las células enmascaradas utilizando el comando de captura. Abra la imagen con las células enmascaradas en el editor gráfico de mapas de bits allí.

Invierta la escala de grises para la observación directa y ajuste la resolución a 300 PPP o más. La imagen RGB se guarda como un archivo TIF. El siguiente paso del análisis de imagen en vivo es de la microglía, por lo que se realiza una segmentación y un análisis morfológico para identificar el SATA destinado a la cuantificación del área.

Utilice un software capaz de realizar mediciones de intensidad y conteo de objetos basado en umbral. Abra el archivo TIFF con células segmentadas y seleccione la reescala spline para una resolución máxima y el canal rojo en blanco y negro para una mejor visualización. A continuación, calibre la imagen definiendo su diámetro horizontal como de 1,4 a 1,7 milímetros, dependiendo de la edad, para segmentar células individuales.

Por lo tanto MA, aplique umbralización de intensidad en el canal rojo. Abra la función de intensidad umbral bajo el comando de recuento de objetos y actualización de cuentas. Utilice esta función para rastrear parámetros bidimensionales para cada umbral de la región de interés que representa al individuo.

A continuación, defina el umbral de intensidad en el histograma de intensidad. Seleccione el 50 al 60 % más bajo de los 255 niveles y refine el valor final del umbral para las células individuales. Evalúe visualmente el solapamiento entre la máscara de color umbral en azul y el perímetro del soma celular en gris utilizando los controles de la barra de herramientas binaria o el catálogo de objetos.

Identifique manualmente las regiones somáticas de interés con múltiples células. Separe estos elementos delimitando las regiones de interés. Al hacerlo, utilice el conmutador para visualizar directamente las células mediante la restricción de área.

Clasifique las células microgliales como activadas si sus áreas somáticas son mayores a 50-60 micrones cuadrados. Clasifique la microglía como desactivada si tienen somas más pequeños.

Finalmente, verifique el proceso y compruebe la complejidad de ramificación en cada célula microglial activada superponiendo la máscara somática y la imagen de un único punto XY con el contraste aumentado en un 50 %. El protocolo descrito se utilizó para visualizar células microgliales a través de una amplia zona de la retina central. En ratones DBA/2J jóvenes heterocigotos que expresan CX3CR1-GFP, la alta resolución celular combinada con imágenes en vivo, umbralización y análisis morfométrico permitió la segmentación automática de células individuales positivas para GFP, discriminando así las células según su área. El modelo de ratones DBA/2J presenta glaucoma crónico y se les realizó imágenes mensualmente para monitorear el desarrollo de microgliosis local y la activación de microglía en edades previas a la neurodegeneración detectable, lo cual es consistente con la progresión variable de la neurodegeneración en ojos individuales. Este análisis reveló cambios en la activación de la microglía retinal y en la microgliosis a lo largo del tiempo.

El análisis también detectó cambios dinámicos en la densidad de microglía total y activada dentro de retinas individuales. La densidad poblacional de microglía no estuvo asociada a cambios en la densidad de células que expresan GFP, lo cual es consistente con otros hallazgos. Por lo tanto, el análisis mediante CSLO podría utilizarse como un indicador de la progresión temprana de la enfermedad.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar optimizar cuidadosamente los niveles de saturación de la imagen fluorescente de GFP más microglía, localizada en la retina interna, ya que la reproducibilidad de las imágenes de CSLO de la retina central, así como el detalle celular constante detectado a través de la retina central, depende críticamente de este paso tras su desarrollo. Este protocolo de imagenología en vivo se está aplicando en nuestro laboratorio para explorar verdaderamente la posible conexión entre los cambios tempranos en la microglía de la retina y del nervio óptico, y la progresión posterior del glaucoma en modelos DBA/2J y en otros modelos de degeneración retiniana crónica. Esta estrategia de imagenología en vivo también podría permitir la detección temprana de otras patologías crónicas que afectan la retina y el nervio óptico provocando degeneración, como la esclerosis múltiple, el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.