Análisis cuantitativo de los Defectos de escalada en un modelo de Drosophila de enfermedades neurodegenerativas

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la capacidad trepadora de las moscas de tipo salvaje y las moscas mutantes para los genes implicados en la locomoción. Esto se logra transfiriendo primero las moscas a un cilindro graduado de vidrio. El segundo paso es desplazar las moscas al fondo del cilindro golpeando ligeramente el cilindro sobre el acolchado de espuma.

Las siguientes moscas que cruzan la línea de meta se graban con una cámara de vídeo durante dos minutos. El paso final es analizar los videos y trazar el número de moscas por encima de la línea objetivo cada 10 segundos. En última instancia, el ensayo trepador se utiliza para identificar defectos en la capacidad trepadora de las líneas mutantes de moscas de la fruta.

La principal ventaja de esta técnica, o de las técnicas existentes, como el método salvaje, es que tiene la capacidad de detectar pequeñas diferencias en la capacidad de escalada. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los trastornos neurodegenerativos, como el papel de genes específicos en la paraplejia espástica hereditaria en el deterioro progresivo de la marcha. La implicación de esta técnica tiende hacia el desarrollo de la terapia.

IP para trastornos neurológicos, ya que proporciona un ensayo cuantitativo simple para probar la respuesta a medicamentos y mutantes para genes neurodegenerativos candidatos Comience anestesiando 20 moscas con dióxido de carbono y coloque todas las moscas en un frasco de recolección de 25 milímetros por 95 milímetros que contiene alimento. A continuación, guarde el vial que contiene las moscas horizontalmente en una bandeja de cartón para evitar que queden atrapadas en cualquier líquido que pueda acumularse en el fondo del vial. Coloque las moscas en una incubadora durante al menos 21 horas bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas a la mañana siguiente, configure el ensayo de escalada transfiriendo las moscas del vial a un cilindro graduado de vidrio de 250 mililitros y selle la parte superior con una película de cera para evitar el escape de moscas.

Realice el experimento con luz ambiental a 22 grados centígrados y 40% de humedad. Realiza siempre los experimentos a la misma hora del día para evitar confusiones con los ciclos de sueño. Además, marque la ubicación del cilindro en la mesa de trabajo para mantenerlo constante todos los días.

Cuente el número de moscas muertas en el fondo del cilindro y en los frascos de comida, anote este número como la mortalidad. A continuación, coloque la cámara de video en un trípode. Enfoca la cámara en la línea de 190 mililitros del cilindro graduado de 250 mililitros muy ligeramente.

Golpee el cilindro de cinco a 10 veces contra una almohadilla de espuma de celda cerrada con suficiente fuerza para desplazar las moscas a la superficie inferior interna. A continuación, utilice la otra mano para pulsar grabar en la cámara. A continuación, golpea el cilindro seis veces en un patrón no rítmico distintivo mientras la cámara está grabando.

Realice cada prueba durante dos minutos desde el momento en que se tocaron las moscas por última vez. Finalmente, deseche las moscas en etanol al 95%. Una vez finalizada la prueba, repita este ensayo de escalada 10 veces utilizando 20 moscas frescas cada vez para detectar pequeñas diferencias en la locomoción entre los grupos.

Lave los cilindros en un lavavajillas y séquelos durante la noche para reutilizarlos una vez que se haya completado el experimento para analizar el rendimiento de las moscas, comience viendo videos de cada registro de prueba de moscas. El número total de moscas que pasan por la línea objetivo cada 10 segundos. Si una mosca vuelve a bajar o cae, registre esa mosca como menos uno y cuente la siguiente mosca que cruce la línea objetivo como el mismo número que la mosca que volvió a bajar o cayó.

Por ejemplo, si la 15ª mosca cae por debajo de la línea objetivo, la siguiente mosca en cruzar la línea se considera la 15ª mosca y no la 16ª. A continuación, reste la mortalidad del número total de moscas para obtener el número de moscas que quedan en la parcela de ensayo. El porcentaje de moscas por encima de la línea objetivo en cada punto de tiempo cuando se trabaja con mutaciones severas, se pueden ver diferentes grados de defecto de escalada utilizando diferentes ensayos de escalada.

Aquí, se registró el número de moscas de ocho días de edad que treparon a la parte superior de un frasco de comida vacío después de 18 segundos, sin mostrar diferencias significativas en el comportamiento de escalada entre los dos grupos. Por otro lado, mediante el uso del ensayo de escalada de este protocolo, las moscas mutantes Bastin 17 dash seven over TM three muestran un déficit en el rendimiento en comparación con los controles. Dado que muchos trastornos locomotores son progresivos, es importante observar la evolución de las moscas a lo largo del tiempo.

A los dos días de edad, hay una diferencia significativa en el número de moscas que trepan por encima de la línea objetivo. En comparación con los controles. Este rendimiento de escalada continúa disminuyendo a medida que las moscas mutantes envejecen de dos a días.

Una vez dominado, este experimento y análisis se puede completar en tres horas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar los defectos locomotores en modelos de mutantes de dola para trastornos neurológicos.